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방법 논문

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

6.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56391

⸱

2018년 6월 1일

 ,  , 
1State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences

이 논문에서

요약

우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.

초록

배아 줄기 (ES) 세포 (endoderm, mesoderm, 또는 ectoderm), 3 개의 세균 층의 구분을 하 고 재생 의학에 대 한 많은 계보를 생성할 수 있습니다. ES 세포 문화에서 체 외에 는 오랫동안 광범위 한 관심사의 주제. 마우스 ES 세포 혈 청 및 백혈병 금지 요인 (LIF)에서 유지 관리 하는 고전적인,-포함 하는 매체. 그러나, 혈 청/LIF 조건 하에서 세포 형태학 및 pluripotency 관련 유전자의 식 프로 파일에서이 표시 하 고 준 상태에서 주로. 또한, 교양된 ES 세포 전시 글로벌 hypermethylation 하지만 순진한 ES 세포는 안 세포 질량 (ICM) 및 원시 생식 세포 (PGCs)의 글로벌 hypomethylation의 상태에 있습니다. ICM과 PGCs의 hypomethylated 상태 그들의 pluripotency와 밀접 하 게 연결 됩니다. 마우스 ES 세포 문화 방법 개선, 최근 DNA hypomethylated 만능 상태를 유지 하기 위해 두 개의 작은 분자 화합물의 선택적으로 결합 된 사용률을 기반 하는 새로운 방법을 개발 했습니다. 여기, 우리는 비타민 C (Vc)의 공동 치료를 제시 하 고 PD0325901 마우스 ES 세포에서 5 일에 5-methylcytosine (5mC)의 약 90%를 지울 수 있습니다. 생성 된 5mC 콘텐츠는 PGCs에 비교. 기계 조사 보여준다는 PD0325901 최대-조절 억제 Dnmt3b Prdm14 식 (de novo DNA methyltransferase) 및 Dnmt3l (Dnmt3b의 공동 인자), 드 노 보 5mC 합성을 감소 시켜. Vc는 모두 수동 및 활성 DNA demethylations의 참여를 나타내는 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) Tet1 및 Tet2에 의해 주로 촉매 변환 용이. 또한, Vc/PD0325901 조건에서 마우스 ES 세포 균질 형태학 및 만능 상태를 표시합니다. 샨 다, 우리 소설과 화학 시너지 문화 DNA hypomethylation 및 마우스 ES 세포의 pluripotency의 유지 보수를 달성 하기 위한 방법을 제안 합니다. 작은 분자 화학 종속 메서드 혈 청 문화, 그리고 균질 ES 세포 연구에 대 한 추가 임상 응용 프로그램 생성을 보유 약속의 주요 단점을 극복 했다.

서론

ES 세포 blastocyst1의 ICM에서 기인 된다. 셀은 pluripotency 상태에 있고 모든 계보 체세포와 생식 세포2형성할 수 있다. ES 세포의 설립 기회 개발 조사를 생체 외에서 처리 하 고 그들의 pluripotency3에 기반 하는 재생 의학에 대 한 의료 관련의 세포를 생성할 수 있습니다 제공 합니다.

두 그룹은 seminally 1981 년에 마우스 ES 세포 라인을 설립 하 고 소 태아 혈 청 (FBS)에 셀 초기 마우스 배아에서 파생 했다 경작 하는 때-급지대 레이어1,4로 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)와 매체를 포함 하 . MEFs mitotically 비활성화 했다 고 미리 이전에 ES 세포를 배양 접시에 성장 했다. MEFs는 마우스 ES 셀 첨부 파일에 대 한 지원을 제공 하 고 전파를 홍보 하 여 필수적인 영양 요소와 세포 증식에 대 한 호르몬을 제공 하는 FBS 차별화5억 누르다 성장 인자를 생산. 후속 연구 LIF 피더 세포에 의해 생성 했다 자기 갱신 및 마우스 ES 세포의 pluripotency의 유지 보수에 대 한 주요 cytokine 매체에 LIF의 추가 피더 세포6에 대 한 대체할 수 있는 표시. 현재, 지류에 FBS/LIF 매체에 마우스 ES 세포의 주 아직도 많은 연구자에 의해 채택 된 표준 방법입니다. 그러나,이 고아 한 문화 접근 몇 가지 문제가 발생합니다. 첫째, 피더 세포 분 비 과잉 통제 요인 및 병원 성 오염7을 발생할 수 있습니다. 혈 청에 포함 된 젤라틴과 요리 표면 및 LIF의 추가 코팅이 간섭을 유발 하지 않도록 매체 급지대 계층 셀 없이 마우스 ES 세포를 유지 하기 위한 대체 방법이 있습니다. 또한, 혈 청/LIF 조건 하에서 성장 하는 마우스 ES 세포 형태학이 세포 인구 및 pluripotency 관련 요인8식 수준 에서도 전시. 최근 연구 제안 조건 하에서 혈 청/LIF, (를 포함 하 여, Nanog, OCT4, SOX2) pluripotency 관련 핵심 전사 인자 LIF 및 WNT 신호; 통해 pluripotency 유지할 수 있습니다. 그러나, 특히, 그들은 또한 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF) 신호 차별화8트리거를 활성화 합니다. 핵 녹음 방송 요인의 상반 된 이중 작용으로 인해 마우스 ES 세포 혈 청에서 교양된 ICM을 닮은 끝났다 epiblast 상태8다른 유사한 두 개의 상호 인구의 구성 된이 현재. 또한, 마우스 ES 세포 혈 청에 자주 전시 글로벌 hypermethylation9, ICM과 PGCs 그들의 pluripotency9,10와 밀접 하 게 연결 되는 글로벌 hypomethylated 상태에 있는 반면.

