전 임상 재현, 빠르고, 효율적인 약리 보호자를 호출 하는 "고아" 약물의 소설 클래스에 대 한 테스트 있도록 수요가 있다. 우리 소설 약리 보호자 약물으로 서 적격 환자에 대 한 간단 하 고, 고도로 표준화, 다양 한 세포 문화 기반 분석 결과 화면을 개발 했다.
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이 논문에서
요약
초록
Lysosomal 저장 장애 (LSDs) 같은 희귀 monogenic 질병을 치료 하는 맞춤된 의학의 사용은 복잡 한 임상 시험 디자인, 높은 비용 및 낮은 환자 수에 의해 도전을 했습니다. 수백 개의 돌연변이 체 대립 유전자는 LSDs의 대부분에 연루 됩니다. 질병은 일반적으로 심각도 따라 2 ~ 3 가지 임상 유형으로 분류 됩니다. 또한, 유전자 형의 분자 특성 임상 결과 예측 하 고 환자 치료를 알릴 수 있습니다. 따라서, 우리는 heterologously-Fabry Pompe 질병에서 확인 된 돌연변이 표현 하는 HEK293H 세포에 따라 간단한 셀 문화 분석 결과를 개발 했다. 유사한 분석 결과 최근 Fabry 질병에 의무가 돌연변이 약리 보호자 치료 (에서 PCT)에 대 한 식별 하기 위해 전 임상 시험으로 도입 되었습니다. 이 원고는 PCT에 대 한 적격 환자 식별 Fabry Pompe 질병 유전자 이체의 신속한 phenotypic 평가 하 고 새로운 pharmacochaperones의 개발에 도움이 있습니다 개정된 셀 문화 분석 결과를 설명 합니다.
서론
12 lysosomal 저장 장애 (LSDs) 기본 유전자 변이 결과로 glycosidase 장애에 관련 된 이상 있다. Fabry (OMIM #301500) 병과 Pompe (OMIM #232300),1,2,3 보고 되었습니다, 이상의 500와 200 missense 돌연변이에 각각,는 총 변이 수의 약 60%에 해당 합니다. 수많은 새로운 유전자 이체는 아직도 확인 되 고, 많은 알 수 없는 의미. 광범위 한 생 화 확 적인 연구 공개 완전 한 손실-의-함수에 GLA 유전자의 특정 genotypes 지도 하지 않는다 (OMIM * 300644) Fabry 질병에 발생 하지만 열역학으로 호의 보인 접는 상태가4 실패 해당 효소 . ER 보존과 달리 기능적인 효소의 조 저하 발생합니다. 유사한 결론 Pompe 질병5를 포함 하 여 다른 LSDs에 그려 왔다. 또한, 효소 이체의 분자 특성 진단6, LSD 진행은 돌연변이의 특성에 따라 개별 과정 제안 시 변이의 임상 해석을 촉진 수 있습니다. 따라서, 임상 상담 및 치료 결정을 합리화 하기 위해서는 일반적으로 2 ~ 3 가지 임상 유형으로 기존의 분류를 재평가 해야 합니다.
효소 대체 요법 (ERT)는 두 질병 수 있습니다. 그러나, ERT, 두뇌와 골격 근육 등 영향을 받는 조직/장기에서 효능을 제한 했다. 또한, ERT의 치료 혜택을 위태롭게 하는 면역성 응답을 유도 수 있습니다. 약리학 보호자 (Pc)는 소위 응답 돌연변이 가진 환자에 대 한 매력적인 치료 대안 이다. Pc는 올바른 단백질 폴딩 및 차례로 바인딩과 그물 (응급실) 보존 및 응급실 관련 효소의 저하를 방지 하는 안정화에 대 한 분자 비 계 역할을 합니다. 또한, Pc 구두로 관리 될 수 있습니다 그리고 잠재적으로 혈액 뇌 장벽을 교차 수 있습니다. 따라서, PCT에 특정 genotypes 가진 환자를 치료를 위한 더 실행 가능한 옵션이 있을 수 있습니다. LSDs 응용 프로그램 PC에 광범위 한 검토를 위해 Parenti7에 의해 우수한 검토를 참조 하십시오.
