방법 논문

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

DOI:

10.3791/56482

⸱

2018년 1월 4일

 , 
1Department of Convergence Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center, 2Synaptic Circuit Plasticity Laboratory, Department of Structure and Function of Neural Network, Korea Brain Research Institute

이 논문에서

요약

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이 프로토콜 전송 전자 현미경 검사 법이 부정적인 얼룩이 지기, 상세한 구조 및 면역-골드 라벨 exosomes에 특정 단백질의 위치를 확인 하려면 ultrathin 단면에 필요한 다양 한 기법을 설명 합니다.

초록

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Exosomes는 나노 크기의 세포 외 체액 분 비 소포 그리고 그들을 분 비 하는 셀의 특성을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 내용과 secreted vesicles의 형태 셀 행동 또는 생리 적 상태, 예를 들면 세포 성장, 마이그레이션, 분열, 그리고 죽음을 반영합니다. Exosomes의 역할 매우 크기에 따라 달라질 수 있습니다 따라 다르며 exosomes의 크기 30에서 300 nm. Exosome 이미징에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법 부정적인 얼룩, Cryo-전송 전자 현미경, 스캐닝 전자 현미경, 원자 힘 현미경을 기반으로 하는 다른 결과 이다. 전형적인 exosome 형태학 부정적인 얼룩 통해 평가 컵 모양 이지만 더 세부 사항은 아직 명확. 구조 연구를 통해 잘 특징이 있는 exosome 의료 및 제약 분야에서 필요한 특히 이다. 따라서, 함수 종속 형태 라벨 exosome의 상세한 구조에서 특정 단백질 등 전자 현미경 기법에 의해 확인 되어야 한다. 자세한 구조를 관찰, ultrathin sectioned 이미지와 exosomes의 부정적인 스테인드 이미지 비교 되었다. 이 프로토콜에서 부정적인 얼룩이 지기, 전체 마운트 immuno 얼룩이, 블록 준비, 얇은 섹션, 그리고 면역-골드 라벨을 포함 하 여 exosomes의 영상에 대 한 전송 전자 현미경 검사 법 하는 것이 좋습니다.

서론

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Extracellular 소포 (EVs) 지질 bilayer 소포 세포에 의해 분 비 되며 그들의 크기 범위는 30 300 nm 사이. EVs는 Hodgkin의 질병1환자의 소포에서 증거와 함께 1978 년에 처음 보고 되었다. 이러한 vesicles 40 ~ 120 나노미터 크기에 보고 했다. 1980 년에, 그것은 EVs 응고 시스템 및 혈전 증, 암 환자2혈관 내 혈액 응고의 형성에 관련 된 것으로 알려졌다. 30 년 후, EVs 종양 침공, 면역 탈출 및 신생3홍보 하는 중요 한 요소 되도록 보고 되었습니다. 또한, EVs의 기능 세포의 상호 작용 분야에서 염증, 면역 장애, 신경 질환 및 암4레 귤 레이 터로 공부 되었다. EVs는 특정 생체 단백질, mRNA, 예측에 관한5등 포함, 진단 및 치료에 그들의 잠재적인 응용 프로그램 분석된6,7되었습니다. EVs는 exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, 미, promininosom....

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프로토콜

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1. 블록 준비, 단면, 얼룩이 지 고는 Exosome의 이미징

  1. 1.5 h23에 대 한 100000 x g에서 원심 분리에 의해 HCT116 세포의 문화 상쾌한에서 exosomes을 펠 렛. 표면에 뜨는 문화를 제거 하 고 신중 하 게 순화 exosome 펠 릿 1 mL의 0.1 M 나트륨 cacodylate 솔루션 (pH 7.0) 4 ° c.에 1 시간에에서 2.5%도 해결 0.1 M 나트륨 cacodylate, 160 ml 증류수 (DW) 4.28 g cacodylic 산 분해. 0.1 M HCl 최대 200 mL 증류수와 함께 게와 7.4에 pH를 조정 합니다.
  2. 정착 액을 제거 하 고 실 온에서 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼의 1 mL와 함께 알 약을 씻어. 각 변경 10 분 지속으로 세 번을 반복 합니다.
  3. 후 4 ° c.에 2% 오스뮴 tetroxide 1 h의 1 mL와 함께 샘플을 수정
  4. 정착 액을 제거 하 고 세 번 0.1 M 나트륨 cacodylate와 린스 버퍼 마다 10 분.
  5. 등급된 아세톤 시리즈와 10 분 동안 품 어 (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 각각) 뿌리에.
  6. 아세톤을 제....

