감염 성병 제조 및 방지를 위한 Griffithsin 수정 섬유 장비의 특성

요약

이 원고 조작 하 고 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 감염에 대 한 강력한 접착제 및 항 바이러스 활동을 보여 주는 Griffithsin 수정 폴 리 유산 공동 glycolic acid () electrospun 섬유를 특성화 하는 절차를 설명 합니다. 생체 외에서. 합성 하는 데 사용 하는 방법 표면 수정, 결과 형태, 활용, 특성 및 표면 수정 섬유에서 Griffithsin의 탈 착에 설명 되어 있습니다.

초록

Electrospun 섬유 (EFs) 널리 다양 한 치료 애플 리 케이 션;에 사용 되었습니다. 그러나, 그들은 단지 최근에 적용 되었을으로 방지 하 고 치료 성적으로 기술 전송 감염 (STIs). 또한, 많은 EF 기술 biofunctionality를 얻으며 표면을 활용 하 여 상대적인 활성 에이전트를 캡슐화에 초점. 여기 조작 및 poly(lactic-co-glycolic) 산 (PLGA) electrospun 섬유, 강력한 항 바이러스 lectin Griffithsin (GRFT)와 표면 수정 하는 방법을 설명 합니다. PLGA는 약물 전달의 뛰어난 화학 및 생체 특성 때문에 널리 사용 된는 FDA 승인 중합체 이다. GRFT 자연, 강력한, 및 안전 lectin 인간 면역 결핍 바이러스 1 (hiv-1) 형을 포함 하는 수많은 바이러스에 대 한 광범위 한 활동을 소유 하는. 결합 될 때, GRFT 수정 섬유 체 외에에이즈-1의 강력한 비활성화를 증명 하고있다. 이 원고에서는 조작 하 고 GRFT 수정 EFs를 특성화 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, PLGA 섬유 비 계를 만들 electrospun입니다. 섬유는 이후에 표면 수정 1을 사용 하 여 GRFT-에틸-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 및 N-hydroxysuccinimide (NHS) 화학. 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 크기와 표면 수정 공식의 형태를 평가 하기 위해 사용 되었다. 또한, gp120 또는 조류 (하)-기반된 ELISA, 활용 된 GRFT GRFT 섬유 표면에서 탈 착의 양을 계량 하 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 섬유를 서로 다른 단백질의 다양 한 표면 수정 조작 하 더 광범위 하 게 적용할 수 있습니다.

서론

국 소 전달 플랫폼으로 EFs 사용 하 여 성병을 줄일 가능성이 있다. 현재, 36 백만 이상의 사람들이 HIV에 보고 2015 혼자^1,2의 이상 2 백만 새로운 케이스와 함께 살고 있다. 또한, 포진 심 플렉스 바이러스 2 (HSV-2) 감염의 영향을 수백 전세계 사람들의 수백만 입력 하 고 2-5 배³HIV의 수집을 향상을 보여줘 왔다. 이 관계 HSV-2 감염 및 HIV 취득으로 인해 여러 성병에 대 한 동시 보호를 제공 하는 새로운 활성 에이전트 개발에 상당한 관심이입니다. 또한, 이러한 항 바이러스 대리인의 납품을 개선 하기 위해 새로운 차량의 개발 추가 보호 및 치료 효능을 향상 시키기 위해 잠재력을 제공 합니다. 이 목표를 향해 EFs V-1와 h s V-2 감염의 보급을 줄이기 위해 새로운 배달 플랫폼으로 조사 되어 있다.