질병을 일으키는 돌연변이 체 대립 유전자의 수백의 발견 전 임상 약물 테스트에 도전 하 고 맞춤된 의학 접근에 대 한 의무가 환자가의 간단 하 고 빠른, 매우 표준화 된 평가 필요로. LSD 유전자 돌연변이의 해로운 효과 평가 하 고 예측 PCT에 대 한 의무가 환자 후보 돌연변이 테스트, 신속 하 고 신뢰할 수 있는 효소 활동 측정 허용 하는 HEK293H 세포에 매우 표준화 초과 식 시스템은 개발. 유사한 이상 식 시스템 이전 COS-78,,910,11, HeLa 세포12또는 HEK293 Fabry Pompe 질병에 대 한 설명 되었습니다13 ,14,,1516 셀 glycosidase 유전자에 대 한.
아주 유사한 방법도 약리 보호자 질병의 치료에 대 한 응답을 예측 하는 "방법"으로 특허 되었습니다17 셀의 관련성을 나타내는 문화 시스템 임상 연습으로 통합 되 고.
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프로토콜
1. 준비의 돌연변이 pcDNA3.1/GLA와 pcDNA3.1/GAA 구문
참고: GLA 와 GAA 코딩 시퀀스 (cd)에 대 한 복제 전략 보고 이전15,18되었습니다.
- 사이트 감독 Mutagenesis 사이트 지시 된 Mutagenesis를 사용 하 여
- 참조를 사용 하 여 시퀀스 NM_000169.2 및 NM_000152.4 mutagenesis GLA 와 GAA 유전자의에 대 한 템플릿으로 각각. 고 순도 소금 무료 뇌관 (25-37-mers) 개별적으로 돌연변이 소개 하는 그들의 길이 중앙 각각 시퀀스 수정 중 하나를 들고와 antisense 뇌관으로 상업적인 공급자에 의해 합성의 세트가 있다. 무료 뇌관 설계 도구를 사용 하 여 뇌관 디자인19를 지원 하기 위해.
- 반응 혼합물 반응 솔루션에 대 한 표준 조건 및 제조업체에서 제공 하는 PCR 상태를 사용 하 여.
- 믹스 5 µ L 반응 버퍼, 10 x 10의 더블-좌초 템플릿 플라스 미드 DNA (pcDNA3.1/GLA 또는 pcDNA3.1/GAA)의 ng 125 각 뇌관의, 제공된 dNTP 혼합물의 1 µ L, 이온된 수 (최종 반응 볼륨의 적절 한 볼륨 시 약 DMSO의 3 µ L : 50 Μ L). 마지막으로, 2.5 U의 DNA 중 합 효소를 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합. 부정적인 통제로 아니 뇌관 샘플 따라 수행.
- 다음 프로그램을 사용 하 여 PCR을 시작: 1 분 1: 95 ° C 단계, 단계 2: 95 ° C 50에 대 한 s, 단계 3시 60분 ° C 50에 대 한 s, 8 분 4: 68 ° C 단계, 18 번, 2-4 단계를 반복 하 고 단계 5: 68 ° C 10 분.
- Dpn의 1 µ L 추가 PCR, 다음 나 제한 효소 (10 U / µ L)와 추가 1 시간 동안 37 ° C에서 반응 유리병을 품 어.
- 변환 및 원하는 클론을 위한 심사
- 제조업체의 권장 사항 따라 ultracompetent 셀의 약 수를 변환 합니다. 사용 SOC 매체 (0.5% (w/v), NaCl 10 m m, KCl 2.5 m m를 추출, 121 ° c, 소독 및 살 균 필터링 솔루션 MgCl2 , 10 및 20 m m의 최종 농도까지 포도 당을 각각 추가 tryptone 2% (w/v), 효 모) 제조업체의 대신 중간입니다. 절차 후 샘플 mutagenesis는 파운드에의 플레이트 250 µ L 플레이트 포함 100 µ g/mL 암 피 실린 고 18 h 37 ° C에서 품 어.
- Transformants의 수는 보장 > 10 반응 생성 적어도 3 배 많은 식민지는 no-뇌관 제어 반응으로, 예를 들면, 식민지 계산을 촉진 하기 위하여 발광 격판덮개를 사용 하 여. 3 식민지를 선택 그리고 파운드 국물 매체에서 하룻밤 문화 3 mL를 준비 합니다.
