방법 논문

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

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⸱

DOI:

10.3791/56487

⸱

2017년 10월 18일

 ,  , 
1Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

이 논문에서

요약

여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

초록

모델 호스트 꼬마 선 충 을 사용 하 여 미생물의 상호 작용을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 미생물은 소장 질환에 대 한 기본 위치를 만드는 다이어트를 통해 소개 합니다. 선 충 장 구조상으로 그리고 기능적으로 포유류 창 모방 이며 투명 한 식민의 현미경 연구 의무가 만들기. 여기 우리가 병원 체 질병과 죽음을 발생할 수 있습니다 보여줍니다. 변경 된 독성을 나타내는 미생물 돌연변이 식별할 수 있습니다. 생물 스트레스를 보존된 타고 난 응답은 C. 선 충 호스트 타고 난 면역 상호 작용의 측면을 우수한 시스템. 우리는 듀얼 산화 효소 유전자에 있는 돌연변이와 호스트 반응성 산소 종 생성 수 없습니다 및 미생물 모욕을 저항할 수 없습니다 보여줍니다. 추가 제시 생존 분석 결과의 다양성 미생물 성장 억제제의 효과 연구에 사용할 수 있습니다 표시 하 여 설명 합니다. 이 분석 결과 또한 새로운 항진균 제의 개발에 대 한 대상으로 곰 팡이 독성 요소를 발견 하 고 더 호스트-미생물 상호작용을 폭로 하는 기회를 제공 사용할 수 있습니다. 이 분석 결과의 디자인 잘에 빌려준다 높은 처리량 전체 게놈 스크린을, 나중에 사용할 곳을 알아내는-보존 웜 수 하면 공부 비용 효과적이 고 매력적인 전체 동물 모델.

서론

C. 선 충 50 년 이상에 대 한 강력한 모델 생물으로 사용 되었습니다. 1960 년대, 남아 프리 카 공화국 생물학자 시드니 브 레너 선 충에서 세포 및 동물 생물학의 다양 한 측면을 연구 과학자의 긴 계보에 대 한 방법을 포장 신경 개발 공부 C. 선 충 의 사용을 개척. 크레이그 멜로 앤드류 불 그들의 RNAi 작업1에 대 한, 로버트 Horvitz 및 기관 발달에 apoptosis2,3,4, 그들의 작품에 대 한 존 Sulston 마틴 챌 노벨상 수 상자를 포함 하는이 계보 녹색 형광 단백질5에 그의 작품은. 이 모델 생물 전통적으로 지난 15 년 동안 분자 및 발달 생물학을 공부 하는 데 사용 되었습니다, 비록 연구원 C. 선 충 녹을 포함 하 여 다양 한 인간의 병원 균의 생물학 조사를 사용 하 여 시작 녹 농 균, 황색 포도상구균, 살 모 넬 라 enterica, Serratia marcescens6,7,8,,910. 이 연구 결과 밝혀 많은 인간 병원 체 상호 작용에 관련 된 메커니즘의 보존은 또한 선 충, 하지만에서이 모델 생물11,12에 고유한 일부 면역 메커니즘이 있습니다. 자연 속에서 C. 선 충 에서 다양 한 위협 으로부터 섭취 한 병원 체는 토양에 존재 하 고이 진화 하 고 그것의 창 자 루멘에 세련 된 타고 난 면역 체계를 유지 하는 강한 선택적인 압력을 제공 했다. 유전자 및 창 자 루멘의 보호에 관련 된 메커니즘의 대부분은 또한 높은 포유류11,13에 존재 하는 높은 보존 요소에 의해 조율 된. C. 선 충 은 따라서 살 모 넬 라 enterica14, Shigella boydii15또는16 비 브리 오 콜레라같이 위장 병원 체를 공부 하기 좋은 모델을 나타냅니다.

여기 우리는 C. albicans같은 전염 성 요원 연구 모델 호스트로 C. 선 충 의 놀라운 다양성을 강조 표시 합니다. C. 선 충 모델 호스트 저렴 하 고 일반적으로 칸디 다42를 공부 하는 데 사용 되는 마우스 모델 보다 시간이 소요 되는 독성에 대 한 높은 처리량 검열 수 있습니다.

