기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

요약

이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.

초록

Acellular 기질 준비 세포-매트릭스 상호 작용을 공부 하는 데 유용 하 고 재생 세포 치료 응용 프로그램을 용이 하 게. 여러 상업 기질 제품 hydrogels 또는 막, 사용할 수 있지만 이러한 조직 관련 생물 활성을가지고 있지 않습니다. 불가능 하기 때문에 관류 decellularization 일반적으로 인간의 심장 조직으로, 우리는 3 단계 집중 decellularization 프로세스를 개발 했다. 인간의 심근 조각 수술 중 조달 먼저 세제 무료 hyperosmolar 세포의 용 해 버퍼, 이온 세제, 나트륨 라우릴 황산 염와 부 화 다음으로 취급 되 고 과정의 본질적인 DNase 활동을 이용 하 여 완료 되 면 태아 둔감 한 혈 청입니다. 이 기술은 결과 심장 세포 외 매트릭스의 셀 무료 시트에 주로 섬유 조직 아키텍처 biopolymer 구성 유지는 심장 세포 인구를 pluripotent 줄기 특정 환경 단서를 제공 하기 위해 표시 했다 셀입니다. 심장 세포 외 기질 시트 다음 추가 추가 화학 수정 없이 microparticle 분말으로 처리 하거나 수, 단기 펩 신 소화를 통해와 자가 조립 심장 세포 외 기질 히드로로 보존 bioactivity입니다.

서론

세포 외 기질 (ECM) 뿐만 아니라 구조 지원 하지만 생물 학적 세포에 대 한 중요 및 조직 기능¹을 제공 합니다. 에, ECM 등 섬유 증, 염증, 신생, cardiomyocyte 수축 기능 및 생존 능력, 주민 조상 세포 운명 pathophysiologic 응답의 규칙에 참여합니다. 그것의 기본 구성 요소-섬유 glycoproteins, 있다, proteoglycans-분 비 성장 인자, cytokines, 및 포함 하는 핵 산 및 단백질^2,3막 소포를 포함 합니다.

그것은 최근에 분명 acellular ECM 준비 하지만 공부 뿐만 아니라 잠재적인 치료 셀 기반 응용 프로그램에 대 한 세포-매트릭스 상호 작용에 대 한 귀중 한 되고있다. 치료 셀 제품 또는 설계 조직에 적절 한 환경을 제공의 중요성은 이제 널리 인정 했다. 정의 된 biopolymeric hydrogels^4,,56 또는 단백질 칵테일 murine 육 종 세포 (즉, Matrigel, Geltrex)에 의해 분 비 세포 현 탁 액 또는 활성 화합물을 결합 하려는 시도가 되었습니다. ^{그러나 7}., 전 bioactivity 제한, 후자는 GMP 급 프로세스에 문제가 및 둘 다 부족 심장 ECM (cECM)^8,,910, 의 조직-특정 bioactivity ^11,,1213.

심근의 decellularization 이전 관상 맥 관 구조^14,15통해 전체 심장의 관류에 의해 수행 되었습니다. 그러나이 동물 마음에 가능한, 그대로 인간 심 혼 거의 사용할 수 있습니다. 따라서, 수술 실에서 얻은 조직 샘플 처리에 대 한 허용 하는 집중 과정 선호 했다. 우리의 "3 단계" 프로토콜 포함 되어 있습니다 3 별도 인큐베이션 단계 즉 세포, 가용 화, 및 DNA 제거. 그것은 크게 보존된 단백질과 glycosaminoglycan 구성^16,17와 인간 심근 ECM을 생성합니다. 이러한 cECM 슬라이스 체 외에서 세포-매트릭스 상호 작용의 연구에 대 한 허용 하지만 제대로 잠재적인 인간 규모 치료 응용 프로그램에 적합. 제조 프로세스는 동결 건조 된 cECM 미 또는 cECM 하이드로 겔¹⁸다음 확장 되었다.

