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방법 논문

Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34+ 세포

19.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56420

⸱

2017년 12월 27일

 ,  ,  , 
1Haematology Research Unit, St George and Sutherland Clinical School, University of New South Wales, 2Haematology Department, St George and Sutherland Hospitals

이 논문에서

요약

매우 순수한 인구의 없으며 코드에서 얻어질 수 있다 혈액 유래 CD34+ 세포. CD34 방법+ 셀 고립과 megakaryocyte 차별화는 여기에 설명 된.

초록

혈소판 생산 thrombopoiesis로 알려진 프로세스에서 골 수에서 주로 발생 합니다. Thrombopoiesis, 동안 조 혈 조상 세포 형태 혈소판 선구자 라는 없으며, 말기 출시 되 나 proplatelets 긴 세포질 프로세스에서 혈소판 분화를 구분 합니다. 없으며 희귀 세포 골 수에 국한 되며 따라서 실험실 사용을 위해 충분 한 숫자에 수확 하기가. 인간의 없으며의 효율적인 생산 수 달성 생체 외에서 CD34 경작+ 적당 한 조건 하에서 세포. 여기서 설명 하는 프로토콜 CD34의 격리에 설명 합니다+ 탯 줄 혈액 샘플에서 정렬 하는 자기 셀에 의해 세포. 매우 순수 하 고, 성숙한 없으며 혈 청 무료 조건 하에서 생산 하는 필요한 단계를 설명 합니다. Megakaryocyte 차별화의 phenotypic 분석 및 proplatelet 형성 및 혈소판 생산의 결정도 제공 됩니다. 이펙터 megakaryocyte 차별화 및 항 혈소판 항 체 등 thrombopoietin mimetics proplatelet 형성에 영향을 주는 생물 학적 기능 검사 경작된 한 세포에 추가할 수 있습니다.

서론

일반 실험실 사용에 대 한 기본 인간의 없으며 (MK)의 충분 한 숫자의 절연은 ~0.01% nucleated 세포1의 담당 그들은 골 수에서 낮은 주파수로 인해 가능 합니다. 편리한 대안 ex vivo 확장 및 조 혈 줄기와 조상 세포 특정 성장 요인의 존재의 차별화 이다. Megakaryocytic 문화에 대 한 가장 효과적인 성장과 차별화 요소는 MKs. Thrombopoietin (TPO) 생산 문화 시스템에서 고용 cytokines 줄기 세포 요소 (SCF; c-kit ligand), IL-11 및 인터 루 킨 (IL)-3 등의 숫자 되었습니다. 혼자 또는 다른 cytokines, SCF 및 IL-32등 효과적 이다. TPO 확산 MKs2의 성숙에 결과 줄기 세포 인구에 작동할 수 있다.

Proplatelets 라는 세포질 돌출부에서 MK 생산 혈소판, vivo에서, 약 1 x 1011 혈소판은 최대 1000는 150-400 x 109/L. 혈소판 생산에서 생체 외에서 혈소판 수를 유지 하기 위해 매일 형성 -배는 vivo에서 견적3, 그리고이 에겐 CD34를 사용 하 여 여러 문화 조건 보다 낮은+ MK와 혈소판 생산에서 체 외에서개선 하기 위해 조 혈 조상 세포. CD34의 초기 소스+ 세포 MK 차별화 사용 했다 인간 주변 혈액4. 다른 셀 소스 등이 골5,6, 배아 줄기 세포/유도 만능 줄기 세포 (ESC/iPSC)7, 탯 줄 혈액 (UCB)8,9,10 . 인간의 골 CD34+ 11 와 마우스 리니지 부정적인 골 수 세포5 생산 MK와 혈소판 시험관; 인간의 골의 가용성의 부족 CD34의 근원으로 그것의 사용을 제한 하는 그럼에도 불구 하 고,+ 세포. 대조적으로, ESC, iPSC 생체 외에서 혈소판 생산을 위한 세포의 무제한 소스를 나타냅니다. 이 세포에서 혈소판 생산 murine OP9 셀 등 오랜 문화 피더 세포를 필요합니다. 급지대 무료 조건에서 파생 된 혈소판 기능 덜12나타납니다. iPSC 파생 혈소판 때문에 그들은 큰 규모로 확장 될 수 있다 임상 설정에 사용 될 가능성이 있다. 이 프로세스에서는 녹음 방송 요인과 장기 세포 문화13lentiviral 중재 변환 합니다.