이 연구에서 우리는이 모델 및 assosiated 생존 분석 결과 사용할 수 있는 안정적으로 호스트 타고 난 면역 이펙터 중화 감염, 독성, 드라이브 병원 체 결정 하는 중요 한 공부에 대 한 표시 및 약리 화합물 수 있는 병 인에 개입. 앞에서 설명한 분석 실험에 비슷하지,이 방법은 죽음43,44만 성인 보다는 성인, 애벌레 단계에서 동물의 일생 동안 공부 하는 병원 체에 노출의 수단을 제공 합니다. 요약 하면, 우리의 C. 선 충 - C. albicans 모델 뿐만 아니라 감염 및 면역 유전 기초 연구 뿐만 아니라 치료 적 개입에 대 한 새로운 화합물을 식별 사용할 수 있는 다양 하 고 강력한 도구입니다.

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프로토콜

1. 선 충 류 성장 매체 (NGM)의 준비

  1. 대 1 L 미디어의 결합 20 g 한 천, 2.5 g 유기 질소 소스 (예:, bacto 펩), 그리고 3 세대 2 L 플라스 크에 염화 나트륨. 메 마른 물 975 mL을 추가.
  2. 추가 메 마른 저 어 바에서
      입니다. 15 분;에 대 한 자동 미디어 pourer, 고압 배관 및 미디어를 사용 하는 경우 미디어 해야 압력가 마로 소독에 대 한 더 이상 높은 볼륨 이루어집니다.
  3. 저 어 접시에 미디어를 설정 하 고 시원한 수.
    1. 미디어 aseptically (약 60 ° C) 터치 따뜻한 되 면 추가 1 mL의 1 M MgSO 4 ● H 2 O, 1 mL의 1 M CaCl 2, KPO 4, 25 mL 및 에탄올에 0.5% 콜레스테롤의 1 mL.
    2. 붓고 미디어 (손으로 또는 자동 펌프) 층 류에서 35 m m x 10 m m 멸 균 페 트리 디쉬. 사용 하기 전에 1-2 일에 대 한 후드 건조 허용.
      참고: 접시는 오염을 방지 하기 위해 4 ° C에 저장 되어야 합니다.

2. 웜 선택 만들기

  1. 알루미늄 와이어의 1.5 cm 조각 잘라. 신중 하 게 파스퇴르 피 펫의 끝에 삽입이 길이 약 0.5 c m.
    1. 천천히 와이어는 안전 하 게 준수는 피 펫 피 펫 팁의 원래 모양에 타협 하지 않고 때까지 불꽃에 회전 하 여 유리 피 펫 팁을 녹여 분 젠 버너 또는 알콜 램프를 사용 하 여.

3. 대장균 문화 준비

  1. Luria 국물 200 mL에 대장균 스트레인 OP50의 단일 식민지 접종 메 마른 루프를 사용 하 여. 37에 떨고 함께 밤새 품 어 ° c.
  2. 액체 문화 사용한 다음 날 때 사용 중인 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
    참고: 대장균 스트레인, OP50를 위한 음식 근원으로 사용 됩니다 C. 선 충. 이 문화에 대 한 사용할 수 있습니다 몇 개월 4에 저장 될 때까지 ° c.

4. 필수 C. 선 충 유지 보수

  1. 격판덮개의 센터에 준비 된 OP50 액체 문화의 약 50-100 µ L를 안보 여 NGM 대장균과 한 천 배지를 준비 하는 씨.
  2. 접시를 커버 하 고 24 시간 실 온에서 건조 하도록 허용. 일단 건조, 접시 하룻밤 급속 한 성장에 대 한 37 ° C에 또는 느린 성장을 원하는 경우, 실내 온도에 유지.
  3. 중 접시에 벌레를 추가 " 청크, " (프로토콜 단계 5 참조 " 청크와 따기 웜 "), 개별적으로, 벌레를 따기 또는 접시에 직접 웜 계란 배치 (프로토콜 단계 6을 참조 " 계란 준비 ").

5. 청크와 따기 웜

참고: " 청크, " C. 선 충 유지 보수에 공통 되는 연습을 말합니다. NGM agar 플레이트 웜, 포함 된 부분의 절단 하 고 또한 많은 과정에서 웜 전송 따라서 새로운 접시에이 조각을 전송, 포함 됩니다. 오염 또한 이와에서 접시에서 절단할 수 있습니다. 벌레를 따기는 agar의 무결성을 유지 하는 벌레는 agar에 구멍에서 손실 될 수 있기 때문에 중요 하다. 또한, 그것은 용 해는 agar 나 벌레를 방지 하기 위해 플레이트를 만지기 전에 냉각 선택 허용 하는 것이 중요.

