방법 논문

태에서 Autophagy의 규제에 모성 비만과 관련 된 염증의 효과 연구 하는 기본 인간 Trophoblast 모델

DOI:

10.3791/56484

⸱

2017년 9월 27일

 ,  , 
1Knight Cardiovascular Institute, Oregon Health and Science University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Oregon Health and Science University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기에 제시 된 인간 placental villous 조직의 기본 세포 배양에 대 한 cytotrophoblasts의 격리 다음 샘플링에 대 한 프로토콜이입니다. TNFα와 trophoblasts의 치료 비만 자궁내 환경에 염증이 분자 대상 산 모 비만과 염증 반응과에 의해 규제의 발견을 촉진 한다.

초록

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산 모 비만 가능성이 autophagy의 dysregulation, 부분에서, 표시 될 수 있습니다 손상 된 태 반 기능에 의해 중재 불리 한 perinatal 결과의 위험 증가와 연결 됩니다. 비만 임신에서 반응과 autophagy 레 귤 레이 터의 식에서 벗어난 변화는 비만 및 임신과 관련 된 염증 과정에 의해 통제 될 수 있습니다. 여기서 설명 하는 것은 villous 조직의 샘플링 및 기본 세포 배양에 대 한 용어는 인간의 태 반 으로부터 villous cytotrophoblasts의 격리에 대 한 프로토콜이입니다. 이것은 종양 괴 사 인자 알파 (TNFα), proinflammatory cytokine은 고가의 비만 마른 임신에서 기본 trophoblasts 치료 하 여 비만 자궁내 환경에 선 동적인 환경 시뮬레이션을 위한 방법으로 뒤 임신입니다. 여기에 설명 된 프로토콜의 구현을 통해 외 인에 노출 있다 TNFα 루비콘, 여성 태아와 마른 임신에서 trophoblasts에서 autophagy의 부정적인 레 귤 레이 터의 표현을 조절. 다양 한 비만 자궁내 환경에 생물학적 요인 trophoblasts 중요 한 통로 변조 가능성이 유지,이 비보 전 시스템은 식 패턴 vivo에서 관찰 된 경우 결정 하는 데 특히 유용 모성 비만과 인간의 반응과에서 TNFα 신호의 직접적인 결과입니다. 궁극적으로,이 방법은 월급 autophagy 및 다른 중요 한 세포 경로에 영향을 미칠 가능성이 있는 trophoblasts 모성 비만과 관련 된 염증의 규제 및 분자 의미 밖으로 구문 분석 하는 기회 태 반 기능입니다.

서론

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비만 과잉 지방이 많은 직물 및 양분 가용성에서 형태소 분석 만성 낮은 학년 염증이 특징 염증 성 상태입니다. 비만, proinflammatory cytokines는 상승 된 대사 조직 뿐만 아니라 체계적으로 순환. 증거의 강력한 시체는 TNFα 크게 상승 비만의 설정에서 의미와 함께 인슐린 저항성 및 대사 부전1에 보이고 있다. TNFα의 활성화는 또한 암 등 면역, 그것에 게 매력적인 치료 대상2를 만드는 조건에서 질병 병 인에 기여.

염증 비만에서 임신, 또한 proinflammatory 상태3,4에 의해 복합입니다. 그것은 이전 보였다 태 반 TNFα 콘텐츠 여성 태아와 임신에서 모성 adiposity와 증가. 또한, TNFα 처리 TNFα는 성적으로 동종이 형 방식으로5placental 신진 대사 조절에 관여 하는 것을 건의 하는 여성만 아니라 남성 trophoblast 셀에 미토 콘 드리 아 호흡을 억제. 산 모 비만 임신 동안에, 사 산를 포함 하 여 남성 태아는 가장 취약

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프로토콜

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placentae 프로토콜에서 동의와 제도적 검토 보드 오 레 곤 건강 과학 대학의 포틀랜드, 오 레 곤,에 의해 승인 아래는 노동 및 배달 단위 대학 병원에서 수집 된는 환자.

1. 태 반 조직 컬렉션

  1. 준비
    참고: 조직에서 발생 하는 모든 장비는 살 균 되어야 합니다.
    1. 121에서 60 분 동안 압력가 마로 소독 하 여 해 장비를 소독 ° c.
    2. 개인 보호 장비 (PPE) 사용: 연구실 코트/가운/스크럽, 장갑, 그리고 얼굴 방패 또는 고글 마스크.
    3. 물 목욕과 37로 설정에 ° c.
    4. 따뜻한 두 50 mL 원뿔 튜브, 완전 한 미디어의 각 포함 25 mL (Iscove ' s 수정 Dulbecco ' s 매체 보충 10 %FBS 1% 페니실린/스, 표 3) 37 ° C 물 욕조에.
    5. 정보 환자 동의 제왕 절 개에 의해 배달 직후 태 반 얻기.
    6. 될 태 반에 익숙해져야 합니다. 탯 태아 측 (chorionic 접시)에 삽입 되 고 혈관은 탯 삽입 사이트에서 밖으로 발산 하는 보실 수 있습니다. 반대 측 어머니 쪽, 또는 기저 판입니다....

