대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

요약

일상적인 탐지 방법 바이러스 성 게놈 증폭을 이용 하는 비 전염 성 입자에서 전염 성 차별을 그들의 무 능력에 의해 제한 됩니다. 이 문서의 목적은 aptamer 바인딩, 동적 산란, 및 전송 전자 현미경 검사 법을 사용 하 여 감염 노로바이러스 입자의 차별에 도움이 다른 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 것입니다.

초록

인간의 노로바이러스 exacts 상당한 공중 보건 및 경제적 손실을 전세계. 생체 외에서 신흥 재배 발전 적용 되지 않습니다 아직 일상적인 바이러스의 검출에 대 한. 현재 탐지 및 정량화 기술, 핵 산 증폭에 주로 의존 하는 비 전염 성 바이러스 성 입자에서 전염 성 차별을 하지 않습니다. 이 문서의 목적은 최근 바이러스 성 입자의 infectivity 상태에 대 한 정보를 더 얻기 위해서는 함께 사용 되는 기술 발전에 구체적인 내용을 제시 하. 1 개의 기술은 capsids에 노로바이러스 ssDNA aptamer의 바인딩을 평가 포함 됩니다. Aptamers 쉽게 합성 하 고, 수정 되 고의 이점이 있고 저렴 하 고 안정적 이다. 또 다른 기술, 동적 빛 산란 (DL) 솔루션에서 capsid 행동 관찰의 이점이 있다. 전자 현미경 검사 법은 바이러스 성 capsids의 구조적 무결성의 시각화에 대 한 수 있습니다. 비록 유망한, 각 기술, 일반적인 aptamer 바인딩 같은 긍정적으로 위탁 한 분자를 샘플 행렬에서 DL에 대 한 정화 capsid의 요구와 가난한 감도 전자 현미경 검사 법에 대 한 몇 가지 단점이 있다. 그럼에도 불구 하 고, 조합에서 이러한 기술을 사용 하는 생산 데이터의 본문 보다 포괄적인 정보를를 제공 합니다 노로바이러스 capsid 무결성 infectivity의 정확한 평가 위해 필수적인 정보를 유추 하는 데 사용할 수 있습니다. 비활성화 방법 또는 바이러스 탐지의 해석입니다. 이 문서는 이러한 방법을 사용 하 여 인간의 노로바이러스 감염 입자를 차별에 대 한 프로토콜을 제공 합니다.

서론

인간의 노로바이러스는 상당한 공중 보건 부담에 대 한 세계적으로, 대략 685 백만 질병 및 212,000의 죽음을 일으키는 매년¹, 수십억 달러^2,3의 비용에. 오늘, 노로바이러스 검출 및 정량화 게놈 증폭 및 리간드 기반 플랫폼 포함 됩니다. 이전은 일반적으로 선호 더 민감한, 양적 정보를 제공 하는 거짓 긍정적인 결과⁴의 일반적으로 낮은 위험이 있다. 가장 일반적인 노로바이러스 검출 및 정량화 게놈 증폭 기술은 역전사 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량) 이다. 때문에 대상 인간의 노로바이러스 게놈의 작은 세그먼트를 증폭, RT-정량 혼자는 감염 사이 차별의 수와 비 전염 성 입자, 무료 게놈 RNA로 손상 capsids 게놈를 포함 하 고와 capsids 치명적 유전자 돌연변이 잘립니다 여전히 실시간 정량 Pcr에 의해 증폭 될 수 있습니다. 두 가지 새로운 체 외에서 재배 방법을 인간 노로바이러스^5,6 최근에 보고 되었다, 그러나 둘 다 여전히 바이러스 정량화에 대 한....

프로토콜

1. 구조에 대 한 평가 손실의 더 높은 순서 노로바이러스 Capsid 바인딩 분석 결과 플레이트 기반

참고: 여기에 매우 비슷한 ELASA 프로토콜 게시 ²⁹ 되었습니다 그리고 유사한 ELASA 분석 이전 연구의 일부 기사 ^{17 , , 18 22} 다른 곳으로 보고 되었습니다.

1. 인간의 노로바이러스 GII.4 시드니 capsids의 열 처리
   1. 얻을 순화 인간의 노로바이러스 GII.4 시드니의 주요 capsid 단백질 (VP1) (가입: JX459908) 조립 capsids.
      참고: 연구에서 Capsids R. Atmar (베일 러 대학의과 대학, 휴스턴, 텍사스)의 입수 했다.
   2. Dilute capsids 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.2) 개인 15 µ L의 최대 볼륨을 x 1에 50 µ g/mL를 PCR 튜브 출장. 적어도 600 튜브에 포함 되어 있는지 확인 capsid의 ng. 600는 확인 치료 ligand 조합....

