선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.
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방법 논문
유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법
이 논문에서
요약
초록
연구 단계에 종속적으로 세포 주기의 다양 한 규제 이벤트의 세포 성장 및 부문에 대 한 명확한 이해를 제공합니다. 세포 인구 세포 사이클의 특정 단계에서 동기화 실험적인 노력에 매우 유용 하 게 발견 되었습니다. 치료는 상대적으로 덜 독성 화학 물질에 의해 세포의 동기화 연구 결과 세포 주기 이벤트 하 고 선택한 mitotic 단계의 특정 농축을 위한 약리 억제 약물의 사용을 통해 유리한 수 있습니다. 동기화 인간의 세포는 세포의 여러 단계에서 S 단계 및 이중 티 미 딘 블록와 M 단계 모두를 포함 하 여 주기 고 염색체 정렬에 mitotic 단백질의 기능을 공부에 대 한 절차를 공개 프로토콜 설명 하는 여기, 그리고 분리입니다. 이 프로토콜 설립된 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할을 공부 하는 데 매우 유용 했습니다. 우리의 경우에서 Cdt1, 복제 원점 g 1 단계에서 라이센스에 대 한 중요 한 단백질의 mitotic 역할 수 수 공부 효과적으로 g 2/M-특정 Cdt1 고갈 될 수 있는 경우에. 우리는 더블 티 미 딘 동기화를 사용 하 여 g 2/M-특정 Cdt1의 고갈에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 또한 셀 고정, 프로토콜을 설명 하 고 라이브 셀 이미징 티 미 딘 릴리스 후 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여. 방법은 하나 고정 및 라이브 셀 mitotic 세포의 큰 샘플 크기를 수 있습니다 Hec1, 복잡 한, Ndc80의 구성 요소와 같은 생리 적 및 교란 조건에서 mitotic 단백질의 기능을 분석 하는 데 유용도 분석으로 우리가 여기에 표시.
서론
세포 주기에서 세포 그들의 게놈 및 확산의 정확한 복제에 대 한 높은 규제 하 고 일시적으로 제어 이벤트의 시리즈를 받 다. 포유류에서 세포 주기 interphase 및 M으로 구성 됩니다. Interphase에 구성 된 3 단계-G1, S, 및 g 2 셀 그것의 게놈을 복제 하 고 정상적인 세포 주기 진행1,2에 필요한 증가 겪 습. M-단계에서 이루어진 유사 분열 (의향, prometaphase, 분열, anaphase, 및 telophase) cytokinesis, 부모의 셀 두 유전으로 동일한 딸 세포를 생성 합니다. 그 뒤 분열 중 기 격판덮개 (분열)에 그들의 정렬 드라이브 유사 분열, 중복 된 게놈의 chromatids 압축된 (의향) 이며 조립된 mitotic 스핀 들 (prometaphase)의 microtubules 잡혀 자신의 kinetochores에 자매 들 자매 chromatids는으로 분할 하 고 반대 스핀 들 이송 기둥 (anaphase) 분리를 동등한. 2 개의 딸 세포는 걸 기반으로 수축 성 반지 (telophase 및 cytokinesis)의 활동에 의해 물리적으로 구분 됩니다. kinetochore chromatids의 centromeric 지역에서 조립....
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프로토콜
1. 더블 티 미 딘 블록 및 릴리스: 시 약 준비
- 500 mL Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 매체와 10 %FBS, 페니실린, 스 보충을 확인 합니다.
- 살 균 물과 aliquots-80 ° c.에 있는 매장에서 티 미 딘 100 m m 재고 확인
2. 프로토콜 Mitotic 진행 (그림 1A)의 고정된 셀 이미징에 대 한
- 6 잘 플레이트 커버 슬립 (70% 에탄올과 UV 방사선 살 균)과 DMEM 매체의 2 mL의 우물으로 하루 1, 105 HeLa 세포 x 씨 ~ 2. 37 ° C, 5% CO2에서 24 h에 대 한 습도 인큐베이터에서 세포 성장.
- 1세인트 티 미 딘 블록: 하루에 2, 철저 하 게 신선한 DMEM 미디어 (100 m m 재고, 2mm 최종 농도)에 티 미 딘의 필요한 볼륨을 혼합.
- 티 미 딘을 포함 하의 2 개 mL를 추가 셀 6-우물의 각 음에 미디어 접시 및 18h에 품 어.
