유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

Summary

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

Abstract

연구 단계에 종속적으로 세포 주기의 다양 한 규제 이벤트의 세포 성장 및 부문에 대 한 명확한 이해를 제공합니다. 세포 인구 세포 사이클의 특정 단계에서 동기화 실험적인 노력에 매우 유용 하 게 발견 되었습니다. 치료는 상대적으로 덜 독성 화학 물질에 의해 세포의 동기화 연구 결과 세포 주기 이벤트 하 고 선택한 mitotic 단계의 특정 농축을 위한 약리 억제 약물의 사용을 통해 유리한 수 있습니다. 동기화 인간의 세포는 세포의 여러 단계에서 S 단계 및 이중 티 미 딘 블록와 M 단계 모두를 포함 하 여 주기 고 염색체 정렬에 mitotic 단백질의 기능을 공부에 대 한 절차를 공개 프로토콜 설명 하는 여기, 그리고 분리입니다. 이 프로토콜 설립된 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할을 공부 하는 데 매우 유용 했습니다. 우리의 경우에서 Cdt1, 복제 원점 g 1 단계에서 라이센스에 대 한 중요 한 단백질의 mitotic 역할 수 수 공부 효과적으로 g 2/M-특정 Cdt1 고갈 될 수 있는 경우에. 우리는 더블 티 미 딘 동기화를 사용 하 여 g 2/M-특정 Cdt1의 고갈에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 또한 셀 고정, 프로토콜을 설명 하 고 라이브 셀 이미징 티 미 딘 릴리스 후 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여. 방법은 하나 고정 및 라이브 셀 mitotic 세포의 큰 샘플 크기를 수 있습니다 Hec1, 복잡 한, Ndc80의 구성 요소와 같은 생리 적 및 교란 조건에서 mitotic 단백질의 기능을 분석 하는 데 유용도 분석으로 우리가 여기에 표시.

Introduction

세포 주기에서 세포 그들의 게놈 및 확산의 정확한 복제에 대 한 높은 규제 하 고 일시적으로 제어 이벤트의 시리즈를 받 다. 포유류에서 세포 주기 interphase 및 M으로 구성 됩니다. Interphase에 구성 된 3 단계-G1, S, 및 g 2 셀 그것의 게놈을 복제 하 고 정상적인 세포 주기 진행^1,2에 필요한 증가 겪 습. M-단계에서 이루어진 유사 분열 (의향, prometaphase, 분열, anaphase, 및 telophase) cytokinesis, 부모의 셀 두 유전으로 동일한 딸 세포를 생성 합니다. 그 뒤 분열 중 기 격판덮개 (분열)에 그들의 정렬 드라이브 유사 분열, 중복 된 게놈의 chromatids 압축된 (의향) 이며 조립된 mitotic 스핀 들 (prometaphase)의 microtubules 잡혀 자신의 kinetochores에 자매 들 자매 chromatids는으로 분할 하 고 반대 스핀 들 이송 기둥 (anaphase) 분리를 동등한. 2 개의 딸 세포는 걸 기반으로 수축 성 반지 (telophase 및 cytokinesis)의 활동에 의해 물리적으로 구분 됩니다. kinetochore chromatids의 centromeric 지역에서 조립....

Protocol

1. 더블 티 미 딘 블록 및 릴리스: 시 약 준비

1. 500 mL Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 매체와 10 %FBS, 페니실린, 스 보충을 확인 합니다.
2. 살 균 물과 aliquots-80 ° c.에 있는 매장에서 티 미 딘 100 m m 재고 확인

2. 프로토콜 Mitotic 진행 (그림 1A)의 고정된 셀 이미징에 대 한

1. 6 잘 플레이트 커버 슬립 (70% 에탄올과 UV 방사선 살 균)과 DMEM 매체의 2 mL의 우물으로 하루 1, 10⁵ HeLa 세포 x 씨 ~ 2. 37 ° C, 5% CO₂에서 24 h에 대 한 습도 인큐베이터에서 세포 성장.
2. 1^세인트 티 미 딘 블록: 하루에 2, 철저 하 게 신선한 DMEM 미디어 (100 m m 재고, 2mm 최종 농도)에 티 미 딘의 필요한 볼륨을 혼합.
3. 티 미 딘을 포함 하의 2 개 mL를 추가 셀 6-우물의 각 음에 미디어 접시 및 18h에 품 어.
4. 3 일에 매체를 발음 하 고 씻고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 셀과 신선한 prewarmed D....