UCB는 CD34의 액세스할 수 있는 소스+ 세포에 쉽게 사용할 수 있는 설정 연구. TPO 혼자 코드의 차별화를 홍보할 수 있는 혈액 유래 CD34+ 세포와이 생겨나게 혈 청 보충 또는 급지대 셀과 공동 문화에 대 한 필요 없이 매우 순수 하 고, 성숙한 MKs. 다른 cytokines SCF UCB CD34에서 차별화를 저하 될 수 있습니다와 같은+ 세포, Flt 3 ligand 그리고 IL-11 미 숙 없으며14의 생산을 촉진 하는 동안. 이 프로토콜에 설명 합니다 매우 순수한 MK 문화 코드 혈액 CD34에서에서+ 의 생산 세럼 무료 조건에서 세포.

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프로토콜

이 프로토콜 남쪽 동부 쪽 시드니 인간의 연구 윤리 위원회에 의해 승인 하 고 대학의 뉴 사우스 웨일즈의 인간 연구 윤리 위원회에 의해 비준 되었다. 탯 줄 혈액 건강 한 기증자 로부터 얻은 의해 시드니 코드 혈액 은행 (시드니, NSW, 호주)를 제공 했다. 볼륨 약 100 mL의이 절차를 위해 사용 되었다.

참고: 클래스 II biosafety 무 균 기술을 사용 하 여 캐비닛에서 작동 합니다. 70% 에탄올과 코드 혈액 주머니의 외부 오염을 (가 위, 핀셋) 불 임 악기를 사용 하 여이 절차에 대 한.