이 프로토콜은 심근 세포 외 기질 (ECM) 및 그들의 생물 학적 활동의 주요 구성 요소를 보존 하는 수술 샘플에서 얻은 인간 심근의 decellularization에 대 한 수 있습니다. 보존된 조직-특정 bioactivity와 인간의 심장 ECM는 세포-매트릭스 상호 작용의 실험 연구에 필요한 또는 심근 재생 세포 기반 접근 방법에 대 한 적합 한 환경이 필요한 경우,이 프로토콜에 것이 좋습니다. 원칙적으로, 그것은 또한이 프로토콜 GMP 급 조건에 적응할 수 있도록 처리 된 cECM의 사용 가능한 미래에 치료 응용 해야.

프로토콜

연구 프로토콜은 헬싱키의 선언에 명시 된 윤리 원칙을 준수 하 고 Charité 의과대학의 제도적 검토 보드 및 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 제공 하는 모든 환자, 실험 연구에 대 한 심 혼 직물의 사용에 대 한 동의 작성.

1입니다. 단면에 대 한 인간의 심근의 준비

1. 왼쪽된 심 실 심근을 얻기 (크기는 수술의 종류에 따라 다릅니다) 수술 실 무 균 용기에 차가운 PBS의 교통에서 직접.
2. 무 균 조건 하에서 10 번 블레이드와 살 균 메스와 모든 지방 조직을 제거 합니다.
3. 약 1 x 1 x 1 cm의 메스를 사용 하 여 큐브에서 심근을 잘라.
4. 살 균 50 mL 튜브에 큐브를 놓습니다.
   참고: 일시 중지, 수행 단계 1.5, 그렇지 않으면 계속 단계 2.2. 단백질 저하와 조직 품질 저하를 방지 하기 위해 반복된 freeze-thaw 주기를 하지 마십시오.
5. -80 ° c.에 큐브를 포함 하는 튜브를 저장 조직 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.

2. 조각으로 심근 큐브의 단면

1. 냉동 실에서 준비 큐브를 포함 하는 tube(s)를 가져가 라.
2. cryostat 얼음에 전송 합니다.
3. 개체와 챔버 온도-15 ° c.를 설정
   참고: 적당 한 온도 완벽 한 단면을 보장 하기 위해 중요 한.
4. 진정 빈 50 mL 튜브와 우표 챔버 또는 드라이 아이스.
5. 레이어를 추가 (약 0.5-1.0 mL) 차가운 스탬프 및 하자에 cryosection 매체의 그것 백색 이며 단단한 때까지 동결.
6. Cryosection 매체의 두 번째 레이어를 추가 하 고이 계층에 심근 큐브를 놓습니다.
7. Cryosection 매체와 심근 계속 하기 전에 완전 하 게 고정 되어 있는지 확인 합니다.
   참고: 샘플 및 cryosection 매체 동결 되지는 구분 될 것입니다 장애인. 완전히 언된 cryosection 매체에서으로 바뀝니다 유연 하 고 투명 한 고체, 백색, 그리고 불투명. 심근 큐브 완전히 동결 단계 1.4에서에서 즉시 계속 하는 경우 h 1까지 적어도 30 분 필요 합니다. 조직 고정 면 핀셋으로 감동/처리 하지 변형 한다.
8. 홀더에 냉동된 심근으로 스탬프를 삽입 하 고 모든 나사를 조입니다.
9. 심지어 단면 표면 얻을 때까지 조직의 표면 손질.
10. 300 µ m 두께 단면 설정 합니다.
11. 자동 구분 된 섹션 냉동된 심근입니다. 이 유니폼 컷된 섹션을 보장합니다. 약 30-40 섹션 한 큐브의 슬라이스 수 있다.
12. Precooled 50 mL 튜브에 느슨하게 단면 후 각 슬라이스를 놓습니다.
    참고: 누르지 마십시오 조각 또는 팩 단단히. 약 40 조각 1 개의 관에 들어갈 수 있습니다.
13. 채워진된 튜브를 닫고 얼음에.
    참고: 단계에 서 일시 중지 단계 3.2 계속 2.14, 그렇지 않으면.
14. -80 ° c.에 게 심근 조각 슬라이스는 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.

