인간의 혈액에서 회람 하는 드문 B 세포에서 시작 인간 항 체의 항 원에 대 한 특정의 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 자연 항 체의 생성은 효율적이 고 신속한, 그리고 얻은 항 체 매우 관련된 항 원 사이 차별 수 있습니다.
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요약
초록
단일 클론 항 체 (mAbs)는 모두 근본적인 연구와 의학에 유용한 강력한 도구입니다. 그들의 높은 특이성 항 체 매우 관련된 구조 (예를 들면, 정상적인 단백질 및 그 돌연변이 버전) 사이 구별 하는 경우 필수 되지 않습니다. 같은 구별 mAbs 생성의 현재 방법은 비용과 시간이 소요 여러 Ab 생산 하는 B 세포의 광범위 한 검사를 포함 한다. 우리 제안 여기 신속 하 고 비용 효과적인 방법의 구별, 세대에 대 한 완전히 인간의 mAbs B 림프 톨을 순환 하는 인간의 혈액에서 시작 합니다. 이 전략의 독창성은 쉽게 사용할 수 있는 주변 혈액 단 세포 (PBMC)를 사용 하 여 다른 모든 셀의 카운터 선택과 결합 하는 특정 항 원 바인딩 B 세포의 선택 때문 이다. 일단 특정 B 세포 격리, 해당 mAb 코딩 하는 cDNA (보완 deoxyribonucleic acid) 시퀀스는 얻은 단일 셀 반전 전사-연쇄 반응 (RT-PCR) 기술을 사용 하 여 이후 인간의 표현 셀입니다. 1 달 만큼 적게, 내 자연스럽 게 B 셀 레 퍼 토리에 의해 감지 하는 거의 모든 원하는 항 원에 대하여 지시 하는 매우 구별 인간의 mAbs의 밀리 그램을 생산 가능 하다.
서론
여기 설명 하는 방법을 완벽 하 게 인간 단일 클론 항 체의 (mAbs) 원하는 항 원 (Ag)에 대 한 신속 하 고 다양 한 생산 수 있습니다. mAbs는 많은 기초 연구 응용 프로그램 체 외 및 생체 내에서필수 도구: flow cytometry, 조직학, 서 럽 고 차단 실험 예. 또한, mAbs는 사용 되 고 더 의학에서 자가 면역 질환, 암, 치료 하 고 이식 거부1제어 하. 예를 들어 안티-CTLA-4 및 안티-PD-1 (또는 반대로 PD L1) mAbs 최근 암 치료2검사점 면역 억제제로 사용 되었다.
첫 번째 mAbs 면역 글로불린 (Ig)에 의해 제작-면역된 쥐 또는 쥐의 비장 세포에서 얻은 hybridomas 은닉. 그러나, murine 또는 쥐 mAbs에 대 한 강한 면역 반응을 그들의 신속한 통관 및 과민 반응3의 가능한 유도 인 간에 있는 그들의 치료 사용을 지장을 초래할 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 mAbs의 동물성 단백질 시퀀스 부분적으로 소위 공상 마우스 인간 또는 인간 답게 된 항 체를 생성 하 인간 그들에 의해 대체 되었습니다. 그러나,이 전략 부분적 으로만 immunogenicity, 실질적으로 비용 및 시간-생산의 규모를 증가 하는 동안 감소. 인간의 mAbs 인간 B 세포에서 직접 생성 하는 고이 대 한 몇 가지 전략을 사용할 수 있습니다. 그들 중 하나 살 균 소 또는 효 모 디스플레이의 사용 이다. 이 무거운 무작위 인간의 Ig의 조합 도서관에서 변수 도메인 표시과 빛 연결에 페이지 또는 효 모, 그리고 관심의 특정 항 원을 사용 하 여 선택 단계를 수행. 이 전략의 주요 단점은 무 겁 고 가벼운 사슬은 무작위로 연결 된, 생성 된 항 체의 다양성에 아주 큰 증가에 지도입니다. 얻은 항 체 특정 Ag에 대 한 자연 면역 반응에서 발생 하는 것을 그에 해당 하는 있지 않습니다. 또한, 인간 단백질 폴딩과 포스트 번역 상 수정은 체계적으로 복제 않을 원핵생물 또는 효 모에도. 두 번째 인간 mAb 생산 방법은 엡 스타인-바 바이러스 감염이 나 안티 apoptotic 요인 BCL-6 및 BCL XL4의 식에 의해 자연 인간 B 세포 immortalization입니다. 그러나,이 메서드는 메모리 B 세포에만 적용 이며 효율적인, 수많은 mAb 생성 불멸 하 게 B 세포의 몇 가지 (해당 되는 경우) mAb 클론 원하는 항 원 특이성을 식별 하는 검사를 요구 하지 않습니다. 방법은 이렇게 비용과 시간이 소요입니다.
