방법 논문

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음

DOI:

10.3791/56493

⸱

2017년 9월 25일

 , 
1Department of Neurology, School of Medicine, Wayne State University, 2Department of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, Wayne State University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

시 냅 스 전류 초파리 3 탈피 애벌레 neuromuscular 접속점에 시각화 된 시 냅 스 boutons에서 focally 기록 될 수 있습니다. 이 기술은 단일 시 냅 시스 bouton의 활동을 모니터링 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 시 냅 스 전송 연구에 우수한 모델 시스템입니다. 초파리 애벌레 NMJ에 시각화 된 boutons 시 냅 스 전류 초점 macropatch 녹음 기술을 설명합니다. 이 기술은 micropipettes, 높은 배율, 장거리 물 침수 목표, 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 광학와 형광 화합물 현미경 녹음의 맞춤된 제작을 해야 합니다. 첨부 합니다. 기록 전극 선택된 시 냅 시스 bouton DIC 광학, epi-형광, 또는 둘 다 시각 위에 배치 됩니다. 이 기법의 장점은 릴리스의 사이트의 제한 된 수의 시 냅 스 활동을 모니터링을 허용 한다입니다. 기록 전극은 여러 미크론의 직경 그리고 전극 가장자리 밖에 배치 된 릴리스 사이트 크게 영향을 주지 않습니다 기록된 전류. 기록 된 시 냅 스 전류 빠른 속도 고 쉽게 해결 될 수 있습니다. 이러한 장점은 향상 된 자연 또는 비동기 시냅틱 활동 돌연변이 플라이 라인의 연구에 대 한 특히 중요 하다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

초파리 는 시 냅 스 전송 제어 하는 분자 메커니즘을 연구 하는 우수한 모델 시스템입니다. 초파리 에서 신경 근육 학 시스템 glutamatergic, 이며 따라서 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 자료의 보존된 기능을 공부를 사용할 수 있습니다. 1 월과 1 월의 연구1, 이후 세 번째 탈피 애벌레는 갖는 자발적 시 냅 스 전송 흥분 성의 접합 잠재력 (EJPs) 또는 전류 (EJCs)을 모니터링 하 여 공부 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. EJPs는 일반적으로 기록 침 날카로운 유리 마이크로 전극, 그들은 주어진된 근육 섬유에서 시 냅 스를 만드는 모든 boutons를 포함 하 여 전체 NMJ의 활동을 반영 하 고.

대조적으로, 출시의 사이트의 제한 된 수의 활동 신경 터미널 또는 시 냅 스 varicosities 근처 micropipette 팁을 배치 하 여 focally 기록할 수 있습니다. 이 기술은 원래 캐츠와 Miledi2에 의해 고용 되었다 및 초점 세포 외 녹음 개구리3,,45, 마우스6 를 포함 한 여러 NMJ 준비에서 성공적으로 고용 되어 , 7 , 8, 갑각류9,10,11,12,13,,1415,16및 초파리17,18,19,20,21,,2223. 이 이렇게는 최적화 된 레코딩 전극24,25macropatch 누가 Dudel에 의해 더 개발 되었다. Dudel의 구현에서이 기술을 밀접 하 게 일치 하는 느슨한 패치 클램프 방법26.

초파리 애벌레 NMJ 시 냅 스 boutons, 명확 하 게 정의 하 고 유전자 인코딩된 신경 형광 태그 ( 테이블의 자료참조)와 유전자 변형 라인은 쉽게 사용할 수 있습니다. 이러한 장점이 우리 EJCs와 mEJCs는 선택 된 시 냅 시스 bouton20,,2122에서 기록를 활성화. 여기, 우리는이 기술을 자세히 설명합니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 제조의 기록 전극