- 다음 날, 플라스 미드 준비 표준 키트와 함께 수행 하 고 t 7을 사용 하 여 전체 시퀀스 분석 (5ʹ-TAA 전술 GAC TCA CTA 태그 GG-3ʹ) BGHr (5ʹ 태그 아 그 GCA CAG TCG AGG-3ʹ) 뇌관 통해 표준 생어 시퀀싱 및.
- 분자 생물학 적당 한 도구를 사용 하 여 시퀀스를 분석 하. 원하는 돌연변이 검출 될 때 없고 더 이상 NM_000169.2 (α-galactosidase A)에 비해 시퀀스 또는 NM_000152.4 (산 성 α-glucosidase) 본, transfection 급 플라스 미드 정화에 대 한 복제를 선택 합니다.
- 분 광 광도 계에서 흡 광도 측정 하 여 DNA의 순도 결정 합니다.
참고: 허용의 260/280 흡 광도 비율 플라스 미드 순도 항복 준비만 > 셀 1.8 문화 실험.
2입니다. HEK293H 셀의 재배
- 높은 포도 당 (4.5 g/L) Dulbecco´s 수정이 글 매체 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보충에 HEK293H 세포를 유지 합니다. 셀 유지 한 5% CO2 분위기에서 37 ° C에서 인큐베이터 water-jacket.
- 80-90%의 밀도를 세포 배양.
- 매체를 발음 하 고 인산 염을 사용 하 여 버퍼링 없이 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +염 분 (PBS) 일단 씻어.
- 0.05%를 추가 하 여 통로 트립 신-EDTA와 37 ° C, 5% CO25 분 동안 품 어.
- 영구 문화를 유지 하기 위해 새로운 T75 플라스 크로 신선한 매체와 씨앗에 셀 1시 15분을 분할 한다. 25 이상 통행으로 셀을 사용 하지 마십시오.
3. pcDNA3.1/GLA와 pcDNA3.1/GAA 플라스 미드 Transfection 그리고 HEK293H의 치료
- transfection, 전에 24 시간 캘리포니아2 +, Mg2 +PBS 한번 T75 셀 문화 플라스 크에서 HEK293H 셀 세척. 위에 명시 된 트립 신-EDTA 0.05% 셀과 10% 보충 500 µ L DMEM 매체를 사용 하 여 24 잘 문화 판의 구멍에 씨앗 1.5 x 105 셀 수확 FBS 항생제 없이.
- 제조업체의 설명서에 따라 transfection 프로토콜 수행 합니다. 일반적으로 혈 청 무료 DMEM의 100 µ L에 플라스 미드 DNA의 1 µ g의 transfection 시 약 2.5 µ L의 혼합물을 사용 합니다. 실 온에서 20 분 동안 incubate 고 그 후 drop-wise 방식으로 셀에 추가 합니다.
- 37 °C/5% CO2 에서 4 h 기간 transfection 시 약을 포함 하는 매체를 제거 하 고 추가 10% 신선한 DMEM의 500 µ L FBS / 1% 페니실린/스.
참고:이 단계 1-Deoxygalactonojirimycin 염 산 염 (DGJ) 또는 1-Deoxynojirimycin 염 산 염 (DNJ) 추가할 수 있습니다 문화 매체에 의도 하는 곳 (20 µ M의 최종 농도 얻기 위해 10 mM의 수성 재고 솔루션을 사용 DGJ 및 DNJ ). 신선한 DGJ 또는 DNJ 플라스 미드 transfection 후 42 시간을 추가 되었습니다.
4. 세포 수확 및 α-galactosidase A 또는 산 성 α-glucosidase 활동 측정
- 셀 수확
- 수확의 날, 인큐베이터에서 셀을 제거 하 고 매체를 발음 합니다. 조심 스럽게 셀 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +PBS로 2 회 세척.
참고:이 단계는 DGJ 및 DNJ는 α-galactosidase와 α-glucosidase의 강력한 억제제 각각, 어떤 남은 시험을 무효화 시키는 때문에 중요 한. - 셀 위에 직접 이온된 수의 200 µ L를 추가 합니다. 접시에서 셀 린스를 1.5 mL 반응 관에 그들을 전송 합니다.
- 수확의 날, 인큐베이터에서 셀을 제거 하 고 매체를 발음 합니다. 조심 스럽게 셀 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +PBS로 2 회 세척.