최근 새로운 프로토콜에서 고립 된 단 하나 B 세포5인간의 mAbs의 생산에 대 한 설명 하고있다. 그것에 최적화 된 단일 셀 반전 전사-연쇄 반응 (RT-PCR) 증폭의 두 무거운-및 빛-체인 인코딩 단일 정렬 된 B 세포에서 세그먼트에 대 한 의존 합니다. 이것 완전히 인간의 mAb의 재건 되므로 진 핵 식 시스템에 복제 하 고 이러한 세그먼트의 표현에 의해 선행 된다. 이 프로토콜은 예방 접종된 기증자에서 B 세포에서 시작 하 고 성공적으로 사용 되었습니다. 셀 B 세포는 원하는 자세에 대 한 감독의 더 높은 주파수를 가져오고 따라서6심사에 필요한 시간을 제한 하는 예방 접종 후 몇 주를 수확 했다. 다른 완전히 인간 mAbs 또한 HIV+ (인간 면역 결핍 바이러스)에 감염 된 환자7 과 흑색 종 환자8에서 제작 되었습니다. 이러한 발전에도 불구 하 고 아직도 그들의 메모리 표현 형 또는 주파수의 독립적인 Ag 특정 B 세포의 분리를 가능 하 게 사용할 수 없는 절차가입니다.
절차 설명 여기 뒤에 높은 수율 및 낮은 심사 시간 완전 인간 항 원 특정 mAbs의 생산 그들의 BCR 특이성에 따라 인간의 순환 B 세포의 효율적인 비보 전 절연 리드. 메서드를 사용 하면 메모리 B 세포 또는 항 체 은닉 B 세포는 면역 반응 후 유도에 제한 되지 않습니다 하지만 인간의 순진한 B 셀 레 퍼 토리에도 적용 될 수 있습니다. 그것은 매우 낮은 주파수에 Ag 특정 B 세포에서 시작 작동 효율성의 좋은 표시 이다. 방법의 원리는 다음과 같습니다: 주변 혈액 단 세포 (PBMC)는 관심사의 항 원을 제시 하는 2 개의 tetramers 물, 각각 다른 형광 색소 (예를 들어, Phycoerythrin (PE) 및 Allophycocyanin (APC))와 함께 표시 그리고 세 번째 형광 색소 (예를 들어, 화려한 바이올렛 421 (BV421))와 밀접 하 게 관련 된 항 원 제시 3 tetramer 활용. 항 원 바인딩 셀에 대 한 풍부 하 셀은 다음 인 큐베이 팅 구슬 안티-PE 코팅 및 안티-APC Abs, 셀 분리 열에 정렬. APC PE+ + 셀 분수 선택, mAbs PBMC 셀 종류 B 세포의 식별을 허용에 대 한 특정의 다양 한 스테인드 그리고 복종 flow cytometry 셀 정렬 합니다. B 세포는 PE+ +, 화려한 바이올렛-, 그러나 APC 격리 됩니다. 이 단계는 카운터 B 세포 또는 항 원 tetramerized에 바인딩되지 않습니다 그러나 PE 또는 APC (이 셀 것 PE+ - APC 또는 PE- APC+) 또는 사용 (이 tetramers의 비 항 원 부분에 바인딩 할 셀을 선택 셀 BV421 될 것입니다+). 이 단계에서 B 세포 높은 관심의 피토 프에 대 한 특정 카운터 선택 또한 (이 셀 BV421 됩니다+). 따라서,이 메서드는 매우 구체적인 B 세포 B 세포 수용 체 (BCRs) 두 매우 밀접 하 게 관련 된 항 원 사이 차별 있게 표현 정화 수 있습니다. 튜브에 수집 되는 단일 특정 B 세포 그들의 PCR 증폭 Ig cDNAs (보완 deoxyribonucleic 산) 복제 하 고 IgG mAbs 분 비로 인간 세포 선으로 표현.
개념의 증거로 서이 연구는 펩 티 드 제시한 중요 한 조직 적합성 복잡 한 클래스 나 인식 인간의 mAbs의 효율적인 생성에 설명 합니다 (MHC-나) 분자가 펩 티이 드와 같은에 로드 된 다른 펩 티 드 사이 차별 수 있습니다 MHC-나 대립 유전자. 이 자세의 복잡성 수준을 중요 하지만이 방법을 사용 하면 (i) Ag 관련 mAbs;의 고수익 복구 (2) 두 개의 구조적으로 가까운 Ags 사이 차별 있게 mAbs의 생산. 이 방법은 프로토콜 수정 없이 예방 접종 또는 감염 된 환자에 게 확장 될 수 있습니다 그리고 또한 이미 성공적으로 인간 답게 쥐 시스템9에서 구현 되었습니다. 따라서,이 연구는 기초 연구에 immunotherapy 사용할 수 있는 완전 인간 mAbs를 생성 하는 다양 하 고 효율적인 접근 방식을 설명 합니다.
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프로토콜
모든 인간 주변 혈액 샘플은 로컬 윤리 위원회 (Etablissement 프랑스어 뒤 상, EFS, 낭트, 프로시저 PLER 국세청-2016-08)에 따라 동의 후 익명 성인 기증자 로부터 얻은 했다.
1. 인간 주변 혈액 단 세포의 고립
참고: 시작 물자 수 총 인간 주변 혈액 또는 cytapheresis 샘플. 샘플 8 h 이상 해서는 안 되 고 응고 (예를들면, 헤 파 린)와 보충.
- 2 볼륨 (인간 주변 혈액) 혈액 또는 5 볼륨 (cytapheresis 샘플) RPMI (로스웰 파크 기념 연구소) 매체의 희석.
- 신중 하 게 35 mL 50 mL 원뿔 튜브에 그라데이션 중간 밀도의 15 mL에 희석된 세포 현 탁 액의 레이어. 모든 희석된 혈액을 배포 하는 데 필요한 만큼 많은 튜브를 확인 합니다. 브레이크에서 실내 온도 진동 물통 회전자에 25 분 1,290 x g에서 원심.