마우스 ES 세포 배양을 위한 새로운 방법을 개발 하는 상당한 수요가 있다. 여러 가지 향상 된 프로토콜 200311 이후 설립 되었습니다 하지만 몇 가지 제한 사항 및 단점7계속. 2008 년 이후, 두 개의 작은 분자 kinase 억제제, PD0325901의 결합된 이용 (물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (MAPK)의 억제 물 extracellular 신호 통제 / 키 니 아 제 (ERK) (MEK)) 및 CHIR99021 (글 리 코겐 synthase의 억제제를 키 니 아 제 3 (GSK3)), 자란 마우스 ES 세포12대 한 N2B27 에 매체 LIF와 혈 청 하지 않고 새로운 관점 오픈 했습니다. 이 새로운 정의 된 매체 2 억제제 (2i)의 사용에 의해 특징입니다. 2i/LIF 매체에 경작 마우스 ES 세포는 세포 인구 및 pluripotency 요인의 표현에 더 균질. 또한, 2i/LIF 교양 마우스 ES 세포 전시 DNA hypomethylation 세계적으로 ICM 같은 셀9,13에 가깝다. 그럼에도 불구 하 고, 2i 문화는 그것의 단점이 있습니다. PD0325901 및 CHIR99021는 물에 용 해 일반적으로 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 해산-문화 매체에 그들을 추가 하려면 재고 솔루션을 기반으로. 연구는 그 장기 그리고 DMSO에 셀의 낮은 복용량 노출 세포 독성14이어질 수 있습니다.

우리 두 작은 분자 화합물을 활용 하는 여기, 마우스 ES 세포의 새로운 문화 방법을 개발 하 고. 새로운 문화 메서드 빠르게 DNA hypomethylation 홍보 Vc와 MEK 억제제 PD0325901를 결합 하 고 효과적으로 PGC의 유사한 수준에 임명 된 Vc/PD0325901 자란 프로토콜. Vc/PD0325901 추가 혈 청에 포함 된 매체에 마우스 ES 세포 형태학에 동질성을 전시 하 고 접지 상태에서 지속. 2i 문화에 비해, Vc/PD0325901 조건 하에서 경작 하는 마우스 ES 세포 DNA demethylation의 빠른 활동을 전시 하 고 PGC의 비교 hypomethylation 수준에 도달할 수 있습니다. 또한, 단일 억제제 (PD0325901)를 사용 하 여 2에서 사용에 비해 중간에 DMSO의 입력된 금액 감소 (PD0325901/CHIR99021) 셀에 피해를 감소 시킨다.