지난 2 년 동안 EFs는 약물 전달 및 조직 공학⁴의 분야에서 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다. 종종, 생체 고분자는 쉽게 치료 응용 프로그램을 변환할 선택 됩니다. 고분자 EFs를 조작 하 선택 된 폴리머는 유기 용 제 또는 수성 솔루션에 폴리머 hydrophobicity⁵의 정도 따라 녹입니다. 관심의 활성 에이전트 다음 전기 과정 이전 또는 수성 솔루션에 추가 됩니다. 폴리머 솔루션 다음 주사기로 발음 이며 천천히 전류 따라 나옵니다. 이 프로세스는 일반적으로 폴리머 섬유 시트 또는 원통형 macrostructures (그림 1)와 마이크로-나노 규모⁶에서 배열 하는 섬유 직경에에서 발생 합니다. 가장 치료 응용 프로그램에 대 한 활성 에이전트 전기 과정에서 섬유 안에 통합 되 고 확산 및 후속 섬유 저하를 통해 섬유에서 해제 됩니다. 속도 저하 또는 자료의 다른 유형의 폴리머를 사용 하 여 변경 될 수 있습니다 또는 폴리머 혼합⁷을 독특한 화학 및 물리적 특성 부여 하 고 거의 모든의 캡슐화를 추진 하 고 원하는 릴리스 프로필을 설정 하 복합. 따라서, EFs는 작은 분자 약물 및 단백질, 펩 티 드, oligonucleotides, 및 성장 요인^6,,89를 포함 하 여 생물 학적 에이전트의 배달에 도움이 입증 했습니다.

STI 예방 분야에서 EFs 최근 사용 된 통합 하 고 지속 또는 유도할 수 있는-릴리스 항 바이러스 대리인^{10,,1112,13,14의 제공 ,15,,1617,,1819}. 초기 연구 중 하나에서 전화 응답 섬유 에이즈-1¹¹에 대 한 보호의 온-디맨드 방법으로 활성 에이전트 (FRT) 여성 재생산 지역 내 환경 변화에 대응을 출시 개발 되었다. 이후, 다른 연구 조사 폴리머 혼합 폴 리 에틸렌 산화물 (PEO)와 폴 리-L-젖 산 (PLLA), 에이즈-1 예방 및 피임 생체 외 ^{에 대 한 항 바이러스 및 피임 제의 가변 평가의 구성 12}. 추가 연구는 다음을 제공 하는 EFs의 타당성 증명: 작은 분자 antivirals¹⁴, 강한 릴리스 및 유연한 기계적 특성²⁰, 3 차원 배달 아키텍처^{21 연장} , 정자 침투¹², 그리고 다른 배달 기술¹³와 병합 하는 능력의 저해. 마지막으로, 이전 작업 일반적인 co-infective 바이러스, HSV-2와 에이즈-1¹⁴에 대 한 항 바이러스 제의 지속적인 배달에 대 한 고분자 섬유를 평가 했다. 이 연구에서는 폴리머 섬유 1 달까지 동안 그들의 구조를 유지 하 고 바이러스 항목에 대 한 물리적 방 벽을 제공 하 여 항 바이러스 배달 보완 활동을 제공. 이러한 결과에서 둘 다 물리적 및 화학적 방해 바이러스 감염에 EFs를 사용할 수 있습니다 관찰 되었다.

가변 자료 속성을 고분자 EFs microbicide 배달에 대 한 매력적인 전달 플랫폼, EFs 표면 수정 건설 기계⁷을 다른 응용 프로그램에서 개발 되었습니다. 종종 역할 건설 기계 세포 재생²², 개선 하 고 조직 공학^23,24에 그들의 유틸리티를 강화 하는 세포 외 기질 (ECM)의 형태를 모방 하기 위해 eFs 사용 되었습니다. 섬유 고분자 폴 리-ε-caprolactone (PCL) 등으로 구성 되었으며 PLLA 성장 인자와 단백질 표면 수정 후 전기를 얻으며 ECM 같은 속성 증가 세포 접착 및 확산²⁵ 를 포함 하 여 ^{, 26}. 항균 성 표면 수정 EFs 특정 병원 성 박테리아^27,28의 성장을 방지 하기 위해 평가 또한. 이 다양성 및 생물 학적 효과 유도 하는 능력, EF 기술 다양 한 기계 멀티 기능을 제공 하는 분야에서 확장 하 고 있습니다. 그러나, 그들의 유틸리티 애플 리 케이 션의 다양성에도 불구 하 고 표면 수정 섬유 최근에 microbicide 필드²⁹탐험 되었습니다 있다.