- 조심 스럽게 밀도 그라데이션 매체와 플라즈마 레이어 간의 인터페이스에 단 세포 층을 발음 하 고 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송.
- 튜브 RPMI 매체, 믹스를 실 온에서 10 분 동안 1,290 x g에서 원심. 조심 스럽게 제거는 상쾌한.
- 20 ml RPMI 매체와는 혈소판을 제거 하는 10 분 x g 200에서 원심 분리기의 셀 펠 릿을 resuspend. 조심 스럽게 제거는 상쾌한. 일단이 단계를 반복 합니다.
- 10%와 RPMI 매체에 셀 펠 릿 resuspend 태아 둔감 한 혈 청 (FBS).
참고: tetramer 라벨을 직접 진행 하거나 하룻밤 107 셀/mL의 농도에서 4 ° C에서 세포를 유지 합니다.
2. Ag 특정 B 세포의 자기 농축 tetramer 관련
- Ag-tetramers 중 PE 추가 하 여 준비 또는 APC 라는 프리미엄 학년 streptavidin 또는 BV421 표시 된 streptavidin biotinylated 항 원 단위체를 1: 4의 어 금 니 비율에서. 실 온에서 한 약 수 매 10 분을 추가 세 가지 별도 부분에 streptavidin 켤레의 적절 한 금액을 추가 합니다.
- 15 mL 원뿔 튜브에 세포 (3 x 10까지8 튜브 당) 고 5 분 동안 460 x g에서 원심.
참고: 다음 프로토콜 1 개의 관입니다. - 2%와 PBS (인산 염 버퍼)의 200 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend FBS. PE, APC 및 BV421 활용 된 tetramers, 10 µ g/mL의 최종 농도를 각각 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.
- PBS를 사용 하 여 0.5 %BSA (소 혈 청 알 부 민)과 EDTA (Ethylenediaminetetraacetic 산) 얼음 처럼 차가운 셀 분리 버퍼 (SB) 준비 2 m m.
- 5 분 동안 460 x g에서 원심 분리에 의해 하고있다 펠 릿 세포의 10 mL를 추가 합니다.
- 안티-APC 자기 microbeads의 안티-PE와 50 µ L의 얼음 처럼 차가운 하고있다 추가 50 µ L의 500 µ L 셀 resuspend
- 잘 혼합 하 고 4 ° c.에 20 분 동안 품 어
- 2.5 단계를 두 번 반복 합니다.
- 제거는 상쾌한 신중 하 게 andresuspend 얼음 차가운 SB에서 2 x 108 셀/mL의 농도에서 세포 펠 릿.
- SB의 3 mL와 자석에 큰 자석 열 equilibrate
- Equilibrated 칼럼의 상단에 2.9에서 세포 현 탁 액을 전송 하 고 완전히 방전 있습니다. 중요 한 단계: 열의 응집을 방지 하려면 70 µ m 나일론 메쉬를 통해 세포를 전달 합니다.
- 얼음 차가운 SB의 3 mL와 셀에 포함 된 튜브를 헹 구 고 (여과, 린스 70 µ m 나일론 메쉬)의 경우 열에 직접 버퍼 전송.
- 버퍼는 완전히 열에 물기를 때 열을 얼음 차가운 SB의 또 다른 3 mL를 추가 합니다.
- 또 다른 3 mL 세척을 위한 2.13 단계를 반복 합니다.
- 15 mL 원뿔 수집 관을 통해 자석과 장소에서 열을 제거 합니다.
- 열의 맨 위에 얼음 차가운 SB의 5 mL을 추가 하 고 즉시 플런저를 사용 하 여 열에서 셀을 플러시. 일단이 단계를 반복 합니다.
- 5 분 동안 460 x g에서 수집 된 세포 (농축된 관련 tetramer 포지티브 셀 분수) centrifuge 고 추가 항 체 얼룩이 계속 합니다.
참고: 수영장 셀에서에서 수집 모든 튜브, 적절 한 경우.
3. 자세-특정 인간 B 세포와 세포 분류의 얼룩
- C d 3에 대 한 반대로 인간 항 체의 칵테일 셀 펠 릿 resuspend (마지막 희석: 1시 20분), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50), 및 7AAD (1:1000) 2%와 PBS의 100 µ L의 최종 볼륨에서 FBS. 4 ° c.에 30 분 동안 품 어
- 셀, 5 분, 460 x g에서 원심 분리기에 PBS의 10 mL를 추가 하 고 제거는 상쾌한. 일단이 단계를 반복 합니다. PBS, 70 µ m 나일론 메쉬에 필터의 200 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
- 100 µ m-노즐 및 20 psi의 압력 셀 정렬 cytometer에 단일 세포 수준에서 특정 B 세포 1000 이벤트/s9를 초과 하지 않고 정렬로 이동 합니다.
