어레이 기반 비교 Genomic 교 잡 플랫폼 효율적인 탐지의 복사 번호 유사 빠른 중성자 유도 개자리속 truncatula 돌연변이에 대 한

Summary

이 프로토콜에 복사 번호 유사의 전체 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (CGH) 분석 수행에 관심이 있는 연구자에 대 한 실험 단계 및 시 약, 장비, 및 분석 도구에 대 한 정보 제공 식물입니다.

Abstract

돌연변이 유전자 기능 연구에 대 한 귀중 한 유전 자원 이다. 돌연변이 컬렉션을 생성 하려면 세 가지 유형의 mutagens 활용할 수 있습니다, T DNA 또는 transposon 등 생물, 에틸 methanesulfonate (EMS), 같은 화학 또는 이온화 방사선 같은 물리를 포함 하 여. 돌연변이 관찰의 유형에 돌연 사용에 따라 다릅니다. 이온화 방사선 유발 돌연변이, 돌연변이 또는 삭제, 복제, 또는 재배치 포함. T-DNA 또는 transposon-기반 mutagenesis는 변환에 취약 종으로 제한, 화학 또는 물리적 mutagenesis 종의 광범위 한 범위에 적용할 수 있습니다. 그러나, 전통적으로 화학 또는 물리적 mutagenesis에서 파생 하는 돌연변이의 특성 지도 기반 복제 방식을, 노동 집중과 시간이 소모 되는 사용 합니다. 자, 우리 감지 하 여 효율적으로 복사 번호 유사 (CNVs) 돌연변이에 빠른 중성자 사격 (FNB) mutagenesis에서 파생 된 특성 고밀도 게놈 배열 기반 비교 genomic 교 잡 (aCGH) 플랫폼을 적용할 수 있음을 보여합니다 개자리속 truncatula, 콩과 식물 종입니다. 전체 게놈 시퀀스 분석 50000 개 이상의 유전자 나 유전자 모델 M. truncatula에서 보여줍니다. M. truncatula 에서 현재, FNB 유발 돌연변이에서 150000 이상 m 1 라인을 대표 하는 게놈에 있는 유전자의 기능 연구에 대 한 귀중 한 유전 자원에서 파생 됩니다. 여기에 설명 된 aCGH 플랫폼 FNB 유발 돌연변이 M. truncatula에 특성화를 위한 효율적인 도구입니다.

Introduction

콩 (Fabaceae) 콩 (최대 글리신), 알 팔 파 (개자리속 sativa) 등 많은 경제적으로 중요 한 종 가진 꽃 식물의 3 번째로 큰 가족입니다. 콩과 식물 질소 담합 토양 박테리아, 일반적으로 Rhizobia 있는 대기 이질소 호스트 식물에 의해 사용 하기 위해 암모니아로 감소 된다 뿌리 혹을 개발 하 라는 작용할 수 있습니다. 이와 같이, 콩과 식물 작물의 재배는 질소 비료의 작은 입력 요구 하 고 따라서 지속 가능한 농업에 기여. 콩과 식물 작물 생산 나뭇잎과 씨앗 높은 단백질 콘텐츠, 우수한 사료 및 곡물 작물으로 봉사. 그러나, 재배 콩과 식물 종에는 일반적으로 복잡 한 게놈 구조, 성가신 콩과 식물-특정 프로세스에 핵심 역할을 하는 유전자의 기능 연구를 만드는 있다. 개자리속 truncatula 널리 채택 되었습니다 콩과 식물 연구에 대 한 모델 종으로 주로 하기 때문에 (1)는 상대적으로 작은 단일 게놈 크기 (550 ~ Mbp); 2 중 게놈 (2) 식물 유전자 기능 연구; 대 한 안정적으로 변형 될 수 있다 그리고 (3)은 밀접 하 게 관련 된 알 팔 파 (M. sativa로 구나), 사료의 여왕 및 변환 연구에 대 한 다른 많은 경제적으로 중요 한 작물. 최근, 게놈 시....