1. 탯 줄 혈액 세포 준비 및 절연 CD34의+ 세포

  1. 살 균 분리 버퍼 (SB) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), pH 7.2, 그리고 포함 된 0.5% 소 혈 청 알 부 민 및 2 mM EDTA를 준비 합니다.
  2. (혈액 10 mL 당 1 개의 관은 필요) 50 mL 원뿔 관으로 SB의 10 mL를 분배. 10 mL 주사기에 장착 G18 무딘 바늘을 사용 하 여, 혈액 10 mL 가방에서 그리고 포함 하는 SB의 10 mL 50 mL 튜브로 분배.
  3. 두 개의 레이어를 만드는 희석된 혈액을 포함 하는 관의 바닥에 림프 구 분리 미디어 ( 재료의 표참조)의 15 mL를 추가 합니다.
    참고: 다른 레이어를 혼합 하지 마십시오 튜브의 하단에 천천히 미디어 분배.
  4. 휴식 및 가속 없이 실 온 (RT)에서 30 분 동안 1200 × g에서 튜브를 원심.
  5. 단 세포 (각 관에서 약 5-10 mL) 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 새로운 50 mL 튜브에 들어 있는 튜브의 중앙 레이어를 전송 합니다. SB 각 관 50 mL의 총 볼륨을 추가 합니다.
  6. 실시간 삭제에서 10 분 동안 400 × g에서 원심은 상쾌한.
  7. Resuspend 셀 펠 릿 하고있다 결합의 5-10 mL에 파스퇴르 피 펫으로 신중 하 게 정지 세포와 볼륨 50 mL SB와 함께.
  8. 수 셀 Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer를를 사용 하 여 또는 자동 세포 카운터 ( 재료의 표참조). CD34의 비율을 확인 하려면+ 세포 샘플, resuspend 2.5 × 105 셀 SB와 얼룩의 100 µ L에 4 ° c.에 15-30 분에 대 한 안티-CD34-PE 항 체의 10 µ L을 추가 하 여 Cytometry (그림 1A) 분석.
  9. 4 ° c.에서 10 분 동안 400 × g에서 원심 분리기 튜브 상쾌한을 삭제 합니다.
    참고: 하지 않을 경우 즉시 필요한, 단 세포가이 단계에서 동결 수 있습니다.
  10. 108 셀 당 SB의 300 µ L 셀 resuspend FcR 인간 IgG의 100 µ L를 추가 (차단 시 약, 재료의 표참조) 및 100 µ L 108 셀 당 CD34 자석 구슬의. 부드럽게 혼합 하 고 30-40 분 동안 4 ° C에서 품 어.
    참고: 단일 셀 서 스 펜 션은 필수 (필요한 경우 통과 셀 30 µ m 필터 시 약을 추가 하기 전에). 또는 그이 하 108 셀에 대 한 여기에 설명 된 시 볼륨을 사용 합니다. 10 이상8 셀에 대 한 시 약 (SB, 솔루션, 그리고 CD34 자석 구슬 차단)를 따라 확장할.
  11. LS 분리 열 인큐베이션 기간 동안 준비 하 여 마그네틱 홀더에서 LS 열을 배치 하 고 유출 하고있다 삭제의 3 mL로 세척.
    참고: LS 분리 열 최대 2 × 108 총 셀으로 로드할 수 있습니다. 작고 큰 열 사용할 수 있습니다.
  12. 5-10 mL SB의 셀 혼합물에 추가 하 고 400 × g에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 삭제는 상쾌한.
  13. Resuspend 1.5 ml SB의 세포 및 세포 현 탁 액 (1.5 mL) LS 열에 로드 합니다. 레이블이 없는 셀 15 mL 컬렉션 튜브 (부정적인 분수 #1)에 포함 된을 통해 흐름을 수집 합니다. 액체 드레인과 1.5 mL SB의 열을 씻어 보자.
  14. (3 mL)를 통해 수집 된 흐름 열에 다시 로드 하 고 동일한 15 mL 컬렉션 튜브 (부정적인 분수 #1)을 통해 흐름을 수집. 3 번 3 mL SB와 LS 열 세척.
    참고: 필요한 경우 셀 부정적인 분수 (12 mL)에 얼룩이 질 수 있다 안티 CD34 항 체 확인 CD34의 캡처로+ LS 열에 의해 세포.
  15. 마그네틱 구분 기호에서 열을 제거 하 고 2 mL SB의 새로운 15 mL 튜브에 주사기 플런저를 천천히 세포를 플러시.
  16. 다시 열에 자석 분리기 및 로드 셀의 2 mL에 다시 열을 놓습니다. 통해 흐름을 수집 하 고 2 mL SB로 씻어. 이것은 부정적인 분수 #2 (4 mL) 이다.
  17. 자석 분리기에서 LS 열을 제거 하 고는 CD34 수집 주사기 플런저와 꾸준히 고 단단히 하고있다 플러시 세포의 2 개 mL를 추가+ 셀 분수. Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
  18. 4 ° c.에 15 분 동안 400 × g에서 긍정적인 분수와 함께 원심 분리기 튜브 폐기는 상쾌한. CD34에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 셀 resuspend+ 셀 (SFM, 재료의 표참조).
    참고: 하지 않을 경우 즉시 필요한, 셀 수 있는 동결 액체 질소에이 단계에서.