- 중지 및 재개 하 여 균질 화
- 적절 한 거품 랙 5 소용돌이에 샘플을 넣어 s는 세포 보다 효율적으로 만들기를. 액체 질소 10에 번갈아 샘플 넣어 s 및 실내 온도 물 목욕까지 완료 (5 분)는 녹고.
- 5 번이이 절차를 반복 하 고 스핀에 10000 x g 5 분에 대 한 샘플.
- 이온된 H2O의 40 µ L을 포함 하는 각 샘플에 대 한 신선한 튜브를 준비 하 고 샘플의 10 µ L를 추가 합니다. 짧게 vortexing에 의해 솔루션을 믹스와 10 µ L 96 잘 접시 (3 중에서 각 샘플)의 캐비티에 전송. 이온 H2O 다음과 같이 표준 곡선을 얻기 위해 2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 재고 솔루션을 희석: 50 µ H L2O/50 µ L BSA; 60 µ L H2O/40 µ L BSA; 70 µ L H2O/30 µ L BSA; 80 µ L H2O/20 µ L BSA; 90 µ L H2O/10 µ L BSA; 100 µ L H2o.
- BCA 시 약의 200 µ L을 추가 하 여 반응을 시작 (시 약 A와 B 시 50: 1 비율로 혼합) 및 궤도 통 (300 rpm)에 약간의 동요에서 37 ° C에서 어둠 속에서 1 시간에 품 어. 560에서 흡 광도 측정 플레이트 리더에 nm.
참고: 샘플은 일반적으로 1 µ L 당 1.5 µ g 단백질 사이의 포함 되어 있습니다.
- 0.05 (대 한 α-galactosidase A) 또는 (산 성 α-glucosidase)에서 0.5 µ g 단백질 / µ L 솔루션을 얻기 위해 신선한 1.5 mL 반응 관에 각 샘플의 피펫으로 계산 된 금액을 희석. 와 동 5 다시 s를 피펫으로 10 µ L를 96으로이 희석의 샘플 잘 플레이트 (중복에서 각 샘플).
- 반응이 각각 기판 솔루션의 20 µ L을 추가 하 여 시작:
Α-galactosidase a: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-뮤-gal) 0.06 M 인산 염 구 연산 염 버퍼, pH 4.7에서에서에 대 한.
산 성 α-glucosidase에 대 한: 2 mM 4 methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-뮤-glu) 0.025 M 아세트산 나트륨, pH 4.0에서에서. - 궤도 통 (300 rpm)에 약간의 동요에서 37 ° C에서 어둠 속에서 1 시간에 대 한 효소 반응을 품 어. 1.0 M, pH 10.5 조정된 글리신-NaOH 버퍼의 200 µ L의 추가 의해 반응 종료.
- 다음과 같이 표준 곡선 4-methylumbelliferone (4-MU) 0.01 mg/mL 주식에서의 준비:
100 µ L H2O / 아니 4-무; 80 µ L H2O / 20 µ L 4-무; 60 µ L H2O / 40 µ L 4-무; 40 µ L H2O / 60 µ L 4-무; 20 µ L H2O / 80 µ L 4-무; 아니 H2O / 100 µ L 4-뮤, 피펫으로 10 µ L 96 잘으로 각 희석의 (중복)에 접시와 볼륨 및 pH를 조정 하기 위하여 각 잘 하 1.0 M 글리신-NaOH 버퍼의 200 µ L를 추가. - 측정 형광 판독기에 효소 활동 적절 한 필터 집합 있고 형광 판독기 장치에 대 한 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.
참고: 두 4-얼굴 기판 α-galactosidase A 또는 산 성 α-glucosidase 동안 4-무로 감소 된다. 출시 4-무 측정 될 수 있는 360와 465 nm에서 여기 및 방출 파장으로 각각 microplate 형광 판독기를 사용 하는 형광 색소 이다.
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결과
Mutagenesis 절차
GLA 유전자 mutagenesis의 효율성을 평가 하는 돌연변이 다음 범주 중 하나로 분류 되었다. 이 방법은 돌연변이 생성 하는 GLA 돌연변이의 66.5%에 대 한 첫 번째 시도에서 가져온 밝혔다. 약간 수정 된 두 번째 PCR 후 추가 25%를 얻을 수 있습니다.