참고: 사용 되는 제어 전략 그림 1. 에 표시 됩니다. 셀에 CD14 문이 먼저 했다-CD16-7AAD- 셀 제외 monocytes, NK, 죽은 세포 ( 그림 1에 표시 되지 않음). 다음 CD19+ B 셀 더블 스테인드 셀에 게이팅 하기 전에 PE와 송출 관련 Ag-tetramers에 의해 선정 됐다. 비 특정 B 세포 게이팅 BV421 부정적인 세포 (없는 Ag tetramer 여 흠 없는)에 의해 제외 되었습니다. - 8-스트립 PCR 튜브 10 µ L 1 x PBS의 RNAse 억제제의 10 단위 이전 가득 및 96 microtubes에 대 한 선반에 배치로 단일 B 세포를 수집 합니다. 즉시-80 ° c.에 PCR 튜브를 고정
참고: cytometer 악기에 선택 정렬 마스크는 마스크 수율: 0, 순도 마스크: 32, 그리고 위상 마스크: 0. 필요한 경우 단일 셀 보증금 96 또는 384 잘 PCR 접시에 조정 될 수 있었다. 단일 B 세포는 최대한 빨리 동결 해야 합니다 하 고 필요한 경우에 몇 주 동안-80 ° C에 남아 수 있습니다.
4. 단일 셀 RT-PCR
- 직접 건조 욕조에 5 분 동안 70 ° C에서 PCR 스트립에서 냉동된 샘플을가 열 하 여 세포를 lyse.
- 얼음 1 mM dNTP, 25 µ g/mL oligod(T) 뇌관, 5 µ M 임의의 hexamers, RNAse 억제제의 20 단위 및 역전사의 400 단위를 포함 하는 마스터 믹스 버퍼 x 2의 튜브 당 10 µ L을 추가 하 여 전송 (RT)를 진행 하는 스트립을 전송 합니다.
참고: 셀 녹고, 후 RT 수행 되어야 합니다 신속 하 게 RNA 강 직을 피하기 위해. - 교배, 50 ° C에서 1 시간에 대 한 품 어 그리고 반응을 중지를 3 분 동안 95 ° C에 외피와 마무리를 임의의 hexamers 수 있도록 5 분 동안 25 ° C에서 품 어.
- 각 인코딩 변수 무거운 (vH)와 카파 (vLκ) 또는 람다 경 쇄 (vLλ) 지역에 대 한 중첩 된 PCR 증폭의 2 라운드 진행.
참고: 또는, RT 샘플-20 ° C에서 냉동 고 1 주일 동안 보관.- PCR의 첫 번째 라운드에 대 한 추가 1.5 m m MgCl2, 0.25 m m dNTPs, DNA 중 합 효소의 2.5 단위 및 200를 포함 하는 40 µ L 최종 볼륨에 대 한 cDNA의 3 µ L 외부 뇌관 (뇌관 시퀀스 그림 2 및 테이블의 자료 를 참조)의 nM.
참고: 외부 뇌관 혼합의 구성입니다. 무거운 사슬 확대를 위한: 4 뇌관 (5' LVH 믹스) 전달 및 2 반전 뇌관 (3' CµCγ 믹스). 빛 카파 체인 확대를 위한 3는 앞으로 프라이 머 (5' LV | 혼합) 1 반전 뇌관 (3' Cκ543-566). 빛 람다 체인 확대, 7 전달 뇌관 (5' LVl 믹스) 및 1 반전 뇌관 (3' Cl).
참고: 뇌관은 모든 무 겁 고 가벼운 체인 가족 유전자5의 확대를 위한 경 운 기 외. 에 의해 디자인 되었다. - 자전거 다음과 적용: 4 분, 94 ° C 30의 40 주기 다음 94 ° C, 30에서 s s 58 ° C VH와 VLκ (VLλ에 대 한 60 ° C), 및 55에서 최종 신장으로 72 ° C에 7 분 동안 72 ° C에 단계.
- 두 번째 라운드 PCR에 대 한 사용 하 여 첫 번째 증폭 제품의 3 µ L 40의 최종 볼륨에 대 한 1.5 m m MgCl2, 0.25 m m dNTPs, DNA 중 합 효소의 2.5 단위 그리고 200 µ L 식으로 복제에 대 한 금지 효소 사이트를 포함 하는 내부 뇌관의 nM (뇌관 시퀀스 그림 2 및 테이블의 자료 를 참조)는 벡터
참고: 내부 뇌관 혼합의 구성입니다. 무거운 사슬 확대를 위한: 9 앞으로 프라이 머 (5' AgeIVH 믹스)와 3 반전 뇌관 (3' SalIJH 믹스). 빛 카파 체인 확대를 위한 9 뇌관 전달 (5' AgeIV | 믹스) 3 반전 뇌관 (3' BsiWIJκ 믹스). 빛 람다 체인 증폭 6 뇌관 (5' AgeIVl 믹스) 전달 및 1 반전 뇌관 (3' XhoICl).
참고: 뇌관 경 운 기 외., 모든5의 무 겁 고 가벼운 체인 가족 유전자 증폭에 의해 설계 되었습니다. - 자전거 다음과 적용: 4 분, 94 ° C 30의 40 주기 다음 s 94 ° C, 30에서 VH와 LCκ (LCλ에 대 한 60 ° C), 및 45 58 ° C에서 s s 최종 신장으로 72 ° C에서 7 분 동안 72 ° C에 단계.
- PCR의 첫 번째 라운드에 대 한 추가 1.5 m m MgCl2, 0.25 m m dNTPs, DNA 중 합 효소의 2.5 단위 및 200를 포함 하는 40 µ L 최종 볼륨에 대 한 cDNA의 3 µ L 외부 뇌관 (뇌관 시퀀스 그림 2 및 테이블의 자료 를 참조)의 nM.
- VH, vLκ 및 vLλ (500 bp 제품 가변 무거운 체인 인코딩 세그먼트에 대 한) 및 세그먼트를 인코딩 변수 빛 체인 350 bp 제품 1.5 %agarose 젤에 PCR 제품의 마이그레이션 5 μ에 의해 긍정적인 우물을 식별 합니다.