2. 순도 확인 격리 된 CD34의+ 세포

  1. 10 µ L 안티-CD34-PE 항 체와 20 µ L 안티-CD45-PerCP 항 체 4 ° C (사용 별도 튜브 isotype 컨트롤)에서 15 분에 대 한 긍정적인 분수에서 2 × 104 셀을 얼룩 (그림 1B).
  2. 씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 400 × g에서 원심 SB의 200 µ L 펠 릿 Resuspend.
  3. 흐름 cytometric 분석을 수행 하 고 파편 (그림 1B)을 제외 하도록 라이브 셀 인구 게이트. PE 및 PerCP isotype 컨트롤 (그림 1B)를 사용 하 여 PE 및 PerCP 긍정적인 인구에 대 한 게이트를 설정 하 고 CD34의 비율 결정+/CD45+ 세포.

3. megakaryocyte 차별화

  1. 씨앗 5 × 105 셀/mL CD34+ 12-잘 접시에 잘 당 50 ng/mL 재조합 인간 thrombopoietin (rhTPO)와 보충 SFM의 2 mL에 세포. 37 ° C, 5% CO2 습도 분위기에서 세포를 품 어. 셀 confluent 경우 분석을 위해 필요한 전에 세포를 수확 하 고 신선한 미디어와 rhTPO 여러 우물으로 분할.
    참고: 두 개 또는 3 개의 우물 특별히 다른 시간 지점 (예를 들어, 7, 9, 10 일)에서 차별화를 모니터링 하는 준비 되어야 한다.
  2. 다른 우물에 셀을 방해 하지 않고 차별화를 모니터링을 마련해 우물에서 세포를 수확.
  3. 20 µ L 안티 GPIIb/CD41 FITC 항 체와 얼룩 세포와 10 µ L 안티-GPIX/CD42a-알 렉 사 Fluor 647 항 체 100 µ L. 마지막 볼륨에서 컨트롤 설정 각 isotype 제어 항 체를 사용 하 여 튜브. 4 ° c.에 15 30 분 동안 품 어
  4. 씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다.
10 분 삭제는 상쾌한 400 × g에서 centrifuge 고 cytometry로 하고있다 분석의 200-300 µ L에 펠 릿을 resuspend.
  • 각 fluorophore isotype 컨트롤 FITC와 알 렉 사 가루 647 긍정적인 인구 위한 게이팅 설정을 분석 합니다. CD41의 %를 확인 하려면 스테인드 세포 샘플을 분석+/CD42a+ 성숙 MK (그림 1C)을 대표 하는 긍정적인 셀을 두 번.
  • 세포의 현미경 시각화에 대 한 표면 마커 얼룩 세포 3.3에 설명 된 대로.
    1. 씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 400 × g에서 원심 분리기 Resuspend 100에서 펠 릿 SB 1000 x g 30 s. 공기 건조, 메탄올에 담그고 여 슬라이드에서 5 분 수정 셀에 유리 슬라이드에 스핀의 µ L 추가 20 µ L DAPI 포함 된 미디어를 탑재 ( 재료의 표참조) 는 coverslip로 커버 하 고 형광 현미경 (그림 2A)를 사용 하 여 시각화.
  • 세포내 항 원의 시각화, PBS에 셀 resuspend 및 paraformaldehyde (1% 최종 농도) 실 온에서 15 분으로 수정. 세포를 permeabilize, 트리톤-X 100 (0.1%)를 추가 하 고 PBS/0.1% 트리톤 X 100 2 mL와 함께 15 분 세척 셀에 품 어. PBS/0.1% 트리톤 X 100의 100 µ L에서 resuspend, vWf 및 안티 CD62p 항 체 (1: 200 희석) 안티 추가 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.
    1. 2 mL PBS/0.1% 트리톤-x 100 세척 하 고 10 분 동안 400 × g에서 원심, 동일한 버퍼의 100 µ L에서 resuspend 하 고 반대로 마우스 IgG-알 렉 사 594-토끼 IgG-알 렉 사 488 (1: 100)을 추가. 실 온에서 30 분 동안 incubate, 2 mL PBS/0.1% 트리톤-x 100 워시, 동일한 버퍼의 100 µ L에서 resuspend와 CD42b APC 안티의 20 µ L을 추가. 3.6.1 단계에서 설명한 대로 유리 슬라이드에 세포를 스핀 그리고 3.6.1 단계에서 설명한 대로 현미경 시각화에 대 한 샘플을 준비 합니다.
  • Ploidy 결정에 대 한 12 또는 차별화의 13 일에 세포를 수확. 씻어 SB의 1 mL를 추가 합니다. 10 분 및 100 µ L. 마지막 볼륨에서 20 µ L 안티 GPIIb/CD41 FITC 항 체와 얼룩 400 × g에서 원심 분리기 30 분 동안 4 ° C에서 품 어.
    1. SB의 1 mL와 함께 한 번 세척 하 고 당뇨 시트르산 버퍼 (1.25 m m 나트륨 구 연산 염, 염화 나트륨 2.5 m m, 3.5 m m 포도 당) 포함 20 µ g/ml propidium 요오드 화물 및 0.05%의 300 µ L에서 펠 릿 resuspend 트리톤 X 100. 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 15 분 동안 품 어.
    2. RNase 20 µ g/mL의 최종 농도에 추가 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 30 분 동안 품 어. 30000 50000 CD41 FITC+ 인구 (그림 2C)의 이벤트를 수집 하 여 cytometry 여 propidium 요오드 화물의 강도 결정 합니다.

