Method Article

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음

DOI:

10.3791/56493

⸱

September 25th, 2017

 , 
1Department of Neurology, School of Medicine, Wayne State University, 2Department of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, Wayne State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

시 냅 스 전류 초파리 3 탈피 애벌레 neuromuscular 접속점에 시각화 된 시 냅 스 boutons에서 focally 기록 될 수 있습니다. 이 기술은 단일 시 냅 시스 bouton의 활동을 모니터링 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 시 냅 스 전송 연구에 우수한 모델 시스템입니다. 초파리 애벌레 NMJ에 시각화 된 boutons 시 냅 스 전류 초점 macropatch 녹음 기술을 설명합니다. 이 기술은 micropipettes, 높은 배율, 장거리 물 침수 목표, 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 광학와 형광 화합물 현미경 녹음의 맞춤된 제작을 해야 합니다. 첨부 합니다. 기록 전극 선택된 시 냅 시스 bouton DIC 광학, epi-형광, 또는 둘 다 시각 위에 배치 됩니다. 이 기법의 장점은 릴리스의 사이트의 제한 된 수의 시 냅 스 활동을 모니터링을 허용 한다입니다. 기록 전극은 여러 미크론의 직경 그리고 전극 가장자리 밖에 배치 된 릴리스 사이트 크게 영향을 주지 않습니다 기록된 전류. 기록 된 시 냅 스 전류 빠른 속도 고 쉽게 해결 될 수 있습니다. 이러한 장점은 향상 된 자연 또는 비동기 시냅틱 활동 돌연변이 플라이 라인의 연구에 대 한 특히 중요 하다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

초파리 는 시 냅 스 전송 제어 하는 분자 메커니즘을 연구 하는 우수한 모델 시스템입니다. 초파리 에서 신경 근육 학 시스템 glutamatergic, 이며 따라서 초파리 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 자료의 보존된 기능을 공부를 사용할 수 있습니다. 1 월과 1 월의 연구1, 이후 세 번째 탈피 애벌레는 갖는 자발적 시 냅 스 전송 흥분 성의 접합 잠재력 (EJPs) 또는 전류 (EJCs)을 모니터링 하 여 공부 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. EJPs는 일반적으로 기록 침 날카로운 유리 마이크로 전극, 그들은 주어진된 근육 섬유에서 시 냅 스를 만드는 모든 boutons를 포함 하 여 전체 NMJ의 활동을 반영 하 고.

대조적으로, 출시의 사이트의 제한 된 수의 활동 신경 터미널 또는 시 냅 스 varicosities 근처 micropipette 팁을 배치 하 여 focally 기록할 수 있습니다. 이 기술은 원래 캐츠와 Miledi2에 의해 고용 되었다 및 초점 세포 외 녹음 개구리3,,

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Protocol

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1. 제조의 기록 전극

microelectrode 끌어당기는 사람에 대 한
    1. 사용 다음 유리 전극 당기
    2. 프로토콜 (재료의 표 참조):
      1. 1: 열 510 당겨-속도 30 시간 250; 2 호선: 열 490 풀-속도 30 250 시간.
        참고: 단위; 당 0.5 ms에 해당 하는 시간 단위 다른 단위는 상대. 램프 테스트 수행 후 모든 필 라 멘 트에 대 한 열 값을 조정 한다.
    3. 현미경 (35 x 배율)를 사용 하 여 가져온된 전극의 내경 ( 그림 1A) 7-10 µ m의 범위에 있는지 확인. 먼지 축적을 방지 하기 위해 단단히 닫힌된 용기에 모세를 저장.
  1. 화재 연마
    1. 화재 폴란드어 모세 (1-2에 대 한 최대 열 값의 80-90%)는 마이크로-포지를 사용 하 여 (재료의 표 참조). 세련 된 전극의 최종 내부 직경은 5 µ m ( 그림 1A) 27 확인.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