- 외 막 PCR 제품의 정화에 대 한 설계를 사용 하 여 양수 우물에서 남은 나머지 35 µ L PCR 제품을 정화.
- H2o.의 60 µ L PCR 제품을 elute
5. 식 복제
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삽입을 준비
참고: 소화 60 µ L 각 순화 된 PCR의 적절 한 제한 효소 버퍼를 포함 하는 100 µ L의 최종 볼륨에서 제품.- VH PCR 제품, 사리의 50 단위와 AgeI의 50 대를 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어
- VLλ PCR 제품, XhoI의 50 단위와 AgeI의 50 대를 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어
- VLκ PCR 제품을 위한 AgeI의 50 단위를 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어 96 PCR 멤브레인을 사용 하 여 다이제스트를 정화 BsiWI 제한 효소 버퍼의 100 µ L의 최종 볼륨에서 60 µ L eluate H2o. 다이제스트의 60 µ L 함께 elute, BsiWI, 50 단위를 추가 하 고 1 h 55 ° c.에 품 어
- 15 분 동안 80 ° C에가 열 하 여 효소 비활성화.
-
표현 하는 벡터의 준비
참고: vH PCR 제품 지속적인 무거운 체인 IgG1 Cγ1를 포함 하는 식 벡터 (HCγ1)에 복제 됩니다. vLκ PCR 제품 상수 빛 체인 Cκ를 포함 하는 식 벡터 (LCκ)에 복제 됩니다. vLλ PCR 제품 상수 빛 체인 Cλ를 포함 하는 식 벡터 (LCλ)에 복제 됩니다.- 다음 소화를 수행.
- 믹스 1 µ g 식의 HCγ1 AgeI의 10 단위와 사리 endonucleases, 제조업체에서 권장 하는 제한 버퍼의 20 µ L의 총 볼륨에서의 10 단위 벡터 그리고 1 h 37 ° c.에 품 어
- 제한 버퍼의 20 µ L의 전체 볼륨에 AgeI 제한 효소의 10 단위 식 벡터 LCκ의 믹스 1 µ g는 제조업체에서 권장 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어 BsiWI 제한 효소의 10 단위를 추가 하 고 1 시간 55 ° c.에 대 한 품 어
- AgeI의 10 단위 및 XhoI endonucleases 제한 버퍼의 20 µ L의 총 볼륨에서의 10 단위 식 벡터 LCλ의 믹스 1 µ g는 제조업체에서 권장 하 고 37 ° C에서 1 시간에 대 한 품 어
- 10 분 제한 효소 비활성화 65 ° C에서 각 소화 혼합물이 열.
- 2 µ L로 소화 PCR 제품의 5 µ L의 결 찰을 수행 (100 ng) 4 ° c.에서 하룻밤 배양 하 여 T4 DNA 리가의 1 단위와 DNA 리가 버퍼 x 1의 20 µ L의 총 볼륨의 해당 선형화 식 벡터의
참고: 또는, 결 찰 3 h 4 ° c.에 대 한 수행 됩니다.
- 다음 소화를 수행.
-
복제
- 수 제 electrocompetent TOP10 대장균 (섹션 1.8.4-1.8.8 분자 생물학에 있는 현재 프로토콜)의 45 µ L로 20 µ L 결 찰 혼합물의 Electroporate 1 µ L. 즉시 2 X YT 매체의 500 µ L을 추가 하 고 변형 확산 박테리아 YT 암 피 실린 판 x 2에 30 분 동안 37 ° C에서 물 욕조에 품 어. 37 ° c.에서 밤새 품 어
- 각 변환에 대 한 8 개의 식민지 PCR에 의해 화면.
- 얼음에 다음과 같이 반응 프리 믹스를 설정: PCR 버퍼, MgCl2 (25 m m)의 12 µ L, (에서 각각의 주식 포함 10 mM) dNTPs의 4 µ L, 앞으로 뇌관 (주식 10 µ M) 벡터 시퀀스 (뇌관 Ab vec 감지) 하 교배 시키기의 10 µ L x 5의 45 µ L 그리고 지속적인 무거운 또는 가벼운 체인 지역 타겟팅 역방향 뇌관 (주식 10 µ M)의 10 µ L (뇌관 시퀀스에 대 한 재료의 표 참조). H2o. 200 µ L의 최종 볼륨을 구성 하 DNA 중 합 효소 효소 (5 U / µ L)의 4 µ L를 추가 합니다.
- 얼음에 8 스트립 PCR 튜브 당 반응 프리 믹스의 25 µ L를 배포 합니다.
- 메 마른이 쑤 시 게를 사용 하 여 개별 식민지를 데리 러. 복제 판을 구성 하 여 PCR 반응 관에 그것을 찍어 2 x TY 암 피 실린 접시에 이쑤시개 행진
- 다음 자전거 조건 심사 PCR을 수행: 10 분, 94 ° C 30의 25 주기 다음 s 94 ° C, 30에서 55 ° c, s 및 50 72 ° c.에 s
- 1.5 %agarose 젤에 PCR 제품의 마이그레이션 5 µ L에 의해 긍정적인 박테리아를 식별 합니다.
참고: 긍정적 식민지에 게 PCR 제품 약 850 무거운 체인 벡터 및 600 bp bp 빛 체인 벡터에 대 한.