- 3 일에 매체를 발음 하 고 씻고 1 x PBS의 2 mL로 두 번 셀과 신선한 prewarmed D....
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결과
Mitotic 진행 및 셀에서 microtubule 안정성의 연구에서 출시 후 두 티 미 딘 블록 고정
Cdt1 g 1 단계에서 DNA 복제 근원의 라이선스에 포함 된다. 그것은 S 단계 저하 하지만 다시 G2/M 단계에 축적. 공부 하 고 유사 분열에서의 역할, 생 Cdt1를 사용 하 여 가장 적합 한 셀 동기화 기법, 더블 티 미 딘 블록15G/M 단계에서 구체적으로 고갈 될 필요가 있다. 셀에에서 있을 때 셀 S 단계 및 시간에 의해 또한 Cdt1 기능 필요, g 1에서 복제 근원의 라이선스 오래 완료 2nd 티 미 딘 블록에서 출시 직후 siRNAs와 페 했다. 9 h siCdt1 transfection와 더블 티 미 딘 블록 출시 후 Cdt1 고갈 부 럽 (그림 1B)에 의해 검증 되었다. 고정 셀 9 h 이중 .......
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토론
이중 티 미 딘 동기화의 가장 중요 한 장점은 이러한 세포 유사 분열 염색체 맞춤, 양극의 분석 또한 활성화 한 마음으로 입력의 많은 짧은 시간 창에 mitotic 세포의 증가 샘플 크기 제공 훨씬 더 높은 효율성과 형성과 염색체 분리를 주축.
많은 규제 단백질 복합물 및 신호 통로 유사 분열을 통해 정상적인 진행을 보장에 헌신 하는 고이 과정의 규제 완화 수 있습니다 tumorigenesis. 라이브 셀 이미징 HeLa 세포 안정적으로 mCherry H2B와 GFP tubulin 그리고 대부분 제어 셀 코 (그림 3B) 후 anaphase 약 60 분 이내에 그들의 염색체 분리 이중 티 미 딘 블록 쇼에서 발표의. 다른 한편으로, Hec1 기능을 보여줍니다 대부분 셀 고르지 염색체 anaphase 발병 또는 apoptosis (그림 3C)와 오랜 기간 동안 mitotic .......
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공개 사항
저자 들은 경쟁 금융 관심 선언 합니다.
감사의 글
우리는 안정적으로 mCherry-히스톤 H2B GFP-α-tubulin 표현 HeLa 세포를 공유 하기 위한 동북 대학, 일본의 박사 고조 다나카에 감사. 이 작품은 DV (R00CA178188)에 NCI 그랜트와 노스웨스턴 대학에서 창업 자금 지원 되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM (1x) | Life Technologies | 11965-092 | 4 °에 저장; C |
| DPBS (1x) | Life Technologies | 14190-144 | 4 °에 저장; C |
| 레보비츠' s (1x) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | 4 °에 저장; C |
| 세럼 감소 매체 (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 ° C |
| 페니실린과 스트렙토 마이신 | 생명 기술 | 15070-063 (펜 스트렙) | 1 : 1,000 희석 |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | 4 °에 저장; C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | 멸균 용해수에 용해 |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| GFP-H2B | |||
| 세포 GFP-&알파;-튜불린 및 mCherry H2B | 도호쿠의 Kozo Tanaka 박사의 관대한 선물 일본 | ||
| 포름알데히드 용액 | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | 독성, 주의 필요 |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | 독성, 주의 필요 |
| 마우스 안티-&알파;-튜불린 | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1,000 희석 |
| 토끼 개미-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 희석 |
| 마우스 anti-phospho-γ H2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, 클론 JBW301 | 1:300 희석 |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 희석 | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 희석 | |
| BioLite 6 웰 멀티디쉬 | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35mm 유리 바닥 접시 | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| 니콘 이클립스 TiE 도립 현미경 | 니콘 악기 | ||
| 컨포칼 용 회전 디스크 | 요카가와 | CSU-X1 | |
| 울트라 888 EM-CCD 카메라 | Andor | iXon 울트라 EMCCD | |
| 4 파장 레이저 | 현미경 용 애질런트 기술 | ||
| 인큐베이션 시스템 | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements 소프트웨어 | Nikon Instruments |
참고문헌
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J.
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재인쇄 및 허가