결과

인간의 노로바이러스 GII.4 시드니 capsids (VLPs)의 구조적 무결성 무어 외 에 의해 발표로 여러 가지 새로운 방법을 사용 하 여 평가 했다 ¹⁷. 먼저, 실험에서 행 해졌다는 상 상속 수용 체/공동 factor (HBGA) 또는 바인딩 ssDNA aptamer (M6-2)을 그들의 능력의 기능으로는 capsids의 무결성 비교 (그림 1). 표시 되는 결과 이전 무어 외. 에 의해 제시 된 ¹⁷, aptamer M6-2-capsid 바인딩 동작의 다양 한 노출 시간에 대 한 68 ° C 열 처리에 노출 시 바이러스 HBGA 바인딩 비슷 했다 입증 하 고. 동안 HBGA 바인딩 신호 손실 약간 이전 보다 aptamer M6-2의 m 6-2 VLPs 65 ° C에 드러낸 후에 다양 한 시간에.......

토론

프로토콜 및 여기에 설명 된 기술을 인간의 노로바이러스 capsid 무결성/기능을 평가 하는 수단을 제공 합니다. 이러한 방법은 기계적 통찰력 비활성화는 바이러스에 대 한 치료의 효과 얻기 위해 사용할 수 있습니다 그리고 잠재적으로 더 전통적인 비활성화 평가 방법 RT 정량 또는 상 패 분석 결과 등을 보충할 수 있다. 예를 들어, 혼자 패 분석 실험에 의해 화학적 또는 물리적 비활성화의 평가 바이러스 비활성화의 정도의 측정만 하지 그 비활성화의 기본 메커니즘을 제공합니다. 또한, 바이러스 집계 titer의 과소 발생 하 고 따라서 치료 효능³⁰을 대 평가 수 있습니다. 이러한 방법을 더 노로바이러스 capsid의 무결성에 대 한 치료의 효과 대 한 정보를 제공 하 여 이러한 연구를 알릴 수 있습니다. 최근, 두 생체 외에서 (세포 배양) 경작 방법 인간의 노로바이러스에 대 한 보고^5,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
고차 노로바이러스 캡시드 구조의 손실 평가를 위한 Plate-based binding assay
96-well, medium-binding polystyrene EIA plate	Fisher (Costar)	07-200-36
96-well plate용 뚜껑	Thermo Fisher	3098
Paraffin film (Parafilm)	Thermo Fisher	PM999
1x PBS (산도 7.2)	Life Technologies	20012-050
폴리소르베이트 20	시그마-알드리치	P9416
1x PBS(pH 7.2) + 0.05% 폴리소르베이트 20	N/A	N/A
, 조립된 인간 노로바이러스 GII.4 캡시드	N/A	N/A
개별 0.2ml PCR 튜브	Genesee Scientific	22-154G
2 열순환기	Bio-Rad
탁상용 미니 원심분리기	Fisher Scientific	12-006-901
탈지 우유 고형분	Thermo Fisher	LP0031B
합성 조직혈액형 A형 이당류, 비오틴화	글리코테크	01-017
비오틴화 압타머 M6-2 (재고 농도 100 &마이크로; M: 뉴클레아제가 없는 물): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3'	Integrated DNA Technologies	N/A
Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), 우리는 Life Technologies SNN2004	Life Technologies	SNN2004
3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 기질, 실온	Thermo Fisher	50-76-00
1 M phosphoric acid	N/A	N/A
Microplate reader를 사용합니다. 읽을 수 있는 450nm	Tecan	Infinite m200 Pro
Name	Company	>카탈로그 번호	Comments<
strong>Analysis of Plate-Based Assay Results
Microsoft Excel or similar program	N/		A 해당 없음
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Dynamic Light Scattering Experiments
Zetasizer ZSP 또는 이와 유사한 입자 크기 분석 기기	Malvern Instruments	N/A
Vortex	Fisher Scientifc	02-215-365
석영 큐벳	Hellma	104-002-10-40
소량 일회용 큐벳 (VLP 사용을 줄이기 위해)	Malvern Instruments	ZEN0040
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Transmission 전자 현미경 샘플 준비
탄소 지지 필름이 있는 니켈 전자 현미경 그리드	Ladd Research	10880-100
자동 폐쇄 역 전자 현미경 핀셋	Ted Pella	5372-NM
정성 여과지	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
유리 페트리 접시	Sigma-Aldrich	BR455743
100 mM 재고 HEPES 용액 (pH 7.2)	N/A	N / A
2 % 우라닐 아세테이트	N / A	N / A

정제1861096