Results

Mitotic 진행 및 셀에서 microtubule 안정성의 연구에서 출시 후 두 티 미 딘 블록 고정
Cdt1 g 1 단계에서 DNA 복제 근원의 라이선스에 포함 된다. 그것은 S 단계 저하 하지만 다시 G2/M 단계에 축적. 공부 하 고 유사 분열에서의 역할, 생 Cdt1를 사용 하 여 가장 적합 한 셀 동기화 기법, 더블 티 미 딘 블록¹⁵G/M 단계에서 구체적으로 고갈 될 필요가 있다. 셀에에서 있을 때 셀 S 단계 및 시간에 의해 또한 Cdt1 기능 필요, g 1에서 복제 근원의 라이선스 오래 완료 2^nd 티 미 딘 블록에서 출시 직후 siRNAs와 페 했다. 9 h siCdt1 transfection와 더블 티 미 딘 블록 출시 후 Cdt1 고갈 부 럽 (그림 1B)에 의해 검증 되었다. 고정 셀 9 h 이중 .......

Discussion

이중 티 미 딘 동기화의 가장 중요 한 장점은 이러한 세포 유사 분열 염색체 맞춤, 양극의 분석 또한 활성화 한 마음으로 입력의 많은 짧은 시간 창에 mitotic 세포의 증가 샘플 크기 제공 훨씬 더 높은 효율성과 형성과 염색체 분리를 주축.

많은 규제 단백질 복합물 및 신호 통로 유사 분열을 통해 정상적인 진행을 보장에 헌신 하는 고이 과정의 규제 완화 수 있습니다 tumorigenesis. 라이브 셀 이미징 HeLa 세포 안정적으로 mCherry H2B와 GFP tubulin 그리고 대부분 제어 셀 코 (그림 3B) 후 anaphase 약 60 분 이내에 그들의 염색체 분리 이중 티 미 딘 블록 쇼에서 발표의. 다른 한편으로, Hec1 기능을 보여줍니다 대부분 셀 고르지 염색체 anaphase 발병 또는 apoptosis (그림 3C)와 오랜 기간 동안 mitotic .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	4 °에 저장; C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	4 °에 저장; C
레보비츠' s (1x) L-15 medium	Life Technologies	21083-027	4 °에 저장; C
세럼 감소 매체 (Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	Store at 4 ° C
페니실린과 스트렙토 마이신	생명 기술	15070-063 (펜 스트렙)	1 : 1,000 희석
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	4 °에 저장; C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	멸균 용해수에 용해
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
GFP-H2B
세포 GFP-&알파;-튜불린 및 mCherry H2B	도호쿠의 Kozo Tanaka 박사의 관대한 선물 일본
포름알데히드 용액	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	독성, 주의 필요
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	독성, 주의 필요
마우스 안티-&알파;-튜불린	Santa Cruz Biotechnology	Sc32293	1:1,000 희석
토끼 개미-Zwint1	Bethyl	A300-781A	1:400 희석
마우스 anti-phospho-γ H2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, 클론 JBW301	1:300 희석
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250 희석
Rodamine Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 희석
BioLite 6 웰 멀티디쉬	Thermo Fisher Scientific	130184
35mm 유리 바닥 접시	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
니콘 이클립스 TiE 도립 현미경	니콘 악기
컨포칼 용 회전 디스크	요카가와	CSU-X1
울트라 888 EM-CCD 카메라	Andor	iXon 울트라 EMCCD
4 파장 레이저	현미경 용 애질런트 기술
인큐베이션 시스템	Tokai Hit	TIZB
NIS-elements 소프트웨어	Nikon Instruments