- 복제 판에서 4 개의 긍정적인 식민지 파운드 매체의 2 mL에 접종 하 고 하룻밤 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.
- 제조 업체에 의해 표시 된 대로 플라스 미드 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 액체 문화에서 추출 합니다.
- 생어 변수 도메인의 정확한 삽입 확인 Ab vec 감지 뇌관 플라스 미드의 연속.
참고: 올바른 삽입 (HC 및 해당 LC 인코딩) 플라스 미드는 분 비에 대 한 293A 셀으로 cotransfected 이다. 작은 규모 생산 mAbs의 특이성은 ELISA에 의해 분석 됩니다. 다음, 대규모 생산은 해당 하는 경우 수행 됩니다.
6입니다. mAbs의 생산
-
특이성 검사에 대 한 작은 규모의 생산
- 200 µ L의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 보충에 전날 transfection, 씨앗 15000 인간 미 발달 신장 293A (293A HEK) 세포 당 96 잘 접시에 잘 FBS. 37 ° c.에는 CO2 (5% CO2) 인큐베이터에서 밤새 품 어
- DMEM 매체 10% 포함 된 293A 셀 cotransfect FBS transfection 시 약으로 선형 polyethylenimine 파생을 사용 하 여.
참고: triplicates에 있는 transfection를 수행 합니다. 다음 프로토콜 플랫 바닥 96 잘 접시의 한 잘 이다.- 150 mM NaCl의 10 µ L에 0.5 µ L DNA transfection 시 약의 희석. 150 mM NaCl의 10 µ L로 0.125 µ g의 vH와 vL 표현 벡터의 0.125 µ g을 희석. 와 동 각 희석 10 s.
- 10 µ L 희석 DNA transfection 시 약 10 µ L DNA 솔루션에 추가 합니다. 소용돌이 15 s와 실 온에서 15 분 동안 품 어. 293A 셀에 drop-wise 20 µ L 믹스를 추가 하 고 부드럽게 접시 소용돌이 의해 혼합.
- 혈 청 무료 매체에서 5 일 동안 transfection 및 문화 셀 후 중간 16 h를 교체 합니다.
주: 혈 청 자유로운 매체를 사용 하 여 혈 청 Igs 항 체 생산된 오염 방지. - 5 분 동안 460 x g에서 원심 분리 하 여 세포와 파편을 제거 합니다.
- 다중 채널 피 펫과 포부에 의해 supernatants 수확 하 고 V-하단 96 잘 접시에 그들을 전송.
- 외 투 관련 Ag 재구성된 ELISA/ELISPOT 코팅의 당 100 µ L에 4 ° C에서 하룻밤 96-잘 ELISA 격판덮개에 2 µ g/mL의 최종 농도에 1 x를 버퍼링 합니다. 9에서 예제를 참조 하십시오.
- 37 ° C에서 2 시간에 대 한 10% FBS DMEM 매체와 웰 스 블록
- 6.1.5, 단계에서 transfected 293A 셀의 supernatants의 50 µ L을 추가 하 고 실시간에 2 h에 대 한 품 어
- 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 효소 1 µ g/mL에서 IgG Ab 활용 하는 반 인간의 100 µ L을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 50 µ L 비 기판 (TMB), 추가 하 고 20 분 동안 품 어.
- 450에서 광학 밀도 읽기는 분 광 광도 계에 nm.
참고: 특정 mAbs ELISA 분석 결과 의해 밝혀 더 큰 규모에서 생성 될 수 있다 고 순화 단백질에 인간 IgG에 대 한 선호도 제시 하는 열.
-
대규모 생산 및 특정 mAbs의 정화
- 전날 transfection, 씨앗 6 x 106 인간 미 발달 신장 293A (293A HEK) 25 mL DMEM 10% 보충을 포함 하는 175 cm2 플라스 크에 세포 FBS. 37 ° c.에는 CO2 (5% CO2) 인큐베이터에서 밤새 품 어
참고: 셀 70% 합칠 때 페 이어야 한다. - DMEM 매체 10% 포함 된 293A 셀 cotransfect FBS transfection 시 약으로 선형 polyethylenimine 파생을 사용 하 여.
- 150 mM NaCl의 450 µ L로 DNA transfection 시 약의 50 µ L를 희석. 150 mM NaCl의 500 µ L에 10 µ g의 vH와 vL 표현 벡터 10 µ g을 희석. 10 소용돌이 s 각 희석.
- DNA 솔루션을 희석된 DNA transfection 시 약을 추가 합니다. 소용돌이 15 s와 실 온에서 15 분 동안 품 어. 셀, drop-wise 1 mL 믹스를 추가 하 고 부드럽게 플라스 크를 소용돌이 의해 혼합.
- 혈 청 무료 매체에서 5 일 동안 transfection 및 문화 셀 후 중간 16 h를 교체 합니다.
- 25 mL 피 펫으로 발음 하 여 매체를 수확.
- 5 분 동안 460 x g에서 원심 분리 하 여 세포와 파편을 제거 합니다.
- 4 ° c.에 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템에 단백질 코팅 1 mL 열을 사용 하 여 항 체 정화
- 단백질 sepharose 열 20 m m 인산 버퍼 (pH 7) equilibrate
- 6.2.5 1.22 µ m 필터 다음 0.45 μ m 필터를 사용 하 여에서 세포 배양 매체를 필터링 합니다.
- 열에 필터링 된 매체를 로드 하십시오.