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프로토콜

1입니다. 준비

  1. 1.0 m m PD0325901의 솔루션 (MEK 억제제)와 3.0 m m CHIR99021 준비 (GSK3 억제제).
    1. PD0325901의 2 밀리 그램의 무게 고 호박색 유리 유리병에 DMSO의 4.15 mL를 추가 합니다.
    2. CHIR99021의 2 밀리 그램의 무게 고 호박색 유리 유리병에 DMSO의 1.43 mL를 추가 합니다.
    3. 다음 재구성,-20 ° C에서 aliquots (200 µ L PCR 튜브에 50 µ L/튜브)를 저장 하 고 빛 으로부터 보호. 냉장고를 사용 하기 전에 실내 온도에 녹여 냉동된 주식을 포함 하는 튜브를 제거 합니다.
  2. 원심 분리기 튜브의 1 mL에 Vc의 0.0176 g의 무게와 사용 하기 전에 100 m m의 최종 농도에 살 균 물의 1 mL와 함께 그것을 다시 구성 하기.
  3. FBS 비활성화: 500ml FBS의 30 분 동안 56 ° C에서 물 욕조에 품 어.
  4. 마우스 ES 세포 배양에 대 한 기본적인 매체의 600 mL를 준비 합니다.
    1. DMEM/높은 포도 당 매체 (500 mL)의 병을 사용 하 고 40 mL를 제거 합니다.
    2. DMEM/높은 포도 당 보통 20%의 보충 460 mL 비활성화 FBS (120 mL), 1000 U/mL LIF (107 U/mL 재고 솔루션의 60 µ L), 0.1 m m 비 본질적인 아미노산 (NEAA) (10 m m 재고 솔루션의 6 mL), 1 m m 나트륨 pyruvate (100 m m 재고 솔루션의 6 mL) 2 mM L-글루타민 (200 m m 재고 솔루션의 6 mL), 0.1 m m β-mercaptoethanol (100 m m 재고 솔루션의 600 µ L), 및 33 IU/mL 페니실린과 33 µ g/mL 스 (페니실린 스 솔루션 (10000 IU/mL 페니실린 및 10000 µ g/mL 스) 혼합의 2 개 mL) . 혈 청 매체 기본 매체를 정의 합니다.
    3. 플라스틱 PD0325901의 재고 솔루션의 50 µ L (1.0 m m) 및 Vc (100 m m), 혈 청 매체의 50 mL에 각각, (최종 농도: 1.0 µ M PD0325901 100 µ m Vc), Vc/PD0325901 매체 매체를 정의 하 고.
      참고: Vc의 불안정으로 인해 사용 하기 전에 Vc/PD0325901 중간 신선한을 준비 합니다.
    4. 피 펫을 사용 하 여 전송 PD0325901의 재고 솔루션의 50 µ L (1.0 m m) 및 CHIR99021 (3.0 m m), 혈 청 매체의 50 mL에 각각, (최종 농도: PD0325901 1.0 µ M 및 CHIR99021 3.0 µ M), 2i 매체로 매체를 정의 하 고.
  5. 젤라틴 코팅 요리를 준비 합니다.
    1. 0.1% 젤라틴 용액을 준비: 모자와 함께 유리 시 약 병에 초순의 300 mL에 젤라틴의 0.3 g을 분해 하 고 실내 온도에서 살 균 솔루션 20 분 저장소에 대 한 121 ° C에서 압력솥에 소독.
    2. 실 온에서 15 분 0.1% 젤라틴 용액 2 mL로 세포 문화 요리 (6cm 직경) incubate 고 젤라틴을 발음. 건조 한 공기에서 요리 하 고 그들을 사용 하 여 12 h 이내.
  6. 마우스 ES 세포 동결 15ml 원심 관에 매체의 10 mL를 준비: 90 %FBS (9 mL) 및 10 %DMSO (1 mL). 매체를 사용 하 여 1 일 이내.
  7. 냉동 컨테이너를 준비: 냉동 컨테이너의 급지를 100% 이소프로필 알코올을 추가 하 고 오래 된 이소프로필 알코올을 삭제. 모든 5 사용 후 직접 새로운 이소프로필 알코올을 추가 합니다.
  8. 효소 소화 버퍼 만들기: 무게 1.2114 g 100 mM Tris 솔루션을 준비 하 여 추가 초순의 100 mL로 트리 파우더의 pH 7.6 (집중된 HCl 솔루션의 약 0.6 mL)를 조정 하 트리 스 솔루션으로 HCl 솔루션 (약 12 M)를 집중.
  9. 라디오 immunoprecipitation 분석 결과 버퍼 (RIPA 버퍼) 50 mL를 준비: 20 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 150 m m NaCl, 20% 글리세롤, 0.5 %NP40, 1 mM EDTA, 1mm EGTA. 1mm DTT, 프로 테아 제 억제 물 칵테일, X 1과 1 m m와 보충 PMSF 사용 하기 전에. PMSF는 추가 되 면 30 분 이내 버퍼를 사용 합니다.