3입니다. 인간의 심근 조각 decellularization

1. -80 ° C 냉장고와 얼음에 전송 심근 섹션을 포함 하는 50 mL 튜브의 필요한 수를 가져가 라.
2. 한 메 마른 비 커에 단계 3.1에서에서 모든 50 mL 튜브의 냉동된 섹션을 전송. 약 40 조각은 비 커 50ml 튜브 당에 추가 됩니다. 비 커 세 번 50 mL 튜브;의 볼륨 해야 합니다. 예를 들어, decellularization 한 50 mL 튜브에 대 한 150 mL 비 커를 사용 합니다.
3. 50 mL 50 mL 튜브 심근 조각 당 세포 솔루션 (10 mM Tris, 0.1 w/v %EDTA, pH 7.4 H₂O)를 추가 합니다.
4. 실 온에서 2 h에 대 한 지속적으로 100-150 rpm에서 메 마른 비 커에 흔들어 심근 조각.
5. 거친 스 트레이너를 통해 조직의 조각으로 액체를 스트레인. 새로운 살 균 비 커에 무딘 족집게와 조직 조각을 전송 합니다. PBS에서 심근 조각 (예를 들어, 사용 100 mL SDS 솔루션 두 50 mL 튜브 심근 섹션의 decellularized 되는 때)의 초기 50 mL 튜브 당 0.5 %SDS 50 mL를 추가 합니다.
6. 실 온에서 100-150 rpm에서 6 h에 대 한 지속적으로 흔들.
7. 거친 스 트레이너를 통해 조직의 조각으로 액체를 스트레인. 새로운 살 균 비 커에 무딘 족집게와 조직 조각을 전송 하 고 150 rpm에서 떨고 있는 동안 10 분 각 50 mL PBS로 3 회 세척. 다음, 1% 페니실린/스와 1 %PBS 하룻밤 씻어 Nystatin (PBS-P/S-N) 100-150 rpm, 4 ° C 동요 하는 동안에.
   참고: 철저 한 세척은 완전히 제거 하는 어떤 잔여 SDS 중요 합니다. SDS의 남은 흔적 ECM 셀과 함께에서 사용 될 때 독성이 있다.
8. 세척 솔루션 제거 및 추가 25 mL 1% 페니실린/스와 1 %FBS (37 ° C)를 미리 데워 Nystatin 심근 조각의 초기 50 mL 튜브 당 decellularized 조각에.
9. 37 ° c.에 3 h에 대 한 품 어 이 단계에서는 모든 나머지 DNA는 FBS의 본질적인 DNase 활동으로 인해 매트릭스에서 제거 됩니다.
10. 새로운 살 균 비 커에 슬라이스를 전송 하 고 150 rpm에서 떨고 있는 동안 10 분 각 50 mL PBS로 3 회 세척.
    참고: ECM 조각은 저장할 수 있습니다 PBS-P/S-n에서 4 ° C에서 몇 일 동안. 그러나, 즉시 진행 하는 것이 좋습니다.