    많은 양의 새로운 접시에 벌레를 신속 하 게 전송 하려면
  1. NGM agar 주걱을 사용 하 여 선택한 웜 포함의 조각 잘라. 잘라 조각을 제거 하 고 그것에 게 아래로 얼굴을 배치 새로운 접시에 OP50의 잔디밭의 가장자리에.
  2. 전송 프로토콜 단계 8.2에서 아래와 같이 개별적으로 웜 " 생존 분석 결과, " 벌레를 사용 하 여 선택. 때까지 빨간 벌레 선택에 와이어를 불꽃. 불꽃에서 그것을 제거 하 고 그것을 몇 초 동안 냉각 허용.
  3. 선택에 와이어를 다루는 새로운 접시에 성장 하는 OP50 문화의 잔디밭을 긁어 부드럽게, 선택에는 와이어를 사용 하 여.
  4. 점성 문화는 와이어의 끝을 다루는 게 벌레 선택의 끝에 막대기, 따라서 부드럽게 강타해 모션을 사용 하 여 선택한 웜 데리.
  5. 선택한 벌레 수집 되 면 부드럽게는 agar에 걸쳐 문화를 강타해 새로운 접시에 그들을 놓습니다. 장소 선택에 남아 있는 문화를 제거 하는 화 염으로 와이어.

6. 계란 준비

  1. 따기 또는 청크 프로토콜 5 단계에 설명 된 대로 약 20 성인 동물 (20 ° C에서 성장 될 때 부 화 후 약 2-3 일) 장소 " 청크와 따기 웜, " 50 시드 접시에 E. 콜라가 긴장, OP50의 µ L.
  2. 계란을 수집 하는 1-2 일 후 M9 버퍼의 10 mL와 함께 접시를 홍수. 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 소용돌이 그리고 부드럽게 계란 OP50 또는 성인 동물에 붙어 출시를 한 접시에 내용을 선동. 계란과 성인을 포함 하는 모든 액체를 수집.
  3. M9 전송 및 OP50 솔루션으로 15 mL 원뿔 튜브. 2100 x g 2 분에 15 mL 원뿔 튜브 원심
  4. OP50 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한의 약 9 mL를 발음.
  5. 살 균 물 2 mL, 표 백제의 1 mL 및 0.25 M NaOH의 1 mL에 펠 릿 resuspend.
  6. Lysed 성인 동물의 대부분 (약 70%)이 나타날 때까지 하는 반전으로 부드럽게 혼합; 일반적으로 계란 그대로 유지이 짧은 표 백제 처리 하는 동안 그들의 포탄 때문에. 990 x g 2 분에 원뿔 튜브 원심
  7. Aspirate 상쾌한은 펠 렛을 방해 하지 않고입니다. M9 버퍼의 10 mL에 펠 릿을 다시 중단.
  8. 방해 펠 릿 없이 2 분 Aspirate 상쾌한 990 x g에 원뿔 튜브 원심. M9 버퍼의 200 µ L와 다시 일시 중단 공.
    참고: 계란 준비 여러 실험 필요할 수 있습니다. 그들은 너무 오래를 위한 표 백제에 노출 된 경우 계란을 파괴 수 있습니다. 알이 부 화 하지 않습니다, 경우 표 백제 솔루션에서의 농도 감소 또는 감소 표 백제에 노출의 기간.