2. 젤라틴 코팅 요리에 마우스 ES 세포 성장

  1. 미리 따뜻한 마우스 ES 세포 (야생 타입, 129 SvEv) 문화 매체, 트립 신, 고 37 ° c.에 물 목욕에서 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS)
  2. 셀 통로 셀 린스를 요리 접시와 피 펫 2 mL PBS의에서 완전히 중간 발음
    1. 피 펫으로 PBS를 제거 하 고 2 mL의 PBS로 세포 세척.
    2. PBS를 제거 하 고 각 요리에 트립 신-EDTA (0.25%)의 0.3 mL를 추가 합니다.
    3. 트립 신으로 전체 요리를 신속 하 게 커버 하 고 즉시 제거.
    4. 접시에서 세포를 분리 하려면 1 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 넣어. 인큐베이터에서 요리를 꺼내와 trypsin의 작업 종료를 미리 데워 진된 혈 청 매체의 2 개 mL를 추가.
    5. 10 번 피 펫 (5 mL 피 펫 팁)와 resuspending에 의해 단일 셀 서 스 펜 션으로 셀 식민지를 분리.
  3. 새로운 젤라틴 코팅 접시에 셀 솔루션 (약 190000 세포는 hemocytometer를 계산 하 여)의 2 개 mL의 150 µ L를 전송 및 3 mL 6 cm 문화 접시 당 갓 만든된 Vc/PD0325901 매체의 보충. 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 세포 문화.
  4. 잠복기, 하는 동안 모든 24 시간 오래 된 문화 매체를 제거 하 고 2-3 일 후에 Vc 기대 70-80 %confluency 불안정으로 인해 문화 접시에 신선한 Vc/PD0325901-매체의 3 개 mL를 추가.
  5. 도달 후 70-80 %confluency, 세포를 통과 하 고 2.2-2.4 단계에 설명 된 대로 그들의 문화를 계속 합니다.

3. 고정 및 마우스 ES 세포를 녹여

  1. 마우스 ES 세포를 고정 합니다.
    1. 다음 단계 2.2 trypsin으로 요리에서 셀 분리 합니다.
    2. 15 mL 플라스틱 튜브와 3 분 800 x g 및 실 온에서 원심 분리기로 셀을 전송 합니다.
    3. 비 커에는 상쾌한 부드럽게 덤프 하 고 resuspend 셀 펠 릿의 1 mL와 함께 갓 어 중간 했다. 사용 하기 전에 실내 온도 인지 확인 하려면이 단계 전에 동결 중 30 분을 준비 합니다.
    4. 전송 매체 1 mL 피 펫 1.8 mL microcentrifuge 튜브에 세포 고 microcentrifuge 튜브 냉동 컨테이너 합니다. 냉동 컨테이너의 급지에 이소프로필 알코올을 추가 하 고 사용 하기 전에 실내 온도에 그것을 유지.
    5. -80 ° C 냉동 실에 냉동 컨테이너를 하룻밤 둡니다.
    6. 최대 2-3 년 동안 액체 질소 용기 microcentrifuge 튜브를 전송.
      참고: 오래 어 중간 하지 계속 셀 시간 고 셀 DMSO의 독성 때문에-80 ° C 냉동 고에 신속 하 게 전송.
  2. 마우스 ES 세포 녹여
    1. 전 37 ° C 물 욕조에 혈 청 매체의 50 mL 따뜻한.
    2. 액체 질소 용기에서 포함 하는 셀 유리병 밖으로가 고 출장된 유리병 37 ° C 물 욕조에 담가. 빨리 해 동 물 목욕에 흔들. 1 mL 피 펫 15 mL 튜브에 세포를 전송 합니다. 냉동 매체를 희석 하 여 다음 800 x g 및 3 분 동안 실 온에서 원심 관에 미리 데워 진된 혈 청 문화 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.
    3. 상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 5 mL 피 펫을 사용 하 여 신선한 Vc/PD0325901 매체의 3 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend.
    4. 젤라틴 코팅 접시에 15 mL 튜브에서 셀을 전송 하 고 문화 24 h. 문화에 대 한 셀 2 단계에에서 설명 된 대로 다시 셀.

4. 셀에서 총 단백질 추출

  1. 1 mL의 PBS로 수집 된 세포를 헹 구 고 800 x g 및 3 분 동안 실 온에서 원심.
  2. 상쾌한 발음 하 고 철저 하 게 부드럽게 pipetting DTT, 칵테일, protease 억제제와 PMSF 보완 RIPA 버퍼 셀 펠 릿을 resuspend. RIPA 버퍼의 볼륨은 약 5 x 셀의 작은.
    참고: 셀 물의 resuspension 얼음에 실시 합니다.
  3. RIPA 버퍼 얼음과 원심 분리기에서 13000 x g와 4 ° C 5 분 동안에 30 분에 셀을 계속.
  4. 새로운 튜브는 상쾌한 전송 및 저장할-80 ° c.에 aliquots
  5. Bradford 단백질 분석 실험 키트와 함께 단백질의 농도 결정 합니다.