카테고리 1:는 mutagenesis PCR 첫 번째 시도에서 효과적 이었습니다.
카테고리 2: 첫 번째 mutagenesis PCR 실패 (접시, 아니 삽입된 돌연변이에 식민지); 어 닐 링 온도 증가 시켜 같은 뇌관을 사용 하 여 반복 설정 68 ° C 효과적 이었습니다.
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토론
여기에 설명 된 프로토콜 대사의 유전 lysosomal 질병의 효소 손상 평가 대 한 강력한 결과 제공 합니다. 이 원고는 프로토콜 개정 출판 이전15입니다. 가장 중요 한 수정 포함 엄중 (즉, 돌연변이 벡터 구축 준비 과정), 세포 문화 프로토콜 (즉, HEK293H 셀 유지 보수 및 transfection 조건), 그리고 높은의 표준화 결과의 재현성에 매우 공헌한 실험 반복 (적어도 5)의 수입니다. 전부, 두 대상 유전자 mutagenesis에 쉽게 접근할 수 있으며 돌연변이의 다양성을 동시에 조립 될 수 있다. 상대적으로 높은 신호/잡음 비율 HEK293H 세포 내의 생 효소 활동은 무시할 수 1/50 (α-galactosidase A)과 지나치게 표현된 야생 유형 유전자의 1/20 (산 성 α-glucosidase) 고려 달성 했다. 따라서, 야생 유형 및 돌연변이 효소 사이 우수한 해상도가입니다. 총 단백질의 다른 금액 두 효소의 활동 분석 ...
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
저자 맨디 Loebert 우수한 기술 지원을 티 나 Czajka를 인정 하 고 싶습니다. 우리는 편집 도움말 언어에 대 한 식물 루 오 (하버드의과 대학, 보스톤, 메사추세츠, 미국) 감사 합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| QuikChange II XL 부위 지시 돌연변이 유발 키트 | Stratagene, La Jolla, CA, USA# | 200522 | |
| 프라이머 GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Primer | |
| GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Primer | |
| GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Primer | |
| GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Primer | |
| GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Primer | |
| GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Primer | |
| T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Primer | |
| BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a.Tryptone | |
| Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | ||
| 효모 추출물 | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| 염화나트륨 | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, 다름슈타트, 독일 | 1,058,330,250 | |
| D (+)-포도당 일수화물 | Merck, 다름슈타트, 독일 | 1,083,422,500 | |
| 수산화나트륨 | Merck, 다름슈타트, 독일 | 1,064,980,500 | |
| 글리신 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| 구연산 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| 인산수소이나트륨 | Merck, 다름슈타트, 독일 | 1,065,860,500 | |
| 아세트산나트륨 | Merck, 다름슈타트, | 독일 1,062,640,050 | |
| 빙초산 | Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일 | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´ s 수정된 독수리 미디엄 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone 태아 소 혈청 | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nü mbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal 반응관, 1,5mL | 사르스테트, Nü mbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일 | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | 토론토 연구 화학, 토론토, 캐나다 | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일 | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일 | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일 | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, 뮌헨, 독일 | M9766 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a.Luminous | |
| Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl 유전자 분석기 | Applied Biosystems, 다름슈타트, 독일 | n.a.GFL-3032 | |
| 박테리아 셰이커 | GFL, 부르크베델, 독일 | n.a.Avanti | |
| J-25 원심분리기 | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a.Ultraspec | |
| 3100 pro 분광광도계 | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a.water-jacket | |
| incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a.Vortex | |
| Genie 1 터치 믹서 | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a.Z | |
| 233 MK-2 냉장 마이크로튜브 원심분리기 | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a.LaboStar | |
| 초순수 장치 | Siemens, Berlin, Germany | n.a.Thermo | |
| Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a.Tecan | |
| GENios Reader | Tecan, Mä nnedorf, 스위스 | n.a.HI | |
| 223 마이크로프로세서 pH 측정기 | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a.CASY | |
Cell Counter + Analyser System Model TT | Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| Software | |||
| Magellan 데이터 분석 소프트웨어 v6.6 | Tecan, Mä nnedorf, 스위스 | n.a.GraphPad | |
| Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; 미국 | n.a.Microsoft | |
| Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a.BioEdit | |
| Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
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