Protocol

참고: 그림 1 배열 CGH 프로토콜에 대 한 5 단계를 보여 줍니다. 그들은: 1); 식물 재료의 준비 2) 격리의 고품질 DNA 샘플; 3) 레이블 및 정화의 DNA 샘플; 4) 교 잡, 세척, 그리고 검색의 전체 게놈 배열; 그리고 5) CGH 데이터 분석. M. truncatula 전체 게놈 타일링 어레이 50000 개 이상의 유전자 나 게놈 (참조 자료의 테이블)에 유전자 모델을 대상으로 하는 971,041 독특한 올리고 프로브의 총 포함 되어 있습니다. 고유의 프로브 간격 약 모든 150의 기본적인 쌍 (bp) exonic 지역 및 261에 M. truncatula 게놈의 intronic 지역에서 bp.

1. 식물 재료의 준비

1. Scarify 야생 타입 (WT; M. truncatula cv Jemalong A17)와 8 분에 대 한 집중된 한 황산을 가진 FN6191 돌연변이 씨앗 (재료의 표 참조). 제거 하 고 액체 폐기물 컨테이너에 황산 삭제.
2. 린스 씨앗 압력가 이온을 제거 된 물으로 세 번.
3. 표면 소독 씨앗....

Results

그림 2 는 전체 게놈에서 돌연변이 WT 신호 대의 표준화 된 로그₂ 비율의 분포를 보여준다. CGH 데이터의 분석 공개 대략적인 전체 SUNN 유전자³³ 와 몇 가지 다른 염색체 4에 22 kb 삭제 주석 FN6191 돌연변이 (그림 2, 그림 3)에서 유전자. 후보자 삭제 된 지역 평균 정규화 된 로그₂ 비율 미만-2.5 (보충 표 1) 73 연속 프로브 배열에 의해 덮여 있었다. 삭제 테두리의 검사 제안이 돌연변이에 상 상속 삭제 좌표 22,313,168 및 22,334,934 염색체 4 (그림 3) 사이 위치한 프로브에 의해 .......

Discussion

어레이 기반 CGH 플랫폼 검색 및 빠른 중성자 사격 (FNB)의 특성에 대 한 개발 했습니다-cv. M. truncatula Jemalong A17에에서 돌연변이 유도. 배열 CGH 메서드 유전자 돌연변이 검출에서 사용을 보여 우리는 돌연변이 FN6191 S. meliloti Sm1021와함께 접종 때 야생 유형 식물, 달리 하이퍼 nodulation 형 전시의 aCGH 분석을 수행. 세분화 분석을 위해 세그먼트 로그₂ 비율의 의미는 세그먼트 내의 프로브 있었다면 그 주어진된 배열 비교에 대 한 낮은 임계값 상한 임계값 보다 크거나 중요 한 간주 되었다. 각 비교에 대 한 상한값은 모든 데이터 포인트의 95 번째 백분위 수의 로그₂ 비율 값을 결정 했다. 각 비교에 대 한 낮은 임계값은 모든 데이터 포인트²⁴5 백분위 수의 로그₂ 비율 값을 결정 했다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medicago truncatula 게놈 어레이, 1 x 1 M	Agilent	G4123A
Medicago truncatula FN6191 (돌연변이)	사내	FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (참조)	사내	A17
황산	Sigma-Aldrich	320501
DNeasy Plant 미니 키트	Qiagen	69104
Nanodrop 분광 광도계	Thermo Scientific	1000D
SureTag DNA 라벨링 키트	Agilent	5190-3400
랜덤 프라이머	Agilent	5190-3399
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004-1L
Thermocycler	MJ research	PTC-200
원심분리기	Labnet international, Inc	Spectrafuge, 24D
안정화 및 건조 솔루션	, 애질런트	5185-5979
올리고 aCGH/ChIP-온-칩 하이브리드화 키트	, 애질런트	5188-5380
하이브리드화 챔버 개스킷 슬라이드	애질런트	G2505
Human Cot-1, DNA	, 애질런트	5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip 세척 버퍼 1 및 2	Agilent	5188-5221
혼성화 챔버, 스테인리스	Agilent	G2534A
혼성화 오븐	Agilent	G2545A
정제 컬럼	Agilent	5190-3391
레이저 스캐너		Roche MS200
NimbleScan 2.6	Roche Nimblegen	5225035001
신호 맵 1.9	Roche Nimblegen	신호 맵1.9