5. 효소를 사용 하 여 단일 Nucleoside에 다이제스트 DNA를 세포 DNA 추출

  1. 단계 3.1.1 3.1.2에에서 설명 된 대로 trypsin으로 세포를 수집 합니다.
  2. DNA 추출 genomic DNA 정제 키트를 제조업체의 지침에 따라 수행 합니다.
  3. 1 mL 원심 분리기 튜브에서 추출 된 DNA를 저장 합니다. 원심 분리기 튜브에 초순의 100 µ L을 추가 하 고 약 15 배를 pipetting으로 DNA를 분해. 농도 결정 하 고 260에서 흡 광도의 측정에 의해 DNA의 품질 평가 nm 및 280 nm15. DNA 농도 약 500 ng / µ L.
  4. 50 µ L 솔루션 시스템에 DNA의 다이제스트 5 µ g: 100 mM Tris HCl 솔루션, pH 7.6의 5 µ L 추가 (최종 농도: 10 m m), 2 U 송아지 장 인산 가수분해 효소, 1 U DNase I, 0.005 U 뱀 독이 포스, 그리고 DNA의 5 µ g (는 measu에 따라 추가 볼륨을 계산 레드 DNA 농도, ~ 10 µ L) 원심 분리기 튜브 및 증가 초순 물으로 50 µ L 솔루션의 볼륨. 37 ° C에 혼합물을 밤새 품 어. 1000 g 및 튜브의 하단에는 솔루션을 수집 하는 1 분 동안 실 온에서 소화 DNA 솔루션 원심
  5. 원심 분리기 튜브에서 울트라 여과 튜브로 소화 DNA 솔루션을 전송 (분자량 컷오프: 3 kDa) 및 13000 g와 소화 효소를 제거 하려면 30 분 동안 4 ° C 원심 분리기.
  6. 5mC와 5hmC 분석에 대 한 샘플을 준비 합니다.
    1. 5hmC 분석: 피펫으로 36 µ L의 새로운 분리기를 필터 솔루션 (1 mL) 튜브 및 추가 4 µ L의 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5hmC) 3의 최종 농도 가진 nM.
    2. 5mC 분석: 5mC genomic DNA에서의 높은 밀도 인해 튜브 (50-fold 희석), 196 새로운 분리기 관으로 초순의 µ L를 피펫으로 4 µ L 필터 솔루션의 추가. 36 µ L 희석된 솔루션의 새로운 원심 분리기 튜브 전송과 4 µ L의 추가 (5'-(methyl-d3)-2'-deoxycytidine ([D3]-5mC) 50의 최종 농도 가진 nM. [D3]를 사용 하 여-5hmC [D3]-5mC 교정 5hmC 및 5mC, 각각에 내부 표준으로.
  7. 측정 튜브 샘플 솔루션 전송 및 4 ° c.에 저장 5mC 및 5hmC 다중 반응 모니터링 (UHPLC-MS/MS (MRM)) 이전 보고서15에 설명 된 대로 초 고성능 액체 착 색 인쇄기-트리플 4 극 자 질량 분석으로 분석 합니다.

