방법 논문

셀 시트의 마이그레이션 분석 하 점 분석 결과 사용 하 여

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DOI:

10.3791/56451

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2017년 12월 5일

1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, National Cancer Institute, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

셀 마이그레이션 개발, 조직 유지 보수 및 수리, 및 tumorigenesis, 필수적 이며, 성장 요인, 발산, 및 cytokines에 의해 규제 됩니다. 이 프로토콜 점 분석 결과를, microenvironmental 신호에 연결 된, 응집력 있는 셀 시트의 철새 형을 평가 하기 위해 2 차원, 무제한 마이그레이션 분석 결과 설명 합니다.

초록

복잡 한 유기 체 정적 표시, 그들의 조직의 지속적인 매출을 받고 있다. 세포 나이, 다이, 그리고 새로운 세포로 대체 셀 이동 조직 내의 긴밀 하 게 조율 된 방식. 종양 개발 하는 동안이 균형을 방해 하 고 종양 세포 두고 침공 지역 microenvironment, 먼 사이트에 여행 하 고 궁극적으로 먼 사이트에서 전이성 종양을 형성 하는 근원의 상피. 점 분석 결과 간단 하 고, 2 차원 무제한 마이그레이션 분석 결과, 셀 무료 영역에 셀 시트의 net 움직임을 평가 하 고 셀 마이그레이션 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여 매개 변수를 분석 하는. 여기, 점 분석 결과 셀 표 피 성장 인자 (EGF), 유방암 세포의 악성 가능성을 높이기 위해 알려진 철새 응답을 분석 하는 인간의 침략, 유 방 암 세포 선, MCF10CA1a, 형성 하는 폐 식민지를 사용 하 여 증명 되 고 변경 셀의 철새 형 하.

서론

마이그레이션 분석 널리 종양 세포에서 생체 외에서의 침략과 전이성 잠재력을 평가 하는 데 사용 됩니다. 가장 일반적으로, 상처 또는 스크래치 분석 결과 상피 시트의 셀 허가 지역1,2,3로 마이그레이션 평가 하는 데 사용 됩니다. 스크래치 시험을 수행 하기 위해 세포는 단층으로는 도금 고 "처음" 또는 셀 자유로운 지역 피 펫 팁으로 만들어집니다. 스크래치 분석 결과 일반적으로 사용 가능한 조직 문화 공급 설정 쉽게 이며 여러 샘플의 처리에 대 한 수 다 잘 접시에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 스크래치로 세포는 단층에서 물리적으로 제거 되 고 종종 세포의 죽음을 받 다. 또한, 접시에 부착 된 세포 외 기질 자주 긁 과정에서 손상 되었습니다. 마찬가지로, 실리콘의 사용 (예: Ibidi 챔버4) 삽입 또는 스텐실의5,,67 이어질 수 있는 세포의 기계적 파괴 및 코팅에 사용 되는 매트릭스 단백질의 부분적인 제거는 접시입니다. 다른 상처 나 긁힌의 폐쇄를 모니터링 분석 실험의 단점은 그들의 한정 된 시간 코스 스크래치 닫힐 때까지 셀 마이그레이션 분석만 수 있습니다.

수행 점 분석 결과, 세포는 코팅 또는 코팅 접시8에 원형 식민지로 도금. 이 도금 전략에 대 한 근거는 셀 이나 삽입의 제거로 문화를 방해 하지 않고 주변 셀 자유로운 지역으로 침공 하거나 마이그레이션할 수 있는 정의 된 가장자리와 셀 시트를 얻을 것입니다. 점 분석 결과의 전반적인 목표 셀 시트 지 변위 또는 식민지, 뿐만 시간 경과 영상 spatio 시간적 해상도에 셀의 철새 표현 형 분석을 수행 하 여 측정으로의 마이그레이션을 관찰 하는 것입니다.

셀 마이그레이션 microenvironmental 신호 발산, cytokines, EGF 등 성장 요인 등의 다양 한 영향을 받을 수 있습니다. EGF는 그것의 수용 체, EGF 수용 체9, 바인딩을 통해 그것의 생물학적 효과 행사 하 고 침략과 전이성 종양 세포4,,910의 행동을 증가 하는 성장 인자. 점 분석 결과 사용 하 여 공부 하는 여기, EGF 셀 마이그레이션 인간의 침략, 폐 식민지 형성 유 방 암 세포 선 (MCF10CA1a)8,,1112에 자극.