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결과

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엎드려 서에서 인간의 반응과 용어 (임신 전 체 질량 지 (수 BMI) < 25) 단순한 임신 여성 자손을 들고 어머니 수집 하 고 제왕 절 개 (노동) 배달의 15 분 이내 샘플링 했다. 반응과 석 회화 및 일반적인 개발의 부재에 대 한 조사 했다: 모양, 15-25 cm 직경, 그리고 탯 줄의 중간에 삽입 사이에서 라운드 탯 300-600 g와 막 제거 무게는 태 반입니다. Villous 조직 기초 및 chorionic 판 (그림 1), 태 반 전체에서 2-3 샘플에서 저조한 villous 조직의 기본 trophoblast 격리에 대 한 자료를 시작으로 약 100 g에서 해 부 했다. 20 분 이내 villous 조직 샘플링, 설명 된 대로 기본 trophoblasts 분리 절차 시작 되었다 여기, 0.8-사이 저조한 1 x 108 가능한 셀. 세포는 3 x 106 (3.......

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토론

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태 반, 태아의 성장 조절에 대 한 책임6비만 환경 손상 된 기능을 전시 한다. Trophoblasts의 높은 신진 대사 요구에도 불구 하 고 산 모 비만과 반응과 미토 콘 드 리아 기능 장애 호흡6,19전시. Placental 대사에서 변화는 합병증과 비만 임신3,,67에서 관찰 된 불리 한 태아 결과의 발생률이 증가에 기여할 수 있습니다. Autophagy는 또한 산 모 비만 반응과에 손상 됩니다. 남성 태아와 비만 임신에서 반응과 기능 장애 autophagic 플럭스 autophagosomes13의 축적에 의해 입증으로 표시. 최적의 autophagic 유량을 유지 하는.......

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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저자는 여자를 들이 연구에 대 한 그들의 반응과 기증 감사 합니다. 우리 또한 조정 반응과의 컬렉션에 대 한 노동 및 배달 부 오 스 모자와 태아 연구 팀에 감사. 우리는 에릭 왕, 박사, 그리고 켈리 쿠오, MD 지원 감사 하 고 실험 방법 및 최적화에 도움이.

이 작품은 NIH HD076259A (오전)에 의해 투자 되었다와 AHA GRNT29960007 (오전).

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10X HBSSGibco14185-052
CaCl2(무수)시그마-알드리치C1016-100G
MgSO4 (무수물)Sigma-AldrichM7506-500G
HepesFisher ScientificBP310-500
TrypsinGibco15090-046
DNAseWorthington Biochemical Corp.
프로테아제/포스파타제 억제제Thermofisher Scientific88668
Tris HClInvitrogen15506-017
EDTAInvitrogen15576-028
NaClSigma-Aldrich,S7653-1KG
, SDS,Fisher ScientificBP166-600
소듐 데옥시콜레이트.피셔 사이언티픽AAJ6228822
트리톤 X-100시그마-알드리치X100-500ML
이스코브 s 수정된 둘베코' s Medium (IMDM)Gibco12440-046
Fetal Bovine Serum (FBS)Corning35-010-CV
Neonatal Calf Serum (NCS)Gibco26010-074
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)Gibco15140-122
10% FormalinFisher Scientific23-427-098
DMSOSigma-AldrichD2650-100ML
TNF&알파;Sigma-AldrichSRP3177-50UG
인산염 완충 식염수(PBS)Gibco70013-032
K2EDTA vacutainer 혈액 채취 튜브BD366450
Percoll (Density Gradient Media, DGM)GE Healthcare17-0891-01
6웰 플레이트Corning353046
Cell 스트레이너Fisher Scientific22363549
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, 천연Fisher Scientific22363352
Trypan BlueCorning25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot CellBio-Rad1658033
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% Bio-Rad1610175
Mini-Protean 3 멀티 캐스팅 챔버Bio-Rad1654112
4X Laemmli 샘플 버퍼Bio-Rad1610747
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148-100ML
글리신Bio-Rad1610718
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ML
인스턴트 무지방 분유카네이션
루비콘 (D9F7) 토끼 mAb세포 신호 기술8465S
단클론 항 -β -마우스Sigma-AldrichA2228-100UL
IgG, HRP 결합 항체세포 신호 기술7074S
안티 마우스 IgG, HRP 연계 항체세포 신호 기술7076S
SuperSignal West Pico PLUS 화학발광 기판Thermo Scientific34578
LS002139: , , , : , , , 에서 생성 된 Actin 항체

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
  2. van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
  3. Yogev, Y., Catalano, P. M.

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