6. 분석 5mC와 5hmC UHPLC-MS/MS15 를 사용 하 여

  1. 5mC와 5hmC를 분석 하기 위한 다양 한 매개 변수를 설정 UHPLC MS 소프트웨어를 사용 하 여.
    1. 새로운 메서드를 설정 합니다. 소프트웨어를 오픈 하 고 클릭 합니다 "파일 | 새로운 | 방법 "입니다. 전시 콘텐츠 "기가" 메시지 상자 "할 저장 하려는 현재 메서드에 대 한 변경" "아니오"를 클릭 합니다.
    2. 샘플러의 매개 변수를 구축 합니다. 클릭 "샘플러 | 설치 | 주입 "입니다. "표준 주입"를 선택 하 고 "주입 볼륨에서 5 µ L" 입력.
    3. UHPLC에서 펌프의 매개 변수를 구축 합니다.
      1. 클릭 "BinPump2 | 설치 "펌프의 매개 변수를 만들려고. "15 분"에서 "0.25 mL/min" 및 "중지 시간"에서 "흐름"을 설정 합니다.
      2. "5% 용 매 B" 설정 "최대 600 바"에서 "제한 압력"와.
      3. 클릭 "BinPump2 | 시간표 "차입 5mC 분석에 대 한 매개 변수는 isocratic를 구축 하 행을 추가 "추가"를 클릭 합니다. "시간"과 "B %"에서 "5.0"에서 "0.00" 입력. 한 번 더 새 행을 추가 하려면 "추가"를 클릭 합니다. "시간"과 "B %"에서 "5.0"에서 "15.00" 입력.
      4. 클릭 "BinPump2 | 시간표 "5hmC 분석에 대 한 그라데이션 차입 매개 변수를 구축 클릭 "행을 추가 하려면 추가. 시간 및 "B %" 5.0에서 0.00을 입력 합니다. 한 번 더 새 행을 추가 하려면 "추가"를 클릭 합니다. "시간"과 "B %"에서 "5.0"에서 "3.00" 입력. 6 행을 추가 하려면 다른 6 번에 대 한 "추가"를 클릭 합니다. 시퀀스에서 "시간"과 "B %"에서 "5.0"에서 "3.01" "시간"과 "15.0"에서 "B %", "시간"에서 "6.00"와 "B %"에서 "15.0", "6.01" "시간" 및 "100"에 "B %", "10.00" "시간"과 "100.0"에서 "B %", "시간"에서 "10.01"과 "B %"에서 "5.0", "15.00"를 입력 합니다.
        참고: 5mC와 UHPLC의 다른 분리 조건 때문에 개별적으로 5hmC의 분석을 수행 합니다.
    4. UHPLC에서 열 구획 (TCC)의 온도 매개 변수를 구축 합니다.
      클릭 "TCC | 설치 | 온도 (왼쪽) "" 30 ° C "를 입력 하 고.
    5. QQQ-MS/MS의 매개 변수를 설정 합니다.
      1. 클릭 "MS QQQ | 중지 시간 | 아니 제한/로 펌프"," 이온 소스 | ESI"," 시간 필터링 | 최대 폭: 0.07 분 ". 설정 "세그먼트 시간: 시작 시간: 0"; "스캔 유형: MRM"; "Div 값: Ms"; "델타 EMV (+): 200"와 "델타 EMV (-): 0".
      2. 5mC, D3의 전환 모니터링 매개 변수를 구축-5mC, dC, 5hmC, 및 D3-5hmC
        1. 클릭 "MS QQQ | 수집 | 세그먼트 검사: 연연: 90"; "Fragmentor: 90"; "충돌 에너지: 5"; "가속기 전압 셀: 4"와 "극성: 긍정적인".
        2. "복합 이름", "전조 이온", 5mC 분석을 위해 "제품 이온"에서 "126"에서 "242"에서 "5mC"를 입력 합니다. 오른쪽 버튼을 클릭 하 고 "행 추가" 새 행을 추가 하려면. 입력 "D3-5mC" "복합 이름", "전조 이온", D3에 대 한 "제품 이온"에서 "129"에 "245"에서-5mC 분석.
        3. 다른 동일한 모드를 사용 하 여 세 행을 보충 한다. "복합 이름", "전조 이온", dC 분석을 위해 "제품 이온"에서 "112"에서 "228"에서 "dC"를 입력 합니다. "복합 이름", "전조 이온", 5hmC 분석을 위해 "제품 이온"에서 "142"에서 "258"에서 "5hmC"를 입력 합니다. 입력 D3-5hmC 화합물 이름, "선구자 이온", D3에 대 한 "제품 이온"에서 "145"에서 "261"에서-5hmC 분석.
      3. 가스 소스 매개 변수를 구축 합니다. 클릭 "MS QQQ | 소스 | 매개 변수 소스: 가스 온도: 300 ℃ "; "가스 흐름: 11 L/분"; "분무기: 15 psi"; "긍정적인 모 세관: 3500 V".
      4. 제안된 된 방법을 저장 합니다. 클릭 "MS QQQ | 악기 | 저장 방법 ". "디렉토리"에 의해 제안된 된 방법에 대 한 경로 선택 하 고 입력 "방법"의 내용을 예 하 여 메서드에 대 한 이름을: 5mC와 5hmC 분석.
  2. UHPLC 분리 및 mononucleosides의 MS/MS 분석
    1. 준비 모바일 단계 5mC와 시 토 신 (C) 분석: 솔루션의 모바일 단계와 포 름 산의 500 µ L로 초순의 B. 솔루션 a: 500 mL (최종 농도: 0.1%), 그리고 100% 메탄올 솔루션 b: 500 mL. 모바일 단계 elute 5mC와 C (단계 6.1.3.3에서에서 설정)로 95:5 (v:)에 해결책 A와 B를 혼합. 0.25 mL/min (단계 6.1.3.1에서에서 설정)에 흐름 속도 설정 합니다.
    2. 5hmC 분석에 대 한 용 매 A와 B에 의해 모바일 단계를 준비 합니다. 용 매 A는 2.0 m m NH4HCO3 용액 (pH 9.0) (500 mL), 그리고 용 매 B 100% 메탄올 (500 mL). 최적화 된 그라데이션 차입에 의해 별도 5hmC: 0-3 분, 5.0% 및 95% (v: v); A 3-6 분, 15.0% 및 85% 6-10 분, 100 %B; 10-15 분, 5.0% 및 95 %A (단계 6.1.3.4에서에서 설정). 0.25 mL/min (단계 6.1.3.1에서에서 설정)에 흐름 속도 설정 합니다.
  3. 분석 하는 열에서 차입 고 긍정적인 이온 모드 (단계 6.1.5.2.1에서에서 설정)을 채택 MRM 모드 (단계 6.1.5.1에서에서 설정) 분무 MS/MS를 이용 한다.
    1. 전환 모니터링: 5mC, m/z 242→126 (충돌 에너지, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV); dC, m/z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (단계 6.1.5.2.2에서에서 설정).
    2. +3,500 V (단계 6.1.5.3에서에서 설정)에 모 세관 및 조각 전압을 설정 하 고 90 (설정 단계 6.1.5.2.1에서에서), 각각.
    3. 5 µ L에서 주입 볼륨을 설정 하 고 분석 하는 각 샘플 3 번 (6.1.2 단계에서 설정). 5mC와 5hmC의 양을 평가 하 해당 표준 곡선을 사용 합니다.
      1. 5mC의 표준 곡선 설정: 전송 1-50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, 최종 농도) 원심 분리기로 5mC의 표준 솔루션 튜브 및 추가 50 nM [D3]-튜브 5mC. 보충 50 µ L. 총 볼륨 5mC 샘플 (6 단계)에 대 한 지침에 따라 표준 5mC의 분석을 수행 합니다.
      2. 5hmC의 표준 곡선을 작성: 1-20 nM를 전송 (1, 2, 5, 10, 20 nM, 최종 농도) 원심 관 3을 추가 하는 5hmC의 표준 솔루션 nM [D3]-튜브를 5hmC. 보충 50 µ L. 총 볼륨 5hmC 샘플 (6 단계)에 대 한 지침에 따라 표준 5hmC의 분석을 수행 합니다.