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프로토콜

1. 코팅의 요리 (1 일)

참고: 그것을 처리할 때 접시의 바닥에 지 문이나 먼지를 놓지 있는지 확인 합니다.

  1. Thaw 마우스 콜라겐 얼음, IV 하 고 3 mL 10 µ g/mL 콜라겐 IV 솔루션의 준비 50 m m HCl (pH 1.3)와 희석.
    참고: 콜라겐 37 ° c.에 침전 한다 그것은 그러므로 녹고 그것으로 작업 하는 동안 낮은 온도에서 콜라겐 솔루션을 유지 하는 것이 중요입니다. 적절 한 크기의 aliquots를 준비 하 여 반복된 freeze-thaw 주기를 방지-80 ° c.에서 그들을 저장 하 고
  2. 12 잘 유리 하단 접시의 각 음에 250 µ L 콜라겐 IV 솔루션을 추가 하 고 적절 한 크기의 꽉 닫는 플라스틱 상자에 넣어. 젖은 종이 수건 및 습기 챔버는 상자를 접시 주위를 배치 합니다. 하룻밤 실 온에서 번호판을 품 어.
    참고:만 성장 지역 코팅 필요, 그것은 콜라겐 솔루션 접시의 바닥에 붙어 있는 커버 슬립 커버 하기에 충분 한 ( 그림 1A, B 플레이트의 회로도 대 한 참조).
  3. 다음날 아침 씻어 접시 이온 H2O 비 흡수 콜라겐 및 버퍼 제거를 두 번. (해당 되는 경우 물이 튀기는이 지역에 pipetted) 접시 바닥에 coverslip에 의해 형성 된 지 않기로 잘 접시의 가장자리에 물을 직접. 층 류 흐름 후드에서 접시 건조 접시를 즉시 사용 하거나 4 ° C에서 최대 5 일 동안 저장 합니다.
    참고: 다른 셀 라인 다른 코팅, fibronectin 또는 콜라겐 같은 내가 필요할 수 있습니다.

2. 도금 점 분석 결과 (주 2)

  1. 세포 현 탁 액 준비
    1. 세포 현 탁 액을 준비, 5% 말 혈 청 80% 합류 보충 DMEM/F12 매체에 60-m m 조직 문화 접시에 재배 하 고 있는 셀을 사용
    2. 칼슘 및 마그네슘 무료 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS) 셀을 한 번 린스 500 µ L 트립 신-EDTA (실내 온도), 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2, 습도 분위기에서 인큐베이터에서 3-5 분에 대 한 셀을 품 어.
    3. 4.5 mL 문화 중간 트립 신 활동을 중지 하 고 20 세에 분리 된 세포를 일시 중단 한 hemocytometer에 세포 현 탁 액의 µ L 약 수.
    4. 3 분 x g 200에서 원심 분리 하 여 15 mL 원뿔 튜브에 남아 있는 세포를 작은, 상쾌한, 발음 그리고 3 x 106 셀/mL을 문화 매체에 셀 resuspend.
      참고: 다른 코팅 기판 / 셀 라인, 최적의 셀 밀도 희석 시리즈에서 설정할 수 있어야 합니다. 3 x 106 셀/mL 출발점으로 것이 좋습니다.
  2. 셀을 도금
    1. 장소는 10 µ L 드롭 콜라겐 IV의 각 커버 슬립의 중심에 세포 현 탁 액의 만지거나 긁는 (그림 1A, B) 코팅 없이 12 잘 유리 하단 플레이트 코팅. 37 ° C, 연결할 셀 수 있도록 습도 분위기에서 30 분 동안 접시를 품 어. 거꾸로 현미경 셀 연결 되어 있는지 확인 합니다.
      참고:이 볼 수 있습니다 최고의 드롭의 가장자리에 형성 된 단층의는 (그림 1C) 관찰 될 수 있다. 필요한 경우, 접시를 최대 품 어 3 h. 반드시 인큐베이터에 습도 충분히 높이 신속 하 게 밖으로 건조 하실 수 있습니다. 이 단계 동안 드롭 볼륨의 감소를 관찰 하는 경우 습도 높이기 위해 우물 사이 공간에 PBS를 추가 합니다.
    2. 부드럽게 연결 되지 않은 세포를 제거 하는 두 번 문화 매체의 1 mL와 웰 스 워시. 각 잘을 1 mL 문화 매체를 추가 합니다. 체크는 거꾸로 한 현미경 인 부동 셀 유지, 그렇지 않으면 다시 우물을 씻어. 37 ° C, 5% CO2, 잘 정의 된 셀 시트를 습도 분위기에서 하룻밤 셀을 품 어.
      참고: 부동 셀 플레이트에 재연결 하 고 원치 않는 셀 식민지를 형성 하는.