4. 처리 한 분말 Decellularized cECM

1. 새로운 살 균 6 잘 플레이트에 느슨하게 ECM 슬라이스를 놓습니다. -80 ° C에 ECM을 고정 하 고는 lyophilizer에서 2 일 동안 lyophilize.
   참고: 둘 이상의 슬라이스는 잘 당 놓일 수 있다. 우물의 표면 표지에 분할 영역을 정렬 합니다. 겹치는 슬라이스 후속 분쇄 성공에는 영향이 없습니다.
2. ECM 조각 분쇄에 대 한 사용 하 여 특정 밀링 ( 재료의 표참조) 포함 1.4 m m 세라믹 구슬 튜브합니다. 무딘 멸 균 핀셋을 사용 하 여 동결 건조 된 ECM으로 느슨하게 튜브를 채우십시오. 최적의 결과 대 한 10-20 밀리 그램 사이 ECM의 총 무게는 것이 좋습니다.
   참고: ECM 밀링 튜브에 너무 밀접 하 게 포장 하는 경우 분쇄 과정은 부정적인 영향을.
3. 스냅-동결 튜브에 액체 질소.
   주의:: 액체 질소는 매우 낮은 온도, 적절 한 개인 보호를 착용.
4. 밀링 기계에 냉동된 튜브를 삽입 하 고 ECM을 격파.
   1. 30의 기간 설정 s와 최대 속도 장치 시작.
   2. 마친 후, 튜브를 꺼내와 스냅-동결 다시 액체 질소.
   3. 5 회 반복 한다.
5. 1 mL ddH₂O 당 관 및 쉐이크 또는 완전 한 solubilizing 대 한 소용돌이 추가 하 여 튜브에서 미를 씻어. 50 mL 튜브에 200 µ m 메쉬를 통해 이기종 솔루션을 필터링 합니다.
6. -80 ° C 또는 액체 질소에 튜브를 고정 합니다.
7. 튜브의 표준 뚜껑을 0.22 μ m 필터 바꿉니다. 이 필터 뚜껑 튜브에서 흐르는 분말을 방지 하지만 물 증발에 대 한 공기 순환을 허용 한다.
8. lyophilizer에 튜브를 삽입 하 고 다시 단계 (단계 4.5)에서 물을 제거 하 lyophilize
   참고:이 단계에서 동결은 최대 3 일 걸릴 수 있습니다.
9. 추가 처리까지-80 ° C에서 분말을 저장 하거나 단계 5.1 계속.

5. 효소 기반 Homogenizing cECM 마이크로 입자의

1. 1 mg/mL의 농도를 0.01 M HCl (pH 2.0)에 돼지 펩 신을 디졸브. 완전히 용 해 될 때까지 실 온에서 회전 통에 놓습니다.
2. 10 mg/mL의 최종 농도에 펩 신 솔루션에서 동결 건조 된 인간의 ECM 분말 (단계 4.8)을 분해. Pipetting 통해 철저 하 게 혼합. 총 볼륨 필요한 ECM 솔루션의 금액에 따라 달라 집니다. 예를 들어 10mg 1 mL 펩 신 솔루션에서 ECM 분말의 분해.
   참고: 입자를 녹이는 부드러운 vortexing (1000-1500 RPM)를 통해 지원 수 있습니다. 미의 덩어리를 나머지 소화에 부정적인 영향을 줍니다.
3. 솔루션 2 mL 튜브 튜브 당 1 mL의 볼륨을 전송.
4. 48 h 27 ° C에서와 1200 rpm에 대 한 튜브 통에 튜브를 놓습니다.
5. 뿌리에서 튜브를가지고 고 얼음 또는 사전 냉각된 튜브 홀더에 놓습니다.
6. 믹스 1/9 ECM 솔루션의 볼륨의 콜드 10 x PBS (pH 7.4) 감기 0.1 m M의 ECM 솔루션의 볼륨의 1/10의 NaOH는 precooled와 얼음에 장소. 이 혼합 소화 ECM 솔루션을 무력화 하 고 irreversibly는 펩 신을 비활성화 합니다.
7. 중립화 혼합물 및 pipetting 또는 vortexing를 통해 철저 하 게 혼합에 ECM 솔루션을 추가 합니다.
8. 1 x PBS (pH 7.4)와 원하는 농도에 ECM을 설정 합니다. 솔루션의 산도 pH 종이 함께 확인할 수 있습니다.
   참고: 10 mL에 대 한 예제 계산 소화 ECM 솔루션:
   10 ml HCl (pH 2.0) 10mg 돼지 펩 신을 추가 합니다.
   펩 신 솔루션 100 mg ECM 파우더를 추가 합니다.
   참고: 10 mL를 중화에 대 한 예제 계산 소화 ECM 솔루션 및 8 mg/ml 농도 설정:
   집_최종 c_시작 x Vol_시작 = / c_최종 10 mg/mL x 10 mL/8 mg/mL = = 12.5 mL
   권_10xPBS 권_시작 = / 9 = 1/9 10 mL = 1.11 10 x PBS에서
   집_NaOH = 집_시작 / 10 = 1/10 10 mL = 1 mL에서
   권_1xPBS 권_최종 -집_시작 -집_10xPBS -집_NaOH = = 12.5 mL-10 mL-.11 1 mL = 0.39 mL