7. 통계적 의미 분석

  1. 소프트웨어를 사용 하 여 통계 분석을 수행 합니다.
    1. 소프트웨어를 열고 "새 테이블 및 그래프"에서 "열"을 선택 합니다. 다음과 같이 매개 변수를 설정: "데이터를 견본 | 빈 데이터 테이블로 시작"; "그래프의 첫 번째 모드를 선택 하십시오"; "복제 또는 오차 막대 그래프 | 플롯 | SEM으로 의미 ".
    2. 클릭 "만들기"를 각각 "A"와 "B" 라인 제어 및 Vc/PD0325901-대우 그룹의 3 개의 복제를 입력 합니다. 6 데이터를 선택 하 고 "분석"에서 "분석"을 클릭 합니다.
    3. "열 분석"에서"t (시험과 비패라메트릭 테스트)"를 선택 하 고 "확인"을 입력 하는 다음 인터페이스를 클릭 합니다.
    4. 다음과 같이 매개 변수를 설정: "선택 테스트 | 테스트 이름 | 짝이 없는 t 테스트; 옵션 | 양측 "; "자신감을 간격: 95%"; "유효 자릿수 | 4 유효 자릿수 표시 ". 제어 및 Vc/PD0325901 치료 사이의 p 값을 얻으려면 "확인"을 클릭 합니다.
  2. 컨트롤 및 양측 고 짝이 없는 학생의 t채용 실험 그룹 간의 통계적 의미를 평가-16테스트.
    참고: p < 0.05 통계적 의미를 보유 하는 차이 나타냅니다. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001.

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결과

Vc/PD0325901 synergistically 마우스 ES 세포의 글로벌 삭제를 유도 한다. 혈 청에 마우스 ES 세포 pluripotent ICM 세포와 PGCs DNA 메 틸 화의 글로벌 삭제 표시 하 고 hypomethylated 상태가 그들의 pluripotency9,10에 밀접 하 게 연관 DNA hypermethylation 전시.