방지 하 고 성병 치료 배달 신기술 개발 병행, 새로운 생물학적 치료제 개발 되었습니다. 가장 유망한 microbicide 후보자 중 하나 접착제 항 바이러스 lectin, GRFT³⁰입니다. 원래 빨강 조류의 종에서 파생 된, GRFT는 설명 했다 HIV, HSV-2, SARS의 강력한 억제제로 활동 뿐만 아니라 C 형 간염 바이러스^{31,32,,3334, 35 , 36}. 사실, 생물학 기반의 억제제 중 GRFT는 가장 강력한 반대로 HIV 활동 하면서 안정성과 질에서 문화 미디어 존재 활동 연락처³⁰, 시 거의 즉시 V-1를 비활성화 최대 10 일³⁷미생물. 더 최근에, 0.1 %GRFT 젤 자 HSV-2 도전, 그것은 HSV-2와 에이즈-1³² 에 대 한 보호의 첫 번째 줄에 대 한 유망한 후보 만들기에 대 한 마우스를 보호 하기 위해 표시 했다^{, 38}. 에이즈에 대 한 GRFT 물리적 항목^{38,,3940,41 방지 하기 위해 바이러스 성 봉투 표면에 gp120 또는 터미널만 노 오 스 N 연결 glycan 잔류물을 바인딩 하 여 감염을 억제 하는 특히, ,42}. 이 억제는 매우 강력한 IC₅₀s 3 ng/mL⁴³접근. HIV 감염을 억제 하는 것 이외에 연구는 또한 보여주었다 GRFT 바이러스³²의 세포-세포 확산을 억제 하 여 감염 HSV-2에 대 한 보호. 모든 경우에, GRFT 변성에 높은 저항을 시연, 바이러스 성 입자에 접착제를 되도록 표시 되었습니다. 마지막으로, GRFT 만들고 그것은 실현 가능성이 EFs와 함께 공동 관리에 도움이 테 (TFV) 및⁴⁴의 다른 antivirals 조합으로 시너지 활동을 시연 하고있다. GRFT의 강력한 속성은 우수한 생물학 기반의 항 바이러스 후보자, 있는 배달 EF 기술로 향상 될 수 있도록 합니다.

GRFT의 접착제 및 타고 난 항 바이러스 속성의이 지식을 활용 하 여, 고분자 섬유 비 계 설계 되었습니다, 이러한 속성을 제공 하는 바이러스 항목 저해²⁹의 첫 번째 계층을 통합 하. Cervicovaginal 점액 mucoadhesive mucin 상호 작용을 통해 주로 바이러스 전송 방해 하는 방법에 영감을 찾기, 우리 가정 했다 그를 발판으로 EFs를 사용 하 여 covalently GRFT의 높은 밀도와 표면 수정 GRFT 표면에 활용 된 것 수 고 entrypoint^45,,4647에서 바이러스를 비활성화. 여기 EFs는 플랫폼을 제공 하는 단백질 기반, 바이러스 성 접착제 비활성화 장벽 고정 발판으로 개발 되었다. 우리를 만드는 새로운 바이러스 "함정." 생체, 대, 고 내구성 폴리머 플랫폼 GRFT의 적 정량 항 바이러스 특성을 결합 하고자

이러한 목표를 달성 하기 위해 PLGA의 구성 하는 섬유 electrospun, 그리고 EDC-보 건국 화학 GRFT와 EF 표면 그 후 수정 하는 데 사용 되었다. PLGA 전기⁴⁸, 생체 적합성 및 비용 효율성에에서 그것의 광범위 한 사용 모델 폴리머 역임 했습니다. 또한, 표면 개 질 EFs의 큰 표면 영역을 이용 하 고 캡슐화 섬유 유틸리티⁴⁹를 극대화 하기 위해 결합 될 수 있는 유용한 대안을 제공 합니다. 전통적인 캡슐화 방법 어디 GRFT의 일부만 사용할 수 (그리고는 FRT만 뚜렷이 제시), 달리 표면 수정 수 있습니다 가능 치료의 전체 기간 동안 최대 bioactivity를 유지 하는 GRFT 또한, 전통적인 전기 방법으로 단백질 같은 친수성 화합물의 낮은 캡슐화 효율성 및 단백질 활동⁵⁰의 손실 될 수 있습니다. 따라서, GRFT 표면 수정 섬유 STI 감염에 대 한 보호 기능을 향상 하거나 전기와 함께 사용할 수 있는 유망한 대체 배달 방법을 제공할 수 있습니다.