    • 4. proplatelet 계산, 혈소판 열거, 및 혈소판 활성화

    1. 8 또는 감 별 법 및 종자의 9 일에 1 × 104 셀/잘 50 ng/mL rhTPO와 보충 하는 신선한 SFM의 200 µ L에 48-잘 접시에서 (3.1 단계)에서 세포를 수확. 37 ° C, 5%에서 5 일 동안 문화 공동2.
      참고: 정량 목적 3 중 웰 스 씨. 이 낮은 밀도 시각화를 위한 필요 하며 문화의 2 일 후 나타나는 시작 proplatelet-베어링의 mk. Proplatelets 일반적으로 계산 합니다. 피크 일 4와 5 사이입니다.
    2. 10 배 또는 20 X 목표를 사용 하 여 거꾸로 가벼운 현미경에 전체 잘에서 proplatelet 베어링 MK의 수를 계산 합니다.
      참고: 온수 (37 ° C) 현미경 단계가 바람직합니다, 이후 proplatelet 확장의 수축 하면 오랜된 시간 동안 실내 온도에 세포를 유지. Proplatelets MK 시체에서 긴 확장으로 관찰 된다. 각 MK 여러 proplatelet 돌출 할 수 있습니다. Proplatelets 개발는 MK의 몸 크기가 감소 합니다.
    3. 세포를 수확 하 고 실 온에서 10 분에 대 한 400 x g에서 원심. 3.3 및 3.4 단계에 설명 된 대로 20 µ L 안티 인간 CD41 FITC 항 체, 세포를 얼룩. Proplatelet 베어링 MK (pbMK)의 비율을 계산: pbMK (%) = [(Proplatelet 베어링 MKs/잘) / (총 CD41+ 세포 / 잘)] x 100
    4. 문화 매체에 발표 하는 혈소판을 계산, 부드럽게 파스퇴르 피 펫 셀 혼합 하 고 14 또는 15 문화의 일에서 100 µ L를 수집 합니다.
      1. 20 µ L 안티 인간 CD41 FITC 항 체 4 ° c.에 20-30 분으로 얼룩 각 isotype 제어 항 체를 사용 하 여 컨트롤 튜브를 설정 합니다.
      2. SB의 150 µ L 구슬 세 50 µ L를 추가 합니다.
      3. 흐름 cytometric 분석을 위해 로그 스케일 FSC 그리고 SSC를 설정 합니다. 4.4.1 게이팅 혈소판 (그림 3A)에 대 한 설정 섹션에 설명 된 대로 사용 하 여 정상적인 인간의 혈액 혈소판 혈소판이 풍부한 혈장에서 CD41 FITC와 스테인드.
      4. 구슬 cytometry에 의해 계산 스테인드 혈소판 분석. 구슬 SSC 점도 (그림 3A) 대 FSC를 사용 하 여 계산의 1000 이벤트를 수집 합니다. CD41 FITC 긍정적인 이벤트 (그림 3B) 수식을 사용 하 여에 따라 혈소판의 수를 계산.
        µ L 당 혈소판 = [(CD41 FITC 긍정적인 이벤트의 번호)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/볼륨 샘플)]
    5. 혈소판 활성화를 분석 하려면 부드럽게 파스퇴르 피 펫 셀 혼합 하 고 14 또는 15 문화의 일에서 100 µ L를 수집 합니다. 작은 셀을 5 분 동안 200 x g에서 Tyrode의 버퍼 (137 mM NaCl, 2.7 m KCl m, 1 mM MgCl2, 1.8 m CaCl2, 0.2 m m 나2HPO4m, 12 mM NaHCO3, 5.5 m m D-포도 당, pH 6.5) 및 원심 분리기의 1 mL를 추가 합니다.
      1. 상쾌한 그리고 혈소판 크기의 입자를 작은 10 분 800 x g에서 원심 분리기를 수집 합니다.
      2. 상쾌한 삭제 하 고 Tyrode의 버퍼의 100 µ L에서 resuspend. 20 µ M. 최종 농도 20 µ L PAC1 FITC 항 체와 아데노신 diphosphate (ADP)의 추가 FITC 긍정적인 이벤트의 비율을 확인 하려면 cytometry로 20 분 분석에 대 한 실 온에서 품 어. 사용 신선한 인간 혈소판 긍정적인 컨트롤 (그림 3C)와 같은 방식으로 처리.