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결과

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현재, exosomes 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 크기와 모양 범주로 분류 됩니다. 그림 2 는 부정적인 exosome 및 전체 마운트 상태에 면역 이라는 exosome 스테인드. 그림 3 얇은 단면 후 sectioned exosome와 면역 이라는 exosomes를 보여준다. 면역-골드 얼룩 특정 단백질의 항 체를 사용 하 여 긍정적으로 exosome 식별은 exosome 단백질의 종류를 분류 하는 데 사용 됩니다. 이 종이에 프로토콜 플라스틱 sectioned exosome와 전체 마운트 immunostaining 및 immunostaining를 사용합니다.

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토론

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이 문서는 자세한 exosome의 구조를 관찰 하 고 그 특정 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜을 표시 합니다. 부정적인 얼룩 exosome17이미징에 대 한 최선의 방법으로 간주 되었습니다. 이 기본 기술을 exosomes의 컵 모양의 구조를 보이고 있다. 그러나,이 컵 모양 인 위 건조 과정으로 인해 발생할 수 있는 형태입니다. 곳을 알아내는 가장 결과 exosomes 용액25,26에 완벽 하 게 구형 구조를가지고 나타났습니다. 곳을 알아내는 가장 기술 자연 구조를 조사 하기 위한 매우 강력한 방법 이지만 면역-골드 메서드를 적용 하기 어렵습니다. 종래의 방법 (전체 마운트-부정적인 얼룩이 지기 방법)에서 건조 지적 Raso와 동료는 컵 모양의 형태에 결과. 이 연구에서 셀 준비 (일상적인 EM, 고정, 탈수, 포함, 및 단면)에 대 한 표준 방법 exosome 건조 효과 줄이기 .......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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이 연구는 생물에 의해 지원 되었다 & 의료 기술 개발 프로그램 국가 연구 재단 (NRF)의 &는 정부에 의해 투자 (MSIP & 보건복지부) (No. 2016M3A9B6904244). 우리는 또한 exosome의 정화의 약용 Bioconvergence 연구 센터의 회원을 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
글루타르알데히드EMS16200
소듐 카코딜레이트 EMS12300
오스뮴 테트록사이드 1g 크리스탈EMS19100흄 후드
아세톤JUNSEI1B2031
Spurr 매체TED PELLA18108
초소형 라이카UCT
우라닐 아세테이트EMS22400유해 화학 물질
납 구연산염EMS17900
투과 전자 현미경히타치H7600
니켈 그리드EMSG200-Ni
구리 그리드EMSG200-Cu
글리신SIGMA022K5404
인산염 완충액 식염수SIGMAP4417
소 혈청 알부민Aurion25557
1차 항체정제 수동 
정제된 항인간 CD274 (B7-H1, PD-L1) 항체BioLegend329710전체 마운트 Immumogold
정제 마우스 IgG2b, κ 아이소타입 CtrlBioLegend401202전체 마운트 Immumogold (Control)
2nd 안티 마우스 igG 활용 9-11nm 금 입자시그마G7652
투과 전자 현미경 JEOLJEM2200FS
글로우 배출기JEOLJFC1100E
탄소 그리드EMS121119
파라포름알데히드EMS19210
Formvar 탄소 코팅 구리 그리드 (200 meh)EMSFCF200-CU
Formvar 탄소 코팅  니켈 그리드 (200 mesh)EMSFCF200-NI
에만 사용

참고문헌

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  1. Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
  2. Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
  3. Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield....

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재인쇄 및 허가

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