프로토콜

1. 준비 및 제조 Electrospun 섬유 발판의

주의: 화학 증기 두건 .에 용 매 또는 폴리머 솔루션으로 모든 작업을 수행 해야 프로토콜을 시작 하기 전에 각 시 약의 물질 안전 데이터 시트를 참조.

Electrospin 3 mL 15 %w / w PLGA 폴리머 솔루션에 무게의 50: 50 폴 리 (유산 공동 glycolic 산) 720 mg (PLGA; 0.55 0.75 dL/g, 31-57 kDa) 10 mL 섬광 유리병에. 솔루션의 볼륨은 현재 연구에 사용 되는 일반적인 일괄 처리 크기에 따라.
참고: 폴리머 질량 주어진된 양의 용 매를 추가 하는 폴리머를 분해 하는 데 사용 하는 용 매에의 밀도 확인 하 여 계산 되어야 합니다. 용 매 Hexafluoro-2-프로 판 올 (HFIP)의 조밀도 1.59 g/mL 이다. 따라서, 용 매, 무게 4.8 g (3.0 x 1.59 g/mL)는 3.0 mL HFIP 필요의 볼륨에 따라. 15 %w / w HFIP PLGA의 일부분, 720 mg PLGA 3.0 mL HFIP (0.15 x 4800 mg = 720 mg)에 추가 되어야 합니다. %W / v, 보다는 오히려 %w / w 폴리머/솔루션을 사용 하 여의 장점은이 마지막 해결책의 정의 무게를 제공 합니다. 이 정의 된 무게 1.3 단계 용 매 증발의 경우 더 정확한 용 매 대체 가능.
1. 추가 3.0 mL HFIP 유리 섬광 유리병 (에서 단계 1.1) PLGA를 포함 하는 혈 청 학적인 유리 피 펫을 사용 하 여. 플라스틱 필름, 유리병 커버 다음 측정 하 고 기록 유리병 미사
2. 는 폴리머의 완전 한 해체를 위해 37 ° C에서 하룻밤 폴리머 정지 품 어. 어떤 용 매 증발, 유리병 질량 감소 추가 HFIP 유리병 단계 1.2에서에서 원래 질량에 도달할 때까지.
3. 인큐베이션, 후 준비 전기 장치 ( 그림 2 A). 모든 규모의 맨 드릴을 사용할 수 있습니다, 비록 여기 회전 25 mm 외부 직경 스테인리스 굴대는 수집기로 사용 되었다.
   참고: 큰 맨 드릴 직경 전기 솔루션의 동일한 볼륨을 주어 섬유 두께 줄일 것 이다.
4. 폴리머 솔루션 3 mL 주사기로 발음.
5. 무딘 18 게이지, ½ 인치 바늘 팁 주사기를 연결 하 고 바늘 팁에서 빈 headspace 제거 초과 솔루션 (일반적으로 0.25 mL) 분배.
6. 주사기 주사기 펌프에 놓고 2.0 mL/h. 악기 유량 설정
   참고:이 유량은 이전 기반 최적화이 대 한 폴리머 점도.
7. 폴리머 솔루션 +27의 전압을 사용 하 여 주사기 바늘과 electrospin에는 전원 연결 kV. 바늘 및 수집기 사이의 거리는 대략 25 cm ( 그림 2 B)로 설정 되어야 합니다.
   주의: 전기 프로세스 용 매 증기를 만듭니다. 증기 두건 또는 밀폐 장치 ( 그림 2)를 사용 하 여 유해한 증기 .을 제거
8. 전체 솔루션 electrospun 일단 전원 끄고 완전히 용 매를 증발 하는 추가 30 분에 대 한 회전 심 봉 수.
9. 차례 회전 심 봉 수집기와 곡 괭에서 섬유를 잘라 면도날을 사용 하 여. 블레이드를 사용 하 여 곡 괭에서 섬유를 부드럽게 껍질.
10. 레이블이 페 트리 접시에 electrospun PLGA 섬유를 수집 하 고 잔여 용 매를 제거 하는 desiccatorovernight에.