3. 자극 세포 (3 일)

  1. 모든 우물 식민지 제대로 성장 하는 셀을 위해 역 현미경을 사용 하 여 확인 합니다. 필요 하다 면, 부적 절 한 우물을 표시 하 고 그들을 사용 하지 마십시오.
  2. 레이블을 적절 하 게 각 조건에 대해 조사 플레이트의 각 잘. 또는 3 중에서 각 상태를 실행 합니다.
  3. DMEM/F12 0.1% 말 혈 청 (굶주린 중간)를 포함 하는 셀을 굶 어 매체 변경 3 h 세포 자극 하기 전에.
  4. EGF (최종 농도 5 ng/mL)의 추가 또는 다른 원하는 중재자에 의해 세포를 자극 하 고 부드럽게 1 mL micropipettor를 사용 하 여 매체를 혼합 하거나 접시를 소용돌이.
  5. 4.1 섹션에 설명 된 대로 가장자리 변위 및 가장자리 윤곽을 관찰 하는 것 1-4 일 동안 접시를 품 어 또는 시간 경과 영상 섹션 4.2에에서 설명 된 대로 수행.

4. 셀 식민지 및 셀의 시각화

  1. Hematoxylin-오신 (그) 얼룩 식민지 성장 (하루 4-7)를 측정 하
    1. ~ 2 분 동안 70% 에탄올 (1 mL/음)에서 셀을 수정 합니다.
    2. 되며 (1 mL/음), ~ 2 분으로 핵을 얼룩.
    3. 핵까지 수돗물 (1 mL/잘) 세척 셀은 파란색, 5-10 분.
    4. 세포질 오신 (1 mL/음), ~ 2 분으로 얼룩.
    5. 이온을 제거 된 물 (1 mL/음)로 씻어.
      참고: Hematoxylin 및 오신 솔루션 수집 고 희미 한 되는 얼룩 때까지 여러 번 사용 될 수 있습니다.
    6. 공기가 건조 플레이트입니다.
    7. 접시를 플립 하 고 통치자를 가진 점 직경을 측정 한다. 또는, 카메라, 접시의 사진을 찍어 고 ImageJ에 점 직경을 분석 합니다.
  2. 시간 경과 현미경 (3 일)
    1. 인큐베이터 현미경에 전환 하 고 37 ° c 온도 조정 DH2O. 조정 5% CO2 는 가습기를 채우십시오. 인큐베이터 챔버 습도 전동된 스테이지를 자유롭게 이동할 수 확인 하십시오. 인큐베이터 챔버를 닫고 37 ° c.를 조정 하는 현미경을 허용
      참고: 현미경 사용 (재료의 표 참조) 여기 한다가 열 될 적어도 3 h 동안 37 ° C에 셀 초점의 표류를 방지 하는 몇 군데는 전에.
    2. 인큐베이터 현미경의 스테이지에 접시를 놓고 무대 목록을 설정 합니다. 이미지 두 반대 가장자리 그리고 각 셀 점 (그림 1A)의 센터.
    3. 걸릴 이미지 10 X 목표를 사용 하 여 15-24 h에 대 한 모든 3 분. 데이터를 다운로드 하 고 프로그램 선택, 이미지 분석 진행 예, ImageJ 또는 Matlab.