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    결과

    이 프로토콜 수 있습니다 매우 순수 MK 문화 코드에서의 준비 혈액 유래 CD34+ 세포. CD34의 비율+ 세포 탯 줄 혈액은 약 1.315 (그림 1A)와 단 세포 (단계 1.8) 범위 90-300 x 10의 총 수 UCB 단위 당6 . CD34의 순도 + CD45 + 세포 격리 범위 90에서 99% (그림 1B) 후. MK (CD41 정의+ 세포) 혈 청 무료 CD34 초기에 관찰 된다+ 세포 rhTPO의 문화. 7 일에의 비율 MK 성숙 (CD41+ 및 CD42a+ 세포)은 일반적으로 30-40% (그림 1C). CD41 최고 ...

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    토론

    여기에 설명 된 프로토콜은 MK와 문화 탯 줄 혈액에서 혈소판의 일관 생산에 적합 합니다. 이러한 세포 MK 확산, 감 별 법, proplatelet 형성 및 혈소판 생산에 마약 또는 생물 학적 활동의 효과 같은 다양 한 프로세스를 연구에 사용할 수 있습니다.

    다양 한 문화 미디어와 cytokine 조합 문학에서 제시 되었다. + 줄기 세포 요소, Flt 3 ligand, 일리노이-3, 일리노이-6 지원 CD34 등 cytokines의 추가 확산 세포. 그러나,이 확장 문화14감소 MK 순수성에서 발생합니다. 혈 청 무료 미디어와 혼자, rhTPO를 사용 하 여, 여기에 제시 된 방법은 조상 세포의 중요 한 확장을 허용 하지 않습니다 하지만 unilineage megakaryocytic 확산 및 감 별 법 및 MK의 일관 된 생산 (90-99 %CD41+ CD42a+ 두 배 긍정...

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    공개 사항

    저자는 공개 없다.

    감사의 글

    저자 (그랜트 1012409 제너 시스에 링크 된 프로젝트) 호주 보건 및 의료 연구 위원회의 지원을 인정 한다.

