인플루엔자 중화 항 체는 인플루엔자 감염의 보호와 연관. Microneutralization 분석 실험 인간 혈 청의 중화 항 체를 측정 하 고 자주 독감 인간의 혈 청 학에 대 한 사용 됩니다. 인플루엔자 예방 접종 또는 감염 다음 현대 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 바이러스 중화 항 체 titers 측정 MDCK-SIAT1 세포를 사용 하 여 microneutralization 분석 결과 설명 합니다.
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방법 논문
사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화
이 논문에서
요약
초록
조류 독감 바이러스 (HA)에 대 한 중화 항 체는 인플루엔자 감염에 대 한 보호와 상관 관계가 주요 면역 메커니즘으로 간주 됩니다. Microneutralization (미네소타) 분석 실험 자주 독감 예방 접종 또는 감염 후 인간의 혈 청의 중화 항 체 응답을 측정 하는 데 사용 됩니다. Madine 다 비 개 신장 (MDCK) 세포는 미네소타 분석 실험에 대 한 일반적으로 사용 되 셀 기판. 그러나, 현재 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 인플루엔자 바이러스 획득 순환 수용 체 바인딩 특이성 변경. 표면에 증가 된 α-2, 6 sialic 갈 락 토스 moieties로 MDCK SIAT1 셀 라인은 이러한 현대 A(H3N2) 바이러스에 대 한 향상 된 infectivity 기존의 MDCK 셀 보다 더 충실 한 복제를 제공을 입증 했다. 여기, 우리는 미네소타 분석 결과 MDCK SIAT1 셀을 사용 하 여 이러한 현대 A(H3N2) 바이러스 중화 항 체 titers 계량 하도록 최적화 된 설명 합니다. 이 프로토콜 열 비활성화 세라 중화 항 체를 포함 하는 먼저 순차적으로 희석, 다음 100 TCID50/인플루엔자 바이러스에 바인딩할 세라에 항 체를 수 있도록 A(H3N2)의 인 큐베이 팅. MDCK-SIAT1 셀 다음 바이러스 항 체 혼합물에 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 A(H3N2) 바이러스 MDCK SIAT1 세포를 감염 시킬 수 있도록에서 18-20 h에 대 한 인 큐베이 팅. 하룻밤 배양 후 플레이트 고정 되 고 각 바이러스의 양을 잘 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 항 인플루엔자를 사용 하 여 계량은 nucleoprotein (NP) 단일 클론 항 체. 중화 항 체 titer 바이러스 infectivity의 50% 억제를 제공 하는 높은 혈 청 희석의 상호로 정의 됩니다.
서론
인플루엔자 바이러스는 인간의 인구 매년 사망률 및 사망 원인을 계속. 하는 인플루엔자 바이러스의 주요 표면 당단백질. HA를 대상으로 하는 중화 항 체는 인플루엔자 감염1,2의 보호와 상관 관계가 주요 면역 메커니즘입니다. Hemagglutination 억제 (HI) 분석 실험 및 MN 분석 널리 인플루엔자 감염이 나 예방 접종3후 인간의 혈 청에 항 체 응답을 측정 하는 데 사용 하는 두 가지 방법이 있습니다. 이 분석 결과 붉은 혈액 세포의 바이러스 hemagglutination의 항 체 억제를 측정 하 고 분석 결과 대리 하는 것으로 간주 됩니다. 안녕, 달리 미네소타 분석 결과 직접 인간의 세라 셀 문화에서 인플루엔자 감염을 중화 하는 항 체의 수치를 측정할 수 있습니다. MDCK 셀 인플루엔자 바이러스 분리에 자주 사용 하 고 미네소타 분석 실험4.
인플루엔자 바이러스는 지속적으로 antigenic 드리프트와 shift, 바이러스의 수용 체 의무적인 특이성을 변경할 수 있는 HA 단백질에 돌연변이 인수 받 다. 2014 년 이후 A(H3N2) 바....
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프로토콜
모든 독감 바이러스는 적절 한 biosafety 수준 요구 사항에 따라 처리 되어야 합니다 (BSL-2 또는 더 높은) Microbiological 및 생물 의학 실험실 (BMBL)12에 Biosafety에 정의 된 대로.
1입니다. 시 약 및 시작 물자의 준비
-
MDCK-SIAT1 세포와 균 세포 배양 매체 준비
- 높은 포도와 500 mL의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)를 사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 배양 을 준비, 10 %v / v 열 소 태아 혈 청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 나트륨 1 mM pyruvate, 1 mg/mL G418 황산 염 (예를 들어, 비활성화 geneticin), 및 (옵션) 100 µ g/mL 스와 100 U/ml 페니실린. 0.2 µ M 기 공 크기 세포 막을 통해 여과 하 여 소독. G418 황산 염 MDCK SIAT1 세포에서 플라스 미드의 안정성을 보장 하기 위해 추가 됩니다.