2. GRFT 섬유의 표면 수정

1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 2-(N-morpholino)의 준비 솔루션 ethanesulfonic 산 (MES 버퍼). 8 g NaCl, KCl 0.2 g, 1.44 g Na ₂ HPO ₄ 및 0.24 g KH ₂ 포 ₄ 초순 물 1 L에 용 해 하 여 PBS를 준비 합니다. 마찬가지로, 19.52 g MES (무료 산, MW 195.2) 분해 및 29.22 g MES 버퍼 준비 초순 물 1 L에 NaCl. 각 솔루션의 최종 pH는 7.2-7.5 5.0-6.0, 각각, pH 미터를 사용 하 여 확인 하십시오.
2. EDC (2 mM) 및 보 건국 (5mm)의 개별 작업 솔루션 준비.
   1. EDC와 보 건국 냉장고에서 제거 하 고 무게 전에 실내 온도에 equilibrate 수.
   2. 1.5 mL microcentrifuge 관으로 EDC의 4 밀리 그램 무게.
   3. 다른 microcentrifuge 관으로 NHS의 6 밀리 그램 무게.
   4. 추가 1 mL MES 버퍼 각 튜브입니다. 소용돌이 시 약을 보장 하기 위해 적극적으로 모두 튜브 완전히 해산.
3. Hydroxylamine 솔루션 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 70 밀리 그램 무게에 의해 준비.
4. 20 mL PBS hydroxylamine와 추가 해산 소용돌이.
5. 15 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 PLGA 섬유의 적절 한 금액을 질량. 일반적으로, 섬유의 75 mg는 각 반응 일괄 처리에 사용 됩니다.
6. 15 mL 튜브에 MES 버퍼의 8 mL을 추가.
7. 추가 1 mL 각 관에 앞서 준비 EDC와 보 건국 솔루션의. 솔루션의 최종 볼륨 10 mL 이어야 한다. EDC와 보 건국의 최종 농도 0.4 mg/mL 및 0.6 mg/mL, 각각 이어야 한다.
8. 가까이 플라스틱 필름 및 실내 온도 ( 그림 3 B)에서 15 분 동안 부드럽게 반전에 솔루션을 수 있도록 회전에 15 mL 튜브를 봉인. 이 단계는 GRFT 단백질 ( 그림 3 A)와 공유 수정 있도록 폴리머에 carboxyl 그룹 활성화.
9. 활성화, 후 신중 하 게 튜브에 β-mercaptoethanol의 14 µ L을 추가 하 여 반응을 끄다. 완전 한 혼합 되도록 여러 번 튜브를 반전.
   주의: β-mercaptoethanol은 매우 독성 및 화학 증기 두건에서 사용 해야 합니다.
10. 는 상쾌한 삭제 하 고 10 mL PBS, 모든 나머지 β-mercaptoethanol을 제거 하려면 두 번, PLGA 섬유 린스.
11. Rinsing 후, 튜브를 GRFT 재고 솔루션의 적절 한 금액을 추가. 예를 들어 5 nmol GRFT/mg 섬유는 섬유의 밀리 그램 당 (10 mg/mL 재고)에서 GRFT 재고 솔루션의 6.35 µ L를 요구할 것입니다. 따라서 75 mg 섬유 샘플 476.25 µ L 10 mg/mL GRFT 재고 솔루션의 필요.
    참고: GRFT 섬유 0.05, 0.5, 및 mg 섬유 당 5 nmol GRFT의 이론적인 선적으로 조작 했다.
12. 닫고 철저 하 게 혼합 되도록 튜브 반전 추가 8 mL를 최종 볼륨을가지고 충분 한 PBS.
13. 튜브 플라스틱 필름으로 밀봉 하 고 장소는 터에 다시,이 시간 2 h.
14. 부 화 후 2 h, 15ml 원심 관으로 hydroxylamine 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 여 반응을 끄다. 제조업체 지침 당 냉각 반응 동안 hydroxylamine의 최종 농도 0.7 mg/mL 이어야 한다.
15. 는 솔루션을 잘 혼합 하 고는 상쾌한 삭제. 어떤 결합형된 GRFT를 제거 하려면 10 mL 초순 물으로 두 번 표면 수정 PLGA 섬유 린스.
16. 전송 섬유 페 트리 접시 및 장소는 desiccator 내부 섬유 완전히 건조 될 때까지. 저장을 위한 4 ° C를 페 트리 접시를 전송.