- 20 m m 인산 버퍼 (pH 7)로 세척 하 고 0.1 M 구 연산 염 버퍼 (pH 3.5)와 함께 elute.
- 280에서 광학 밀도 읽고 nm 흡수 분 광 광도 계에 그리고 즉시 중화 1 M Tris 버퍼 (pH 9) 단백질을 포함 하는 분수.
- 3.5 K 분자량 PBS 버퍼 (pH 7.4)에 대 한 차단으로 카세트에 4 ° C에서 하룻밤 순화 Ab dialyze
- 0.2 µ m 여과 및 제어 순으로 제조 업체에 의해 표시 된 크기 배제 크로마토그래피에 의해 소독.
- 전날 transfection, 씨앗 6 x 106 인간 미 발달 신장 293A (293A HEK) 25 mL DMEM 10% 보충을 포함 하는 175 cm2 플라스 크에 세포 FBS. 37 ° c.에는 CO2 (5% CO2) 인큐베이터에서 밤새 품 어
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결과
이 프로젝트 선물 Pp65495 펩 티 드를 인식 인간의 mAbs의 세대 건강 한 기증자에서 PBMC에서 출발 (Pp65, 인간의 세포에서) 제시한 중요 한 조직 적합성 복잡 한 클래스 나 (MHC-나) 분자 HLA-A * 0201 ( HLA-A2). 이러한 mAbs이 복잡 하 고 다른 펩 티 드 같은 MHC에 적재를 대표 하는 단지 사이 차별 수-내가 분자.
PBMC는 HLA A2/Pp65 PE, HLA-A2/Pp65-APC와 HLA A2/MelA2 BV421 tetramers 위의 프로토콜에 설명 된 대로 얼룩이 있었다. Immunomagnetic PE 및 APC tetramer 포지티브 셀의 셀 농축, 후 eluted 셀 추가 mAbs와 얼룩이 있었다. 교류 cytometry 셀 정렬에서 자석으로 풍부한 셀 처음 가능한 CD14에 문이 했...
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토론
제안 된 프로토콜 Ag 특정 B 세포는 혈액 순환에서 직접 인간의 mAbs의 세대에 대 한 강력한 방법입니다. 그것은 세 가지 중요 한 측면을 결합 한다: (i) tetramer 관련 자기 농축, 심지어 드문 Ag 바인딩 B 세포;의 비보 전 격리 수 있는의 사용 (ii)을 사용 하 여 3 Ag tetramers (2 개의 관련 것 들 그리고 한 없는 하나) 이라는 세 가지 다른 형광으로, cytometry, 여 BCR 특정 원하는 Ag;에 대 한 표현 B 셀만 제어 전략 (iii) 해당 재조합의 재건 mAb cDNAs RT-PCR에 의해 단일 세포 수준 및 인간 세포에서 cDNAs의 표현.
이전 연구는 mAbs는 격리 된 B 세포6,7,8에서 정렬 및 후속 생산 전에 인간 B 세포를 하나 또는 두...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 전문가 기술 지원을 위한 Cytometry 시설 "CytoCell" (SFR 건강, Biogenouest, 낭트) 감사합니다. 우리는 그들의 기술 지원에 대 한 또한 모든 직원을의 재조합 단백질 생산 (P2R) 및 영향 플랫폼 (INSERM 1232, SFR 건강, Biogenouest, 낭트)의 감사합니다. 우리에 대 한 건설적인 의견 원고 에마뉘엘 Scotet 및 리처드 Breathnach 감사합니다. 이 작품 «Investissements d'Avenir» 프랑스 정부 프로그램, 여는 프랑스 국가 연구 기관 (ANR) (ANR-10-IBHU-005) 관리에 의해 자금 IHU Cesti 프로젝트에 의해 재정적으로 지원 되었다. IHU-Cesti 프로젝트도 낭트 메트로 지구의 드 라 루아르에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 미래의 프로그램 ANR-11-LABX-0016-01의 투자를 통해 국립 연구 기관에서 지 원하는 LabEX IGO 프로그램의 맥락에서 실현 했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| HEK 293A 세포주 | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphate 완충 식염수(10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll - 림프구 분리 중간 EuroBio | CMSMSL01-01 | 밀도 1,0777+/-0,001 | |
| 스트렙타비딘 R-피코에리트린 접합체 | Life Technologies | S21388 | 프리미온 등급 1mg/ml에는 5mM 아지드화 나트륨 |
| 스트렙타비딘, 알로피코시아닌 접합체 | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM 아지드 프리미엄 등급 |
| 브릴리언트 바이올렛 421 스트렙타비딘 | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Anti-PE 공액 자성 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC 공액 자성 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs 또는 QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS 컬럼 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | 사용 희석 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | 사용 희석 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | 사용 희석 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | 중고 희석 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
| 8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | 수량:5000U (40U/ul) |
| Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | : 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | 수량 : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, 분자 생물학 등급 | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG | PCR의 첫 번째 라운드 - 중쇄 증폭 - 외부 프라이머 - Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG | PCR 1차 - 중쇄 증폭 - 외부 프라이머 - 포워드 프머 |
| 5LVL4_6 | 유로핀 | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG | PCR 1차 라운드 - 중쇄 증폭 - 외부 프라이머 - 포워드 Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG | PCR 1차 - 중쇄 증폭 - 외부 프라이머 - 포워드 Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT | PCR 1차 - 중쇄 증폭 - 외부 프라이머 - 인간 Ig- 박테리아 PCR 스크리닝을 위한 역 프라이머 |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA | PCR 1차 - 중쇄 증폭 - 외부 프라이머 - 인간 Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC 위한 역방향 프라이머 GAGGTGCAGCTGGTGCAG | PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄의 증폭 - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG | PCR의 두 번째 라운드 - 헤비 체인의 증폭 - 내부 프라이머 - 유로 |
| 핀 | 5AgeIVH3_23 | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG | PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄의 증폭 - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG | PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄의 증폭 - 내부 프라이머 - 유로 |
| 핀5AgeIVH4_34 | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG | PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄 증폭 - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 | |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG | PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄의 증폭 - 내부 프라이머 - |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG | PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄 증폭 - 내부 프라이머 - |
| Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT 5AgeIVH3__9_30_33 포워드 프라이머 GAAGTGCAGCTGGTGGAG | PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄의 증폭 - 내부 프라이머 - | |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG | PCR의 두 번째 라운드 - 헤비 체인의 증폭 - 내부 프라이머 - |
| Eurofins | TGCGAAGTCGACG 3SalIJH1_2_4_5 포 | 워드 프라이머PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄의 증폭 - 내부 프라이머 - 역방향 프라이머 | |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG | PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄 증폭 - 내부 프라이머 - 역방향 프라이머 |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG | PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄 증폭 - 내부 프라이머 - 역방향 프라이머 |