microelectrode 끌어당기는 사람에 대 한
    1. 사용 다음 유리 전극 당기
    2. 프로토콜 (재료의 표 참조):
      1. 1: 열 510 당겨-속도 30 시간 250; 2 호선: 열 490 풀-속도 30 250 시간.
        참고: 단위; 당 0.5 ms에 해당 하는 시간 단위 다른 단위는 상대. 램프 테스트 수행 후 모든 필 라 멘 트에 대 한 열 값을 조정 한다.
    3. 현미경 (35 x 배율)를 사용 하 여 가져온된 전극의 내경 ( 그림 1A) 7-10 µ m의 범위에 있는지 확인. 먼지 축적을 방지 하기 위해 단단히 닫힌된 용기에 모세를 저장.
  1. 화재 연마
    1. 화재 폴란드어 모세 (1-2에 대 한 최대 열 값의 80-90%)는 마이크로-포지를 사용 하 여 (재료의 표 참조). 세련 된 전극의 최종 내부 직경은 5 µ m ( 그림 1A) 27 확인.
  2. 굴곡
    참고: 두 개의 굴절 높은 확대 목표 아래 근육 위에 전극 위치 하기 위해 만들어집니다.
  3. 그림 1B에서 표시 하는 장치를 사용 하 여
      . 조작자에 전극을 수정 하 고 필 라 멘 트, 아니라 그것을만 지는 팁 놓고
  4. 집합 열 값의 최대 60-70%를 누르고 1-2에 대 한 마이크로-포지의 페달 (재료의 표 참조)는 필 라 멘 트가 열. L 자 모양의 바늘을 사용 하 여 부드럽게 풀 ( 그림 1B 확대) 전극의 팁 다운. 약 90 o ( 그림 1C)에 굴곡을 만들어.
  5. 전극 토치의 불꽃에 집게를 사용 하 여 손으로 누른 첫 번째 벤드에서 7-10 밀리미터의 거리에 두 번째 벤드 약 120 o ( 그림 1C)의 각도 확인.

figure-protocol-1
그림 1. Micropipette 제조의 마지막 단계. (A) 전극 고 화재 연마 후 팁. (B.1) 팁 절곡에 대 한 설정. (B.2) 박스형된 영역 오른쪽에 확대 표시 됩니다. 전극과는 필 라 멘 트 전극 팁은 약간 와이어 위에 위치 하 고 감동 하지 있도록 고정 됩니다. (C.1) 기록 전극입니다. (C.2) 박스형된 영역 오른쪽에 확대 표시 됩니다. 첫 번째 벤드는 약 90 °의 각도 첫 번째 벤드와 전극의 끝 사이 거리가 약 1 m m. 규모 바 = 3 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 추가 예비 단계

  1. 준비 (mM)에 heamolymph 같은 (HL3) 솔루션: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 트 레 할 로스, 115 자당, 5 HEPES, 및 1mm CaCl 2; pH 7.3-를 조정 7.4. 냉장고에 솔루션을 유지 하 고 매주 신선한 게.
  2. 게 자극 pipets 같은 방법으로 녹음 유리 pipets, 그들을 구 부 필요가 없습니다 않습니다.
    참고: 자극 전극의 준비는 28와 27에 자세히 설명 되어 있습니다. 마지막 지름 5-7 µ m의 범위에 있어야 화재 연마 후.
  3. 삽입 주사기에 연결 된 microelectrode 홀더에서 자극 피 펫.
  4. 작은 접시 (35 x 10 m m) 실리콘 고무 에폭시 코팅에서 제조 해 부 접시 (재료의 표 참조) 28에 설명 된 대로.
    참고: 실리콘 고무 사용 하기 전에 완전히 경화 되어야 합니다.
  5. 방황 3 탈피 애벌레를 선택 하 고 27 , 28 , , 29 30에 설명 된 대로 그것을 해 부.
    참고: boutons를 시각화 하려면 비행 스트레인 CD8-GFP (재료의 표 참조)
    1. 사용 집게 (재료의 표 참조), 선택 3 rd 탈피 애벌레는 유리병에서.
    2. 핀 첫 번째 핀 후부 배치 애벌레와 다른 핀 앞쪽 (가까운 입 후크).
    3. 추가 HL3 솔루션.
    4. 애벌레의 등 쪽 측에 봄을가 위 (재료의 표 참조)에서 최고 핀 하단 하나를 사용 하 여 잘라 만들.
    5. 애벌레 필렛, 애벌레의 왼쪽과 오른쪽에 2 추가 핀 배치를 핀.
    6. 배 짱과 집게를 사용 하 여 tracheas 제거.
    7. 봄이 위를 사용 하 여 복 부 신경 코드 밖에 신경을 잘라.