3. SEM GRFT 표면 특성 수정 섬유

1. 장소는 SEM에 탄소 이중 면 테이프의 스트립 견본 마운트. 영구 마커를 사용 하 여 샘플 식별 정보 견본 마운트 하단의 레이블.
2. 한 표면 수정 섬유에서 3 샘플 고 별도 표본 마운트에 그들을 배치. 각 샘플의 두께 약 0.5 m m.
3. 스퍼터 코트 골드 플레이트에서 전자 유도 입자 증 착을 사용 하 여 샘플. 스퍼터 90 코트 s, 2.4 k v.
   참고: 스퍼터 코트 시간 전압 및 암페어 수를 포함 하 여 장비 매개 변수에 따라 다를 수 있습니다.
4. 8 샘플 이미지 5, 1, 000에서까지 확대와 함께 kV X. 000

4. GRFT 표면 수정 섬유에서 추출

1. 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 3 중에서 섬유의 2 밀리 그램을 대량.
2. 튜브, 다음 소용돌이를 1 mL 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 추가 하 고 완전히 섬유 분해를 실 온에서 1 분 동안 품 어.
3. 인큐베이션, 후 희석의 10 µ L 약 수 트리 스-EDTA (테) 버퍼에 4.2, 적어도 100 단계에서 DMSO 섬유 솔루션 (pH = 8.0).
4. ELISA와 특성화 로드까지-20 ° C에서 샘플을 저장할.

5. 섬유에서 탈 착 GRFT 측정

1. GRFT 발표의 양을 평가 또는 섬유 표면 수정 및 microcentrifuge 관에서 5-10 밀리 그램의 무게는 섬유에서 desorbed. 각 관에서 섬유 대량 기록.
2. 생리 적인 환경을 모방 하는 적절 한 솔루션의 1 mL을 추가 (예, PBS, 테 버퍼, 시뮬레이션된 질 액체 (SVF), 등) 각 샘플.
3. 200 rpm, 37 회전 통에 1 시간에 대 한 샘플을 품 어 ° c.
4. 후 부 화, 제거 약 1 mL 유리병, 약 수에서 desorbed GRFT 클러스터에 포함 된 테 버퍼 튜브. 단백질 정량화까지-20 ° C에서 저장소.
5. 새로운 microcentrifuge 튜브 샘플 전송, microcentrifuge 관 내의 섬유에 신선한 버퍼 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 다음 시간 포인트까지 품 어.
6. 릴리스를 측정 하는 데 사용 하는 전형적인 시간 포인트 포함: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h, 및 1 wk. 무시할 수 탈 착 4 헤 후 이러한 연구에서 관찰 되었다

6. GRFT 추출 및 ELISA 통해 탈 착의 정량화

HA의 0.1 mL

1. 코트 96-잘 ELISA 플레이트 (10 µ g/mL) 잘 당 앞에서 설명한 ⁵¹. 플라스틱 필름 격판덮개 및 4 ° C ( 그림 4)에서 밤새 품 어.
2. 코팅 버퍼를 제거 하 고 각 우물에 버퍼 (2-3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에 0.05% 폴 20와 함께)를 차단 하는 0.3 mL를 추가 합니다. 실내 온도에 적어도 2 시간에 대 한 접시를 품 어.
3. , 부 화 후 3 번 0.1% 폴 20 (PBS-P)와 1 x PBS 가진 접시를 씻어. Rinsing 후, 각 우물에 부정적인 컨트롤 샘플, 표준, 또는 PBS의 0.1 mL를 분배. 다시 실 온에서 1 h에 대 한 접시를 품 어.
4. 린스는 접시 3 번 다시 PBS. Rinsing 후, 각 음에 1 차적인 항 체 (염소 안티 GRFT 원으로)의 0.1 mL를 추가 하 고 실내 온도에 적어도 1 시간에 품 어. 일반적으로 1 차적인 항 체 솔루션 1:10,000 PBS에 의해 희석 이다.
5. 잠복기 1 차적인 항 체 린스 샘플 판 다시 3 회 PBS.와 후 이차 항 체의 0.1 mL를 추가 (양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)-활용 된 토끼 반대로 염소 IgG) 각을 잘 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 이차 항 체 솔루션 1:10,000 PBS에 의해 희석 이다.
6. 세척 접시 3 번. 각 우물에 0.1 mL TMB 2 과산화 효소 기질을 추가 합니다. 모니터 색상 개발 (약 2 분), 다음 추가 0.1 mL H ₂ 이렇게 ₄ (1 N) 반응 해소. 450에 접시를 읽고 플레이트 리더에 nm.
7. 배경 OD 값 (웰 스 PBS를 수신만 하는), 평균 및 실험적인 그룹에서 이것을 빼기.

