생체 외에서 Fabry에 Pompe 질병 테스트 약리 보호자 응답성을 효소 측정

Summary

전 임상 재현, 빠르고, 효율적인 약리 보호자를 호출 하는 "고아" 약물의 소설 클래스에 대 한 테스트 있도록 수요가 있다. 우리 소설 약리 보호자 약물으로 서 적격 환자에 대 한 간단 하 고, 고도로 표준화, 다양 한 세포 문화 기반 분석 결과 화면을 개발 했다.

Abstract

Lysosomal 저장 장애 (LSDs) 같은 희귀 monogenic 질병을 치료 하는 맞춤된 의학의 사용은 복잡 한 임상 시험 디자인, 높은 비용 및 낮은 환자 수에 의해 도전을 했습니다. 수백 개의 돌연변이 체 대립 유전자는 LSDs의 대부분에 연루 됩니다. 질병은 일반적으로 심각도 따라 2 ~ 3 가지 임상 유형으로 분류 됩니다. 또한, 유전자 형의 분자 특성 임상 결과 예측 하 고 환자 치료를 알릴 수 있습니다. 따라서, 우리는 heterologously-Fabry Pompe 질병에서 확인 된 돌연변이 표현 하는 HEK293H 세포에 따라 간단한 셀 문화 분석 결과를 개발 했다. 유사한 분석 결과 최근 Fabry 질병에 의무가 돌연변이 약리 보호자 치료 (에서 PCT)에 대 한 식별 하기 위해 전 임상 시험으로 도입 되었습니다. 이 원고는 PCT에 대 한 적격 환자 식별 Fabry Pompe 질병 유전자 이체의 신속한 phenotypic 평가 하 고 새로운 pharmacochaperones의 개발에 도움이 있습니다 개정된 셀 문화 분석 결과를 설명 합니다.

Introduction

12 lysosomal 저장 장애 (LSDs) 기본 유전자 변이 결과로 glycosidase 장애에 관련 된 이상 있다. Fabry (OMIM #301500) 병과 Pompe (OMIM #232300),^1,2,3 보고 되었습니다, 이상의 500와 200 missense 돌연변이에 각각,는 총 변이 수의 약 60%에 해당 합니다. 수많은 새로운 유전자 이체는 아직도 확인 되 고, 많은 알 수 없는 의미. 광범위 한 생 화 확 적인 연구 공개 완전 한 손실-의-함수에 GLA 유전자의 특정 genotypes 지도 하지 않는다 (OMIM * 300644) Fabry 질병에 발생 하지만 열역학으로 호의 보인 접는 상태가^{4 실패 해당 효소} . ER 보존과 달리 기능적인 효소의 조 저하 발생합니다. 유사한 결론 Pompe 질병⁵를 포함 하 여 다른 LSDs에 그려 왔다. 또한, 효소 이체의 분자 특성 진단⁶, LSD 진행은 돌연변이의 특성에 따라 개별 과정 제안 시 변이의 임상 해석을 촉진 수 있....

Protocol

1. 준비의 돌연변이 pcDNA3.1/GLA와 pcDNA3.1/GAA 구문

참고: GLA 와 GAA 코딩 시퀀스 (cd)에 대 한 복제 전략 보고 이전^15,18되었습니다.

1. 사이트 감독 Mutagenesis 사이트 지시 된 Mutagenesis를 사용 하 여
   1. 참조를 사용 하 여 시퀀스 NM_000169.2 및 NM_000152.4 mutagenesis GLA 와 GAA 유전자의에 대 한 템플릿으로 각각. 고 순도 소금 무료 뇌관 (25-37-mers) 개별적으로 돌연변이 소개 하는 그들의 길이 중앙 각각 시퀀스 수정 중 하나를 들고와 antisense 뇌관으로 상업적인 공급자에 의해 합성의 세트가 있다. 무료 뇌관 설계 도구를 사용 하 여 뇌관 디자인¹⁹를 지원 하기 위해.
   2. 반응 혼합물 반응 솔루션에 대 한 표준 조건 및 제조업체에서 제공 하는 PCR 상태를 사용 하 여.
      1. 믹스 5 µ L 반응 버퍼, 10 x 10의 더블-좌....

Results

Mutagenesis 절차
GLA 유전자 mutagenesis의 효율성을 평가 하는 돌연변이 다음 범주 중 하나로 분류 되었다. 이 방법은 돌연변이 생성 하는 GLA 돌연변이의 66.5%에 대 한 첫 번째 시도에서 가져온 밝혔다. 약간 수정 된 두 번째 PCR 후 추가 25%를 얻을 수 있습니다.

카테고리 1:는 mutagenesis PCR 첫 번째 시도에서 효과적 이었습니다.

카테고리 2: 첫 번째 mutagenesis PCR 실패 (접시, 아니 삽입된 돌연변이에 식민지); 어 닐 링 온도 증가 시켜 같은 뇌관을 사용 하 여 반복 설정 68 ° C 효과적 이었습니다.