7. 감염 플레이트 설정

  1. 멸 균 시험관에 YPD의 3-5 mL를 분배 하 고 메 마른 루프를 사용 하 여 칸디 다 albicans에의 한 식민지와 예방.
    1. 약 16-18 h 30에 대 한 회전 드럼에 튜브를 배치 ° c.
  2. 라벨 1 개의 1.5 mL microfuge 관 C. albicans 및 다른 OP50를 포함 포함 하. 각 빈 관의 무게 기록.
    1. 하룻밤 C. albicans 문화 관으로의 장소 500 µ L 표시 된 C. albicans (3.1 단계)에서 하룻밤 OP50 문화의 1500 µ L OP50를 표시 하는 튜브에.
    2. 16100 g. Aspirate 상쾌한 방해 펠 릿 없이 x에서 10 분 원심 분리기.
    3. 다시 살 균 물의 500 µ L 각 펠 릿을 일시 중단합니다. 16,100 x g.에서 5 분 동안 원심 분리기
    4. Aspirate 상쾌한은 펠 렛을 방해 하지 않고입니다. Microfuge 관의 최종 무게 기록.
    5. 최종 무게에서 microfuge 관의 초기 무게를 빼서 각 펠 릿의 무게를 결정.
  3. 살 균 수를 사용 하 여 다시 일시 중단 10 mg/ml, C. albicans 펠 릿 및 200mg/mL에 OP50 펠 릿. 스의 50 mg/mL 해결책의 10 µ L, OP50 문화의 2.5 µ L, 0.5 µ L의 C. albicans 문화, 및 살 균 물 7 µ L를 결합 하 여 믹스 마스터 감염 확인.
    1. 컨트롤 플레이트, 살 균 물 C. albicans 문화의 볼륨을 대체 하 여 마스터 믹스 만듭니다. 감염 믹스 또는 OP50는 micropipette를 사용 하 여 NGM 센터 플레이트에 제어 솔루션의 20 µ L 씨.
      참고: 약 100 웜 분석 중 통계적 의미를 확인 하기 위해 필요 합니다. 이 분석 결과 3 중에서 일반적으로 실행 됩니다. 따라서, 감염 믹스 x 3.2 뿐만 아니라 제어 솔루션 x 3.2 이루어집니다. 이러한 믹스 약간 넘는 3 전체 20 µ L 오류를 위한 공간을 허용 하는 각 접시에 시드는 되도록 원래 배 되도록 만들어집니다. 이 마스터 믹스 벌레의 인 두 너무 작으면 초기 애벌레 단계 (L1-L3) C. albicans 소비 때문에 만들어집니다. 에 대 한 노출 fluconazole ( 그림 3B) 같은 약리 에이전트, 에이전트는 감염 혼합물에 소개 된다. 에이전트의 농도 경험적으로 결정 됩니다. 그러나 예를 들어 그림 3B, 50 µ M에서에서 0, 12.5, 25, 50, 100 µ M Fluconazole 했다 또한 Fluconazole 표시 됩니다 동일한 프로토콜을 사용 하 여 테스트.

8. 항문 영역 변형 (Dar) 표현 형 및 생존 분석 결과의 분석

  1. 시각화 Dar 형
    참고: Dar L3 단계에서 그리고 저쪽에 최고의 시각 이다. 스 웜 ( 그림 2A), 시간이 지남에 따라 더 저명한 되는 게시물 항문 지역에 작은 돌출으로 선물 한다.
    1. 확인 동물에 신속 하 게 해 부 현미경의 스테이지에 접시를 활용 하 여 다 르, 스 지 없이 동물 스와 동물 것 해야 하는 동안 즉시 뒤로 이동 하는 경우 반복 반대로 그들의 방향 또는 그들은 도청의 라운드 그렇게을 모두 할 것입니다.
  2. 생존 분석 결과
    1. 완료 계란 준비 프로토콜 6 단계에서 앞에서 설명한 " 계란 준비 ". 계산 절 개 범위에서 계란 그리고 µ L 당 약 5-6 건강 한 계란의 농도 달성 될 때까지 M9 계란 솔루션을 희석. 세균성 문화 접시의 측면 사이 지역에서 준비 NGM 접시에 약 30 계란을 포함 하는 20 µ L 샘플 분배를 피 펫을 사용 하 여 (달걀과 벌레 음식, OP50, 두 가지 점이에 있다).
    2. 품 20 ° c에서 48 h에 대 한 번호판입니다. 해 부 현미경 아래 스와 벌레의 수 뿐만 아니라 각 접시에 라이브와 죽은 성인 벌레의 수를 계산 합니다. 스와 % 기록.
    3. 머리에는 알루미늄 와이어 또는 도청에 의해 도청 되 고 응답 하지 않으면 죽은 동물을 고려.
    4. 다른 매일 전송 나머지 어른 벌레 따기 프로토콜 5 단계에 설명 된 대로 " 청크와 따기 웜, " 새로운 감염 또는 컨트롤 플레이트에. 이 시점에서 필요한 경우 수행 생존 분석 결과 매일 라이브, 죽은, 그리고 누락 된 벌레의 수를 추적 하 여.
      참고:이 분석 결과 수 있습니다 실행 2 주 동안, 계란 준비 시작. 또한, 계란 솔루션 해야 하지 수 적절 세균성 문화에 솔루션은 OP50를 죽 일 수 있는 백제의 흔적을 포함 수 있습니다. 솔루션 또한 있어야를 적절 하 게는 플레이트의 가장자리에서 약 0.5 c m로 계란 접시와는 agar의 측면 사이 갇혀 될 수 있습니다. 또한, 벌레의 급속 한 확산으로 인해 새로운 접시에 성인 전송은 그들의 자손에서 그들을 분리 하는 중요 한.
  3. 생존 분석
    1. 생존 곡선 분석 소프트웨어를 사용 하 여 결과 분석 (재료의 목록 참조).
    2. 비교 생존 곡선 Grehan Breslow Wilcoxon 메서드를 사용 하 여 (가정 하 초기 생존 시대에서 데이터는 최신 시간 보다 정확, 체중 데이터 따라) 뿐만 아니라 Logrank 통계 도구 45.
      참고: 예를 들어 그림 4B에서 -C, C. albicans의 돌연변이로 치료 하는 벌레의 생존은 그에 비해 isogenic 야생-타입 컨트롤 또는 complementarystrains 치료.