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결과

(그림 1)을 여기에 제시 된 점 분석 결과 침략를 사용 하 여 수행한 모델 시스템으로 유방암 세포 (MCF10CA1a)를 형성 하는 폐 식민지. 점 분석 결과 수익률 편리는 초보자의 손에 에서도 높은 재현성 셀 점 분석 결과 (그림 1D) 실행 하기 쉬운. 점 분석 결과 그 얼룩, 또는 시간 경과 영상 결합 및 후속 입자 이미지 velocimetry (PIV) 수의 상피 가장자리, 셀 속도 및 가장자리에 셀으로 셀 방향 변위를 포함 하 여 다양 한 마이그레이션 매개 변수 연구 상피 시트의 셀 자유로운 지역으로 마이그레이션하십시오. 처음, 셀 점 들의 위상 대비 영상 그 침략, 폐 식민지 형성 유방암 세포 (MCF10CA1a) 유지 엽 형 EGF와 자극 후 공개 했다. 그러나, 단일 셀 시트를 떠나는 자극 하는 EGF 셀 점 (

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토론

종양 진행 셀 동안 주변 조직 침입 하 고 먼 사이트15전이 기원의 조직에서 마이그레이션하십시오. 셀 서식에서 셀의 마이그레이션 점 분석 결과에서 관찰할 수 있습니다. 여기, 점 분석 결과에 EGF 인간 유방암 세포의 철새 형을 분석 하 여 그림입니다.

결과 얻기 위해 정확 하 고 복제할 도트의 설정에서 몇 가지 단계 분석 실험은 중요 합니다. 첫째, 접시의 코팅 방법 강한 세포 플레이트에 고착 할 수 있다 고 셀 마이그레이션할 경우 결정 합니다. 케어는 콜라겐 IV 또는 다른 기질을 가진 격판덮개의 코팅은 실험적인 변화를 최소화 하기 위해 균질 성 취해야 한다. 또한, 그것을 조사 하는 세포를 연결 하 고 코팅된 접시에 마이그레이션 여러 농도에 다른 매트릭스와 함께 여러 실험 선택한 셀 라인의 코팅 조건을 최적화 해야 할 수 있습니다 보장 되어야 합니다. 둘째, 세포의 정확한 도금은 재현성에 대 한 중요 합니다. 셀 드롭의 발자국 모양...

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공개 사항

저자는 공개 상관이 있다.

감사의 글

저자는 Bhagawat 수브라마니안, 이순신 (제이슨) 장 폴 란다 조, 그리고 캐롤 부모 읽기 및 원고에 대 한 코멘트에 대 한 감사를 기원 합니다. 이 작품은 국립 암 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 건강의 국가 학회.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
MCF10CA1a 세포Karmanos Research InstituteN/A세포는 마우스
콜라겐 IVBD Biosciences플레이트를 코팅하는 데 사용되는
354233 트립신 / EDTAThermo Fisher25300054조직 배양 플레이트에서 세포를 제거하는 데 사용됩니다
. DPBS 를 세척하는 데 사용되는Mediatech21-031-CV
Thermo Fisher11320082배양 배지
말 혈청Thermo Fisher26050088보충하는 데 사용
MatTekP12G-1.5-14-FEGF
(표피 성장 인자, 인간 재조합)Peprotech세포를 자극하는 데 사용되는
지방산이 없는 BSA시그마A8806-1GEGF
헤마톡실린시그마HHS32식민지를 염색하는 데 사용되는
에오신전자 현미경 과학26051-10식민지 37
°을 염색하는 데 사용됩니다. C, 5% CO2 인큐베이터Sanyo모델 MCO-18AIC(UV)
Zeiss AxioObserver(인큐베이터 챔버 및 전동 스테이지 포함Zeiss모델 Axio Observer.Z1타임랩스 이미징에 사용
ORCA 플래시 LT sCMOS 카메라BioVisionC11440-42U-KITZeiss AxioObserver
MetamorphBioVisionMMACQMIC타임 랩스 이미징
도립 현미경Olympus모델 IX70세포를 계수하고 조직 배양 플라스틱 상자에서 콜로니를 확인하는 데 사용됩니다
LockN/A습한 챔버로 사용됨(플레이트에 맞는 단단히 닫히는 플라스틱 상자를 사용할 수 있음)
세포 DMEM / F12 세포으로 사용 배양 배지 12 웰 유리 바닥 플레이트를 이미징을위한 세포 성장에 사용 AF-100-15, , , , ) 에 사용되는 소프트웨어 은 .는

참고문헌

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EGFH and EIVMCF10CA1a

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