| 5' LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG | PCR 1차 - 경쇄 증폭 k - 외부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG | PCR 1차 - 경쇄 증폭 k - 외부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 5'LVk4 | 유로핀 | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG | PCR의 첫 번째 라운드 - 경쇄 증폭 k - 외부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA | PCR의 첫 번째 라운드 - 경쇄 증폭 k - 외부 프라이머 - 역 프라이머- 박테리아 PCR 스크리닝 |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC | PCR의 두 번째 라운드 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 5'AgeIVk1_9_1– 13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT | PCR 2차 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 -포워드 프라이머 |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC | PCR 2차 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 -포워드 프라이머 |
| 5'AgeIVk2 | 유로핀 | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC | PCR 2차 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC | PCR 2차 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | 유로핀 | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC | PCR 2차 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC | PCR 2차 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | 유로핀 | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTGTTGACGCAGTCT | PCR의 두 번째 라운드 - 경쇄의 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC | PCR의 두 번째 라운드 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC | PCR의 두 번째 라운드 - 라이트 체인 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC | PCR의 두 번째 라운드 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC | PCR의 두 번째 라운드 - 라이트 체인 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 5'LVl1 | 유로핀 | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG | PCR의 첫 번째 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 - 앞으로 프라이머 |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG | PCR의 첫 번째 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 - 앞으로 프라이머 |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG | PCR의 첫 번째 라운드 - 가벼운 체인 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 - 앞으로 프라이머 |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG | PCR 첫 번째 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 -앞으로 프라이머 |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG | PCR의 첫 번째 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 -앞으로 프라이머 |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG | PCR 첫 번째 라운드 - 라이트 체인 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG | PCR의 첫 번째 라운드 - 라이트 체인 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG | PCR의 첫 번째 라운드 - 라이트 체인 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 - 앞으로 프라이머 |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG | PCR 두 번째 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 내부 프라이머 -앞으로 프라이머 |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG | 두 번째 PCR 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 내부 프라이머 -앞으로 프라이머 |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG | PCR 두 번째 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 내부 프라이머 -포워드 프라이머 |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA | 두 번째 PCR 라운드 - 라이트 체인 &lambda의 증폭; - 내부 프라이머 -포워드 프라이머 |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG | PCR 두 번째 라운드 - 경쇄 &lambda의 증폭; - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG | PCR의 두 번째 라운드 - 라이트 체인 &lambda의 증폭; - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머 |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG | PCR의 두 번째 라운드 - 경쇄 및 람다의 증폭; - 내부 프라이머 - 역 프라이머 - 박테리아 PCR 스크리닝 |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC | 박테리아 PCR 스크리닝 |
| QA Agarose-TM, 분자 생물학 등급 | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR 플레이트 | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| 효소 연령 I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| 효소 Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| 효소 BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank 등록 번호 FJ475055) | |||
| LCk (Genbank 등록 번호 FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank 가입 번호 번호 FJ517647) | |||
| T4 DNA 리가제 | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT 매체 | 시그마 알드리치 | Y1003-500ML | |
| 암피실린 | 시그마 알드리치 | 10835242001 | |
| LB (루리아 베르타니) 육수 (레녹스) | 시그마 알드리치 | L3022-250G | |
| 뉴클레오스핀 플라스미드 DNA, RNA 및 단백질 정제 | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA 형질주입 시약 | PolyPlus | 101-40 | |
| 평평한 바닥96웰 플레이트 | Falcon | 353072 | |
| V-bottom 96웰 플레이트 | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 플라스크 | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT 코팅 완충액 | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp 평평한 바닥 96 웰 ELISA 플레이트 | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | 고단백질 결합 |
| 항-인간 IgG Ab 양고추냉이 과산화효소(HRP)에 접합 | Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB 기질 | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap 단백질 A HP 컬럼 | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| Ä KTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL 컬럼 | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus 크로마토그래피 시스템 | BioRad | 7880003 |
참고문헌
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
- Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
- Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
- Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
- Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532(2011).
- Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
- Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3(2017).
- Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
- Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
- Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
- Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France