- MDCK-SIAT1 셀 라인을 준비 합니다. 162 cm2-살 ....
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결과
바이러스 주식의 infectivity의 결정만 분석 결과 첫 번째 단계입니다. 그림 2 에서는 접시 레이아웃을 바이러스 주식의 TCID50 결정을 보여 줍니다. 알 수 없는 infectivity 바이러스 주식, 대 한 바이러스 바이러스의 infectivity 계산을 최고의 적정 곡선을 캡처하기 위해 여러 사전 희석, 예 10-2 와 10-3에서 적정 수 있습니다. MN 분석 결과에 사용 된 바이러스 금액 100 TCID50/well (50 µ L)를 표준화 해야 한다. 바이러스 주식 100 TCID50달성 / 잘의 최소 희석 1: 100입니다.
그림 3 .......
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토론
MN 분석 결과 인플루엔자 혈 청 학에 대 한 인플루엔자 감염이 나 예방 접종을 다음과 같은 항 체 응답을 검색 하는 데 사용 하는 주요 분석 실험 중 하나입니다. 많은 인플루엔자 seroepidemiology 연구의 주요 결과 titers MN 분석 실험에서 생성 된 자주 사용 됩니다. MN 분석 sero 진단 및 백신 immunogenicity의 평가 또한 널리 사용 됩니다. 국제 간 연구소 연구14여러 실험실 수행 하는 미네소타 분석 비교 실시 되었습니다.
안녕하세요, 달리 미네소타 분석 결과 직접 세포 배양에서 바이러스 감염을 중화 시킬 수 있는 기능 항 체를 측정 하도록 설계 되었습니다. 필드 전 세계 실험실에서 사용 하는 미네소타 분석 실험의 다양 한 형태가 있다. (즉, 중화 항 체의 존재 바이러스 infectivity의 감소) 분석 실험의 읽어 바이러스 NP 항 체, 바이러스, 또는 면역-각 우물에서 바이러.......
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공개 사항
저자는 충돌의 관심을 보고. 결과 및 결론을이 책에서 저자는 고 반드시 센터의 질병 통제 및 예방 및 자금 지원 기관에 대 한 대표 하지 않습니다.
감사의 글
우리이 원고 준비 박사 Xiuhua Lu, 박사 펭 류, 및 그들의 중요 한 검토 및 지원에 대 한 질병 통제 센터의 독감 부문에서 양 애슐리 버로우즈 감사합니다. 우리는 그림 3의 그래픽을 준비 하 고 그의 도움에 대 한 질병 통제 센터의 독감 부문에서 박사 아드리안 Reber 감사. 마지막으로, 우리는 박사 M. Matrosovich, Marburg, 독일 MDCK SIAT1 세포를 제공 하기 위한 감사 합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 둘베코' s Modified Eagle Medium(DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | 멸균 세포 배양, 바이러스 전파 및 바이러스 희석 배지의 중요한 구성 요소 |
| 소 태아 혈청(FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) 분획 V, 프로타제 프리 | 시그마-알드리치 | 3117332001 | |
| L-글루타민 | 생명 과학 | 25030-081 | |
| 소듐 피루베이트 | 생명 과학 | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 디설페이트 염 | 시그마-알드리치 | A1720-5G | |
| HEPES | 생명 과학 | 15630-080 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 생명 과학 | 15140-122 | |
| 아세톤 | VWR | 67-64-1 | 80% 농도 |
| 인산염-시트르산 완충액과 과붕산나트륨 함유 완충액에서 사용됨 | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylenediamine Dihydrochloride 정제 | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 세포 배양 등급 물 100ml당 1 |
| 황산 | Fisher Scientific | A510-P500 | 사용 0.5M 최종 농도 |
| 에탄올, 변성, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | 70% 농도에서 사용 |
| Trypsin-EDTA | 생명 과학 | ||
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP 마우스 단클론 Ab | Millipore 풀 | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96웰 플랫 바텀 플레이트 | , Thermo Scientific | 3455 | |
| 플레이트 리더 | 분자 소자 | Spectromax 384 plus | |
| 세포 배양 플라스크 162 cm2/벤트 캡 | Corning/VWR | 3151 |
참고문헌
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against ....
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재인쇄 및 허가