결과

인간의 심근의 decellularization에 대 한 3 단계 프로토콜 여기 키 ECM 구성 요소와 ECM의 원 구조를 유지 하면서 세포 소재의 가까운 완전 한 제거 결과 제시. Decellularization, 후 조직에서 세포의 총 제거 색깔 (그림 1A)에 있는 변화에 의해 분명 하다. H & E와 Masson Trichrome 얼룩으로 조직학 분석 잔여 그대로 셀 (그림 1B)의 완전 한 부재를 공개 했다. ECM의 개별 구성 요소에 대 한 양적 분석 SDS 혼자 (그림 2A)에 의해 decellularization에 비해 서 더 완전 한 DNA 제거 및 총 콜라겐, 엘라 스 틴, 및 있다의 더 나은 보존을 공개 했다. CECM의 생물 학적 활동의 기능 증거는

토론

다음을 달성 하는 목표는 인간의 심근 ECM를 준비할 때: 관련 된 면역성 세포 소재, ECM 무결성 및 bioactivity, 불 임, GMP 공정 호환성, 최종 제품의 비 독성의 보존의 제거 및 처리 측면에서 특정된 응용 프로그램에 대 한 제품의 적합성. 미 또는 자가 조립 히드로 처리 된 우리의 3 단계 decellularization 프로토콜을 결합 하 여 인간의 심장 ECM 소재 얻은 특정 생물 학적 활동을 보유 하 고, 처리 하 고, 쉽게에 대 한 가능성이 있다 여러 응용 프로그램에서 체 외에서 고 vivo에서, 무슨 보였다 ECM 제품에 대 한 여러 동물 종^11,13,,2021에서 비슷합니다.

심근 직물의 초...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Balance	DR Precisa, Dietikon, Switzerland	Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3	InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany	SK-10-004
Cell culture plates (6-well)	Greiner, Frickenhausen, Germany	657160
Cryostat CM	Leica, Wetzlar, Germany	3050S
EDTA	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml)	Greiner, Frickenhausen, Germany	616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml	Greiner, Frickenhausen, Germany	188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochrome, Berlin, Germany	S 0115
Freeze Dry System	Labconco, 캔자스시티, 미국	7670520
냉동고 (-80° C)	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Forma 900 Series
HCl	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	281.1
Microtome Blades Type 819	Leica, Wetzlar, Germany	14035838925
Minilys Homogeniser	PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany	91-PCSM
NaOH	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	K021.1
Nystatin	PAN Biotech, Aidenbach, Germany	P06-07800
PBS	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	14190-094
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, 다름슈타트, 독일	15140122
Pepsin	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm	Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, 독일	91-PCS-CK14
Rotamax 120 플레이트 셰이커	Heidolph, Schwabach, Germany	544-41200-00
SDS	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	CN30.3
실체 현미경	Leica, Wetzlar, Germany	M125
Steriflip-GP, 0,22 µ m	Merck Millipore, 다름슈타트, 독일	SCGP00525
스튜어트 아날로그 로커 및 롤러 믹서	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound	Hartenstein, Wurzburg, Germany	TTEK
Transfusion set 200µ m	Sarstedt, Nü mbrecht, Germany	798.200.500
TRIS	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm	Medical Highlights, Rohrdorf, Germany	CV102-003
Vortex-Genie2	Scientific Industry, New York, Germany	SI-0256