결과

섬유 형태 바이러스에 대 한 보호를 제공 하는 표면 수정 EFs의 기능에 상당한 효과가 있다. 전기는 편리 하 고 간단한 절차, 최적화 되지 않은 폴리머 제형 불규칙 한 섬유 형태 (그림 5B-C) 발생할 수 있습니다. 파란색 또는 비정 질 매트 같은 형태학의 대형 귀착되는 전기 조건에서 변경 종종 용 폴리머 호환성, 낮은 폴리머 점도, 흐름 속도, 또는 다른 전기 조건에 의해 발생 합니다. 섬유 구조에 결과 유사 약물 통합 섬유 또는 불일치 활용 효능, 물리적 또는 화학적으로 바이러스 침투를 방해 하는 섬유 수 변경에 대 한 다른 릴리스 프로필에 발생할 수 있습니다. 설명된 전기 조건을 사용 하 여 날조 PLGA EFs 1.5와 2.8 µ m (그림 6) 사이 배열 하는 직경 고유 섬유 형태학 발생 한다. 섬유 형태 및 직경을 확인 ...

토론

그들의 다공성 구조와 큰 표면 영역, EFs 헬스케어, 치료 배달 차량으로 봉사를 포함 하는 중 하나는 다양 한 응용 프로그램을 발견 했다. 약물 및 다른 활성 에이전트 통합할 수 있습니다 EFs에서 가변 배달 동안 생물 의약품 및 화학 ligands 셀-특정 대상⁵² 또는 바이오 센 싱⁵³섬유 표면에 활용 될 수 있습니다. 여기 GRFT의 제조 표면-수정 PLGA EFs, HIV 감염을 방지 하기 위해 배달 비 계 설명. GRFT-EFs 다른 섬유 생산 방법^49,53상대적인 낮은 비용과 높은 생산 비율의 혜택을 제공, 전기에 의해 합성 되었다.

프로토콜의 중요 한 단계
EFs의 형성은 비판적으로 특히 솔루션 또는 용 매 점도

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA) 50:50	Lactel	B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Thermo Scientific
블런트 디스펜싱 바늘 18g X 1/2	Brico 의료 용품	BN1815
BD 3mL 주사기 Luer-lok 팁	VWR	309657
파라필름 (플라스틱 필름)	Sigma Aldrich	P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)	Sigma Aldrich	M3671
염화나트륨	시그마 알드리치	S7653
염화칼	시그마 알드리치	P9333
인산나트륨 이염기성	시그마 알드리치	S7907
인산칼륨 단염기	시그마 알드리치	P0662
하이드록시숙신이미드 (NHS)	Thermo Scientific	24500
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDC)	Thermo Scientific	22980
2-Mercaptoethanol	Fisher	BP176
Griffithsin (GRFT)	Kentucky Bioprocessing	NA	맞춤 제작, 제품 번호 없음
Dimethyl Sulfoxide	Milipore	317275
폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트 (Polysorbate, Tween 20)	Sigma Aldrich	P9416
Tris EDTA 버퍼	Sigma Aldrich	93283
플랫-바텀 이뮤노 비멸균 96-웰 플레이트	Thermo Scientific	3355
인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)	켄터키 바이오프로세싱	NA	맞춤형, 제품 번호 없음
Goat Anti-GRFT (1차 항체)	Kentucky Bioprocessing	NA	맞춤형, 제품 번호 없음
토끼 안티 염소 IgG-HRP (2차 항체)	Santa Cruz	2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate	KPL	52-00-00