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결과

병 인 분석 결과 (그림 1) C. albicans 및 C. 선 충 을 사용 하 여 이전 우리의 실험실17,18 및20다른 연구소19,의해 설명 하고있다. C. 선 충 C. albicans 셀 벌레에 의해 신속 하 게 섭취 하 고 느린 운동을 일으키는 창 자 루멘에 축적을 보여주는 C. albicans 독성 연구를 사용 하 여 적중이 시연 항문 변형 지역 (Dar) (그림 2A), (그림 2B) 외 음부의 붓기, 고 소장 (<...

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토론

우리가 설명 하는 C. albicans 에 일생 노출 C. 선 충 감염 및 생존 시 금 하는 방법 다른 병원 체를 테스트를 수정할 수 있습니다. 다른 세균 이나 곰 팡이의 액체 문화 만든 하 고 비슷한 방식으로 C. 선 충 을 먹이 수 있습니다. 또한, 직렬 감염 분석 될 수 있습니다 설명, 한 병원 체에 애벌레를 먼저 노출 하 고 다음 성인 기에 도달 후 별도 병원 체를 포함 하는 새로운 접시에 동물을 전송 하 여.

이 분석 결과 수행 하는 동안 그것은 타이밍에 주의 깊은 관심을 지불 하는 것이 중요입니다. 첫째, 분석 결과 대 한 알을 수확 하기 위해 계란 준비를 완료 하는 때 그것은 계란 표 백제에 노출 되는 시간의 양을 제한 하는 중요 한. 계란을 풀어 표 백제 솔루션에서 성인을 분해 하는 데 필요한 시간의 양은 다릅니다. 표 백제 솔루션을 관리, 직후 웜 솔루션 해 부 현미경 밀접 하 게 지켜 수 해야 합니다. 벌레의 약 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품에서 수행 하 고 우스터 폴 리 테크닉 연구소에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
한천(과립, 세균 등급)Apex BioResearch 제품20-248
알루미늄 와이어(95% Pt, 32 게이지)Genesee Scientific59-1M32P
Axiovision Zeiss 도립 현미경Axiovision Zeiss
Bacto-PeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
C. elegans strain Bli-3Caenorhabditis Genetics CenterBli-3(e767) CB767
염화칼슘Fisher ScientificBP51-250
콜레스테롤, 시그마 등급, 최소 99%SigmaC8667-25G
일회용 배양 튜브(20 x 150mm)FIsherBrand14-961-33
해부 현미경(NI-150 고강도 조명기)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)GraphPad Software
LB Broth (Miller's)Apex BioResearch Products11-120
Magnesium SulfateFisherScientific 10034-99-8
Medium Petri Dish (35 X 10 mm)Falcon
353001 인산칼륨 일염기성시그마P0662-500G
염화나트륨피셔 사이언티픽BP358-1
인산나트륨피셔 사이언티픽BP332-500
야생형 C. 알비칸스 SC5314ATCCSC5314
야생형 C. 예쁜꼬마선충Caenorhabditis GeneticsCenter N2

참고문헌

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