3. EJCs의 전기 레코딩

figure-protocol-2
그림 2. 녹음 설정. 샘플 NMJ 실리콘 코팅된 페 트리 접시 (화살표) epifluorescence 기능, 높은 확대 목표 및 2 개의 micromanipulators 수직 화합물 현미경의 이동식 무대 위에 위치에 고정. 현미경은 진동 방지 테이블에 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  • 녹음
    1. 장소 현미경 단계 ( 그림 2)에 준비와 페 트리 접시
        . 목욕에서 참조 전극 삽입.
    2. 기록 전극 HL3 솔루션을 작성합니다. 10 배 목표 아래 (재료의 표 참조), 전극은 욕조에 담가 고 6-7 2, 3, 또는 4는 micromanipulator를 사용 하 여 복 부 세그먼트의 근육 이상 (재료의 표 참조) ( 그림 3 A.1, A.2).
    3. 60 x 목표 전환 (재료의 표 참조). 피-형광 또는 DIC 광학을 사용 하 여 관심사의 지역에 초점. 시 냅 시스 bouton ( 그림 3 B.1-3) 위에 전극의 끝을 놓습니다.
    4. 근육에 매우 부드럽게 전극을 누릅니다. 과도 한 압력은 NMJ를 손상 또는 자발적 시 냅 시스 활동에 증가 일으킬 수 있습니다. 전극의 팁은 안 막힌-그것은, 그것을 대체 하는 경우 확인
    5. 앰프, A/D 보드, 그리고 컴퓨터에 전환.
    6. 앰프에 전압 클램프 모드를 선택 하십시오.
    7. 수집 소프트웨어를 시작 하 고 선택은 ' 간격-무료 ' 모드.
    8. 컴퓨터 화면에 mEJCs의 모양을 관찰.
    9. 0.2-의 범위에는 mEJCs의 진폭은 없는지 0.7 없음.
      참고: 작은 EJCs 나타냅니다 기록 전극 결함이 있다 또는 그것이 제대로 위치 하지은.

    • figure-protocol-3
    그림 3. 시 냅 스 boutons의 시각화. Hemi-세그먼트 확대 (A.1)와 근육 6 및 7을 보여주는 확대 박스형된 영역 아래 10의 (A) A 명시 이미지 (A.2, 화살표 표시 기록 전극). 눈금 막대 = 50 µ m. (B) 시 냅 스 boutons는 유전으로 인코딩된 신경 마커 (CD8-GFP)와 초파리 라인에 시각 피 형광 이미징 (B.1) 또는 DIC 광학 (B.2)을 사용 하 여. 이미지는 객관적이 고 GFP 이미징에 대 한 필터 큐브 x 60 찍은 (재료의 표 참조). Synaptic boutons 화살표와 함께 표시 되 고 형광 및 DIC 이미지 오버레이 B.3에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    1. 자극
      1. 근처 복 부 세그먼트 2-4를 innervating 축 삭 자극 전극 배치 사용 시각적인 통제 micromanipulator.
      2. 주사기의 피스톤을 당겨서 적용 부정적인 압력에 연결 전극 홀더, 그래서 축 삭 ( 그림 2) 전극의 내부 뽑아.
      3. 는 자극에. 격리 단위에 노브를 설정 (재료의 표 참조) 제로 전류를 설정 하 여 다음 부드럽게 증가, EJCs 나타날 때까지 (또는 임계값에 도달할 때까지).
      4. 현재 자극 suprathreshold 정권에서 자극 증가 약 두 번, EJCs의 관찰에 대 한 임계값에 비해 수행.
        참고: 우리의 경험에서 이러한 자극 강도 실패 활동 전위와 활동 전위 발생을 피하기 위해 최적입니다. 예를 들어, EJCs 0.2의 자극 전류에 나타납니다 0.4의 전류를 사용 하는 엄마, 실험을 통해 엄마.
    2. 물개 저항
      1. 앰프의 전극 저항 스위치를 설정 하 여 녹음 macropatch 전극의 인감 저항을 측정 " 테스트 봉인 " 위치. GΩ에 인감 저항의 값에 표시 됩니다 관찰 된 " 현재 " 창.
      2. 인감 저항 0.5-2 M의 범위에 있는지 확인 Ω. 값이이 범위를 벗어난 표시 전극 제대로 광택 또는 하지 제대로 위치.
      3. 인감 저항 녹음을 통해 모니터링, 실험을 통해 일정 하 게 유지 그것 다는 것을 확인.