초점 macropatch 녹음 선택 된 시 냅 스 boutons (그림 5)에서 모니터링 시 냅 시스 활동 가능 전극 (그림 5A, 사이트 1) 시 냅 시스 bouton 위에 가져갈 때 기록 된 mEJCs (그림 5C, 사이트 1)는 진폭 잡음 레벨을 크게 초과 하 고 (하위 밀리초 범위)에서 단계 상승 날카로운. 때 기록 전극은 이동 시 냅 시스 bouton 멀리 몇 미크론 (그림 5A, 사이트 2), 기록 된 mEJCs 감소의 진폭에 의해 거의 소음 수준 (그림 5B, 2). 기록 된 EJCs 겨우 소음에서 구별 될 수 있다 그리고 그들은 단계 (그림 5C

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

초파리 는 공부 시 냅 스 전송에 유리한 모델 유기 체를 나타냅니다. 여러 녹음 구성 시 냅 스 전위, 시 냅 스 전류 두 전극 전압 클램프33,34, 및 초점 macropatch의 녹음의 세포내 녹음을 포함 한 애벌레 NMJ에 사용 되었습니다. 여기서 설명 하는 시 냅 스 전류 기록입니다. 후자의 방법을 시각화 된 boutons에 시 냅 시스 전송의 정확한 정량화를 허용합니다.

설명된 프로토콜의 성공을 비판적으로 관심의 영역을 명확 하 게 시각화 하 고 기록 전극의 준비를 사용자 지정 하는 기능에 따라 달라 집니다. 따라서, 품질 DIC 광학, 긴 작동 거리, 및 화재 연마 및 전극 녹음의 굽 힘에 대 한 사용자 지정 된 장비와 높은 확대 물 침수 목표는 매우 중요 하다.

이 방법의 장점은 기록 전극에서 위치.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NIH 보조금 R01 수소 099557에 의해 지원

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sutter P-97Sutter 기구P-97미세 전극 풀러
Narishige MF-830NarishigeMF-830Microforge
WPI MF200WPIMF200Microforge
Glass capilariesWPIB150-86-10Glass capilaries
Microtorch 1WG61Grainer1WG61Microtorch
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트다우 코닝SYLGARD 184해부 플레이트 준비용 실리콘
해부 핀아마존B00J5PMPJA애벌레 포지셔닝용 핀
핀셋WPIINC500342핀셋 핀 배치, 내장 및 기관 제거용.
가위WPIINC501778유충과 신경의 큐티큘러를 절단하기위한 가위.
올림푸스 BX61WI올림푸스BX61WI정립 현미경
올림푸스 Lumplan FL N, 60x올림푸스UPLFLN 60X현미경 대물렌즈, 60X
올림푸스 UPlan FL N, 10x올림푸스Uplanfl N 10X현미경 대물렌즈, 10X
Narishige MicromanipulatorNarishigeMHW-33축 수압 미세매니퓰레이터
npi Electronic GmbH ELC-03XSnpi Electronic GmbHELC-03XS전기생리학 증폭기
A.M.P.I Master 8A.M.P.I.Master 8전기 자극기
A.M.P.I Iso-FlexA.M.P.I.Iso-Flex자극 아이솔레이터
TMC 방진 테이블TMC63-9090방진 테이블
TMC 패러데이 케이지TMC81-333-90패러데이 케이지
Digidata 1322AAxon InstrumentsDigidata 1322ADigidata
컴퓨터DellDell Dimension 5150Win XP OS
전극 홀더WPIMEH3SW전극 홀더
광학 필터Omega 광학XF 115-2녹색 형광 단백질(GFP) 감지용 필터 큐브
pCLAMP 8Axon Instruments8.0.0.81신호 기록용 소프트웨어
Quantan사내 소프트웨어-신호 처리용 소프트웨어
Canton-S (Wildtype)Bloomington Stock Center64349Control fly line
cpx SH1Generous Gift of J.T.Littleton-Complexinknock-out fly line with increased spontaneous exocytosis
CD8-GFPBloomington Stock Center5137뉴런 형광등(GFP) 태그가 있는 플라이 라인
, , 가 있는 컴퓨터

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
  2. Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181

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Drosophila Neuromuscular JunctionFocal Macropatch RecordingsSynaptic Current MonitoringMicropipette FabricationDifferential Interference ContrastHigh Magnification OpticsElectrophysiology TechniquesSynaptic Bouton VisualizationMiniature Endplate CurrentsStimulation Pipette Preparation

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