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    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    세포 배양 시약
    재조합 인간 TPOMiltenyi Biotec130-094-013
    StemSpan SFEM II줄기 세포 기술9605CD34+ 세포용 무혈청 배지
    NameCompany카탈로그 번호Comments
    CD34 분리 시약
    CD34 MicroBead 키트 초순수Miltenyi Biotec130-100-453이 키트에는 FcR human IgG 차단 시약과 CD34 마이크로비드가 포함되어 있습니다. 이 비드에는 항-CD34 항체 클론 QBEND/10이 포함되어 있습니다. 순도 검사를 위해 다른 anti-CD34 클론을 사용합니다(예: 클론 8G12).
    LymphoprepAlere Technologies1114545림프구 분리 매체(밀도 1.077g/mL)
    멸균 분리 완충액(SB)Miltenyi Biotec130-091-221이 완충액에는 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.2, 0.5% 소 혈청 알부민 및 2mM EDTA가 포함되어 있습니다. 멸균된 세포 배양 등급 구성 요소를 사용하여 준비할 수 있습니다. 기포가 컬럼을 막을 수 있으므로 사용하기 전에 가스를 제거하십시오.
    NameCompany카탈로그 번호Comments
    Flow Cytometry and Cell Staining Reagents
    PE Mouse anti-Human CD34BD Biosciences340669Clone 8G12. 이는 CD34 순도 검사에 사용할 수 있습니다. 최종 항체 농도 1:10 희석.
    PerCP 마우스 anti-human CD45BD Biosciences3474641:10 희석
    PerCP isotype controlBD Biosciences3490441:10 희석
    FITC Mouse anti-Human CD41aBD Biosciences340929최종 항체 농도 1:5 희석.
    APC Mouse anti-Human CD42bBD Biosciences551061이 항체는 성숙한 MK(일반적으로 anti CD42a보다 낮은 양성 세포의 비율)를 검출하는 데에도 사용할 수 있습니다. 최종 항체 농도 1:10 희석.
    Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42aAbD SerotecMCA1227A647T현재 Bio-Rad에서 유통하고 있습니다. 최종 항체 농도 1:10 희석.
    Alexa Fluor 647 마우스 음성 대조군AbD SerotecMCA928A647현재 Bio-Rad에서 유통하고 있습니다. 동형 대조군 항체
    안티 폰 빌레브란트 인자 토끼 다클론AbcamAB69941:200 희석
    V450 마우스 안티-humna CD41aBD Biosciences584251:20 희석
    V450 동형 대조군BD Biosciences5803731:20 희석
    PAC1-FITC 항체BD Biosciences3405071:10 희석
    Anti CD62p 마우스 단클론AbcamAB66321:200 희석
    Alexa Fluor 488 염소 안티 토끼 IgGInvitrogenA110081:100 희석
    Alexa Fluor 594 염소 안티 마우스 IgGInvitrogenA110201:100 희석
    Ig Isotype Control cocktail-CBD Biosciences558659Isotype control 항체
    Propidium iodideSigma AldrichP4864
    CountBright 절대 계수 비드분자 프로브, InvitrogenC36950계수 비드
    NameCompanystrong>카탈로그 번호Comments
    Materials
    LS 컬럼Miltenyi Biotec130-042-401더 작고 더 큰 칼럼도 상업적으로 이용 가능
    MidiMACS 분리기 자석Miltenyi Biotec130-042-302
    MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
    Falcon 5mL 둥근 바닥 폴리 프로필렌 FACS 튜브, 스냅 캡 포함, 멸균체외 기술352063
    유리 슬라이드Menzel-GlaserJ3800AMNZ
    DAPIVector Laboratories마운팅 미디어 H-1200안티페이드 마운팅 미디어< DAPIstrong
    >NameCompany카탈로그 번호Comments
    Equipment
    도립 현미경LeicaDMIRB 도립 현미경
    형광 현미경ZeissVert.A1
    세포 분석기BD BiosciencesFACS Canto II
    Cytospin 원심 분리기ThermoScientificCytospin 4
    NameCompanyCatalog 번호Comments
    Software
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    참고문헌

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