    4. 분석

    분석용 소프트웨어 사용자 지정
    1. 분석 녹음 채용 (재료의 표 참조).
      참고: 연구소 사내 소프트웨어 Quantan 31, EJCs 및 mEJCs focally 기록 ( 그림 4)의 검출에 대 한 사용자 지정을 사용 합니다. 이 소프트웨어 가우스 디지털 필터를 포함 하 고 겹치는 다중 quantal 이벤트 ( 그림 4A)에서 quantal 봉우리의 탐지를 허용 한다. 다른 접근 17에 설명 되어 있습니다.

    figure-protocol-4
    그림 4. Quantal 분석입니다. MEJCs (A)와 EJCs (B) Quantan 소프트웨어에 의해 감지. 이벤트 지역 녹색으로 표시 하 고 봉우리는 붉은 화살표에 의해 표시 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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    결과

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    초점 macropatch 녹음 선택 된 시 냅 스 boutons (그림 5)에서 모니터링 시 냅 시스 활동 가능 전극 (그림 5A, 사이트 1) 시 냅 시스 bouton 위에 가져갈 때 기록 된 mEJCs (그림 5C, 사이트 1)는 진폭 잡음 레벨을 크게 초과 하 고 (하위 밀리초 범위)에서 단계 상승 날카로운. 때 기록 전극은 이동 시 냅 시스 bouton 멀리 몇 미크론 (그림 5A, 사이트 2), 기록 된 mEJCs 감소의 진폭에 의해 거의 소음 수준 (그림 5B, 2). 기록 된 EJCs 겨우 소음에서 구별 될 수 있다 그리고 그들은 단계 (그림 5C

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    토론

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    초파리 는 공부 시 냅 스 전송에 유리한 모델 유기 체를 나타냅니다. 여러 녹음 구성 시 냅 스 전위, 시 냅 스 전류 두 전극 전압 클램프33,34, 및 초점 macropatch의 녹음의 세포내 녹음을 포함 한 애벌레 NMJ에 사용 되었습니다. 여기서 설명 하는 시 냅 스 전류 기록입니다. 후자의 방법을 시각화 된 boutons에 시 냅 시스 전송의 정확한 정량화를 허용합니다.

    설명된 프로토콜의 성공을 비판적으로 관심의 영역을 명확 하 게 시각화 하 고 기록 전극의 준비를 사용자 지정 하는 기능에 따라 달라 집니다. 따라서, 품질 DIC 광학, 긴 작동 거리, 및 화재 연마 및 전극 녹음의 굽 힘에 대 한 사용자 지정 된 장비와 높은 확대 물 침수 목표는 매우 중요 하다.

    이 방법의 장점은 기록 전극에서 위치...

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    공개 사항

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    저자는 공개 없다.

    감사의 글

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    NIH 보조금 R01 수소 099557에 의해 지원

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    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    Sutter P-97Sutter 기구P-97미세 전극 풀러
    Narishige MF-830NarishigeMF-830Microforge
    WPI MF200WPIMF200Microforge
    Glass capilariesWPIB150-86-10Glass capilaries
    Microtorch 1WG61Grainer1WG61Microtorch
    Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트다우 코닝SYLGARD 184해부 플레이트 준비용 실리콘
    해부 핀아마존B00J5PMPJA애벌레 포지셔닝용 핀
    핀셋WPIINC500342핀셋 핀 배치, 내장 및 기관 제거용.
    가위WPIINC501778유충과 신경의 큐티큘러를 절단하기위한 가위.
    올림푸스 BX61WI올림푸스BX61WI정립 현미경
    올림푸스 Lumplan FL N, 60x올림푸스UPLFLN 60X현미경 대물렌즈, 60X
    올림푸스 UPlan FL N, 10x올림푸스Uplanfl N 10X현미경 대물렌즈, 10X
    Narishige MicromanipulatorNarishigeMHW-33축 수압 미세매니퓰레이터
    npi Electronic GmbH ELC-03XSnpi Electronic GmbHELC-03XS전기생리학 증폭기
    A.M.P.I Master 8A.M.P.I.Master 8전기 자극기
    A.M.P.I Iso-FlexA.M.P.I.Iso-Flex자극 아이솔레이터
    TMC 방진 테이블TMC63-9090방진 테이블
    TMC 패러데이 케이지TMC81-333-90패러데이 케이지
    Digidata 1322AAxon InstrumentsDigidata 1322ADigidata
    컴퓨터DellDell Dimension 5150Win XP OS
    전극 홀더WPIMEH3SW전극 홀더
    광학 필터Omega 광학XF 115-2녹색 형광 단백질(GFP) 감지용 필터 큐브
    pCLAMP 8Axon Instruments8.0.0.81신호 기록용 소프트웨어
    Quantan사내 소프트웨어-신호 처리용 소프트웨어
    Canton-S (Wildtype)Bloomington Stock Center64349Control fly line
    cpx SH1Generous Gift of J.T.Littleton-Complexinknock-out fly line with increased spontaneous exocytosis
    CD8-GFPBloomington Stock Center5137뉴런 형광등(GFP) 태그가 있는 플라이 라인
    , , 가 있는 컴퓨터

    참고문헌

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