이전에 우리와 다른 Vc Tet 중재 5mC demethylation15,17를 향상 시킬 수 있습니다 발견. 한편, 2i 5mC 드 노 보 합성을 억제 하는 것도 발견 되었습니다. 이 발견의 맥...

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토론

작품, 우리 시연 Vc 및 PD0325901 vc DNA demethylation를 홍보 하 고 de novo DNA 억제 시너지 행동에 의해 달성 되었다는 undifferentiated 및 hypomethylated 상태에서 마우스 ES 세포를 유지 하기 위해 결합 하는 새로운 방법 메 틸 PD0325901입니다. 또한, 마우스 ES 세포 Vc/PD0325901 문화 시스템 아래 큰 형태를 보였다.

더 나은 마우스 ES 세포의 상태는 Vc/PD0325901 문화 시스템에서을 하려면 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, FBS 배치 해야 미리 발견 하 고 최고의 일괄; 재고 스크린 또한, 혈 청의 잦은 교체는 해로운 세포 증식 및 pluripotency의 유지 보수. 둘째, pipetting 셀에 셀 통로 단계에서 단일 세포 현 탁 액을 셀 식민지의 해리 하는 동안 하지 마십시오. 셋째, 세포 배양 중 trypsin의 부정적인 영향을 감소 하는 트립 신 제거...

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공개 사항

저자는 잠재적인 충돌의 관심을 공개.

감사의 글

이 작품은 국가 자연 과학 재단의 중국 (21435008 및 호우를 21327006), 그리고 과학의 중국 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 (호우에 XDB14030200).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소 태아 혈청 호주 출처Corning35-076-CV마우스 ES 세포 매체
DMEM/고포도HycloneSH30022마우스 ES 세포 매체
LIFMilliporeESG1107마우스 ES 세포 배지 구성 요소
비필수 아미노산(NEAA)Gibco11140050마우스 ES 세포 배지
나트륨 피루브산Gibco11360070마우스 ES 세포 매체
L-글루타민Gibco25030081마우스 ES 세포 매체
페니실린 스트렙토 마이신 용액Gibco15140122마우스 ES 세포 매체
구성 요소 PBS시그마P5493세포 린스
트립신HycloneSH30042세포 해리
젤라틴시그마48722접시 코팅
PD0325901Stemolecule04-0006-10세포 배양을 위한 저분자 화학물질
CHIR99021Stemolecule04-0004세포 배양을 위한 소분자 화학물질
비타민 CSinopharm 화학물질 시약 주식회사 세포 배양을 위한 XW00508171 저분자 화학물질
Ultra Bioscience 정수 시스템PurelabUltraUltra Water
DMSOSigmaD8418세포 동결 매체
원심분리기Eppendorf5427RDNA 및 단백질 추출
프로테아제 억제제 칵테일SigmaP8340RIPA 완충액
PMSF 프로테아제 억제제ThermoFisher Scientific36978RIPA 완충액
구성 요소 DTTSigma43815RIPA 완충
구성 요소 EGTASigmaE3889RIPA 완충액
구성 요소 게놈 DNA 정제 키트 PromegaA1125게놈 DNA 추출
NanoDrop 2000ThermoFisher ScientificNanoDrop 2000DNA 농도 측정
송아지 장 인산가수분해효소New England BiolabsM0290DNA 분해
DNase INew England BiolabsM0303DNA 분해
뱀 독 포스포디에스테라제 ISigmaP4506DNA 소화
Nanosep 3K OmegaPallOD003C35소화된 DNA
1290 UHPLC 시스템Agilent의 여과;1290UHPLC 분리
G6410B 삼중 사중극자 질량 분석기Agilent G6410BMS/MS 분석
Zorbax Eclipse Plus C18 컬럼Agilent Zorbax Eclipse Pluscolume for UHPLC separation
5-methylcytosineSolarbio 생명 과학SM8900 표준 5mC
5-하이드록시메틸시토신(표준)토론토 연구 화학 물질M295900표준 5hmC
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StemTAG 알칼리성 포스파타제 염색 및 활성 분석 키트세포 바이오랩, Inc.CBA-302  알칼리성 인산가수분해효소 염색 분석
마우스 ES 세포: WT, 129 SvEvGuoliang Xu 교수 제공(Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)마우스 ES 세포의 세포 균주
현미경ZeissLSM510세포 관찰
GraphPad Prism 5.0 GraphPad PrismSoftware Inc.5.0통계 분석
당 구성 요소의 구성 요소액

참고문헌

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