Discussion

여기에 설명 된 프로토콜 대사의 유전 lysosomal 질병의 효소 손상 평가 대 한 강력한 결과 제공 합니다. 이 원고는 프로토콜 개정 출판 이전¹⁵입니다. 가장 중요 한 수정 포함 엄중 (즉, 돌연변이 벡터 구축 준비 과정), 세포 문화 프로토콜 (즉, HEK293H 셀 유지 보수 및 transfection 조건), 그리고 높은의 표준화 결과의 재현성에 매우 공헌한 실험 반복 (적어도 5)의 수입니다. 전부, 두 대상 유전자 mutagenesis에 쉽게 접근할 수 있으며 돌연변이의 다양성을 동시에 조립 될 수 있다. 상대적으로 높은 신호/잡음 비율 HEK293H 세포 내의 생 효소 활동은 무시할 수 1/50 (α-galactosidase A)과 지나치게 표현된 야생 유형 유전자의 1/20 (산 성 α-glucosidase) 고려 달성 했다. 따라서, 야생 유형 및 돌연변이 효소 사이 우수한 해상도가입니다. 총 단백질의 다른 금액 두 효소의 활동 분석 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
QuikChange II XL 부위 지시 돌연변이 유발 키트	Stratagene, La Jolla, CA, USA#	200522
프라이머 GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Primer
GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Primer
GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Primer
GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Primer
GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Primer
GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Primer
GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Primer
GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Primer
GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Primer
GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Primer
GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC CCC AGG CGG CCA C-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Primer
GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Primer
T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Primer
BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´	MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany	n.a.Tryptone
	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8952.1
효모 추출물	Merck, Darmstadt, Germany	103,753
염화나트륨	Merck, Darmstadt, Germany	1,064,041,000
Potasium chloride	Merck, Darmstadt, Germany	1,049,360,500
MgCl2 x 6H2O	Merck, 다름슈타트, 독일	1,058,330,250
D (+)-포도당 일수화물	Merck, 다름슈타트, 독일	1,083,422,500
수산화나트륨	Merck, 다름슈타트, 독일	1,064,980,500
글리신	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	3908.2
구연산	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	X863.3
인산수소이나트륨	Merck, 다름슈타트, 독일	1,065,860,500
아세트산나트륨	Merck, 다름슈타트,	독일 1,062,640,050
빙초산	Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일	A6283
LB Agar	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	X969.2
LB Medium	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	X968.2
Zyppy Plasmid Miniprep Kit	ZymoResearch, Freiburg, Germany	D4020
QIAfilter Plasmid Midi Kit	Qiagen, Hilden, Germany	12245
HEK293H cell line	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	11631-017
Dulbecco´ s 수정된 독수리 미디엄	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	31966-047
HyClone 태아 소 혈청	GE Healthcare, South Logan, Utah, USA	SV30160.03
페니실린/스트렙토마이신	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	15140-122
CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One	VWR International GmbH, Hannover, Germany	82050-854
Cell culture plates (24 well)	Sarstedt, Nü mbrecht, Germany	831,836
Cellstar 96 well plate	Greiner bio one, Frickenhausen, Germany	655185
SafeSeal 반응관, 1,5mL	사르스테트, Nü mbrecht, Germany	72,706
Lipofectamine 2000	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	11668-019
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride	Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일	D9641
1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride	토론토 연구 화학, 토론토, 캐나다	D236500
1-Deoxynojirimycin	Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일	D9305
PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium	Biochrom, Berlin, Germany	L 1825
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Scientific, Braunschweig, Germany	25300054
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific, Braunschweig, Germany	23225
4-methylumbelliferone	Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일	M1381
4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside	Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일	M7633
4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside	Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일	M9766
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Equipment
incubator type T6	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	n.a.Luminous
Plate Gr. 2 E	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P265.1
3130 xl 유전자 분석기	Applied Biosystems, 다름슈타트, 독일	n.a.GFL-3032
박테리아 셰이커	GFL, 부르크베델, 독일	n.a.Avanti
J-25 원심분리기	Beckman/Coulter, Krefeld, Germany	n.a.Ultraspec
3100 pro 분광광도계	Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom	n.a.water-jacket
incubator	Binder, Tuttlingen, Germany	n.a.Vortex
Genie 1 터치 믹서	Scientific Industries, Bohemia, NY, USA	n.a.Z
233 MK-2 냉장 마이크로튜브 원심분리기	Hermle, Tuttlingen, Germany	n.a.LaboStar
초순수 장치	Siemens, Berlin, Germany	n.a.Thermo
Shaker PST-60HL-4 orbital shaker	Biosan, Riga, Latvia	n.a.Tecan
GENios Reader	Tecan, Mä nnedorf, 스위스	n.a.HI
223 마이크로프로세서 pH 측정기	HANNA Instruments, Arvore, Portugal	n.a.CASY
Cell Counter + Analyser System Model TT	Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland
Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
Software
Magellan 데이터 분석 소프트웨어 v6.6	Tecan, Mä nnedorf, 스위스	n.a.GraphPad
Prism 5.04	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; 미국	n.a.Microsoft
Office 2010	Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA	n.a.BioEdit
Alignment Editor, V7.0.1	http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html	n.a.
Abbreviations
frw = forward; rev = reverse
n.a. = 해당 없음