동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

요약

렌즈 무료 비디오 현미경 셀 문화 인큐베이터 안에 직접 모니터링할 수 있습니다. 여기 우리가 획득 하 고 배양된 HeLa 세포의 2.7 하루 종일 수집 분석 하는 데 사용 하는 전체 프로토콜 설명, 개별 셀 형태학 및 10584 세포 주기⁶ 측정 추적 2.2 x 10의 데이터 집합에 지도.

초록

여기, 우리가 보여 그 렌즈 무료 비디오 현미경을 동시에 인큐베이터 안에 직접 세포의 수천의 활동을 캡처 수 있습니다 하 고 모니터링 하 고 여러 세포 주기에 따라 단일 셀 계량 가능 하다. 우리는 모니터 2.7 일 HeLa 세포 배양을 계량 하는 데 사용 하는 전체 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, 셀 문화 수집 렌즈 무료 비디오 현미경으로 수행 되 고 다음은 데이터를 4 단계 절차에 따라 분석: 다중 파장 홀로그램 재건, 셀 추적 셀 세분화 및 세포 분열 검출 알고리즘입니다. 결과적으로, 우리는 수집 하는 데이터 집합을 갖춘 10000 세포 주기 트랙과 2 x 10 이상⁶ 셀 형태학 측정 보다는 더 가능 하다는 것을 보여줍니다.

서론

여러 가지 세포 주기 전체에 걸쳐 경작된 한 포유류 세포를 모니터링 하 고 정확 하 게 측정 셀 크기와 셀 건조 질량은 어려운 작업. 여러 레이블 없는 광학 기술이 작업^1,2를 수행할 수 있습니다: 위상 이동 간섭계³, 디지털 홀로그램 현미경 (DHM)^{4,,56, 7}, quadriwave 측면 전단 간섭계^8,9 그리고 양적 단계 단층 촬영^10,11. 이러한 방법은 포유류 세포의 세포 주기의 이해에 많은 새로운 통찰력을 끌고있다. 그러나 그들은 거의 알고리즘을 추적 하는 자동 셀과 결합 된 측정 될 때 그들의 처리량 제한 유지 세포 대량 궤도¹ (N < 각각^3,,45 에서 20 ^{, 6}). 따라서 소설 광 방법 큰 통계와 셀 대용량 궤적을 측정 필요 (N > 1000).

이 문서에 동시에 인큐베이터, 내부 직접 세포의 이미지 다음 개별 세포 주기 트랙의 수천에 따라 단일 셀 통계를 계량을 렌즈 무료 비디오 현미경의 기능을 설명 합니다. 현미경 렌즈 무료 양적 위상 이미징 기술을 매우 큰 시야에 밀도가 포장된 셀의 위상 이미지의 인수를 허용 하는 (일반적으로 여러 가지 수만 m m², 여기 29.4 m m²)^{12,13 ,,1415}. 단일 셀 수준에서 몇 가지 통계 결정 됩니다, 예를 들어, 셀 지역, 건조 질량, 셀 간격, 셀 주요 축 길이 셀 및 가로 세로 비율^12,15, 각 이미지에서 셀. 그런 다음 셀 추적 알고리즘을 적용 하 여 이러한 기능 그릴 수 있습니다 모든 단일 셀에 대 한 실험 시간^14,15의 기능으로. 또한, 셀 트랙에 세포 분열의 발생을 감지 하 여 그것은 초기 세포 (세포 분열) 후, (세포 분열) 직전 최종 셀 건조 질량 질량과 셀 건조와 같은 다른 중요 한 정보를 추출할 수 기간, 즉, 2 개의 연속적인 사단¹⁵시간 주기. 모든이 측정은 매우 좋은 통계 계산 될 수 있다 (N > 1000) 이후 큰 시야 일반적으로 200 ~ 10000 셀 단일 렌즈 무료 획득의 분석 허용.

렌즈 무료 비디오 현미경 검사 법에 따라이 방법론을 설명 하기 위하여 감시 하 고 2.7 일 HeLa 세포 배양을 계량 프로토콜을 설명 합니다. 데이터 분석은 다중 파장 홀로그램 재건, 셀 추적, 셀 분할 및 세포 분열 알고리즘에 따라 4 단계 프로세스입니다. 여기 공간 해상도이 렌즈 무료 비디오 현미경 설치 얻은 비교적 빠른 프레임 속도 (한 인수 10 분 마다) 표준 셀 추적 알고리즘와 호환 되는지 표시 됩니다. 이 데이터 집합의 전체 분석 완전 한 세포 주기에 10,584 셀 트랙의 측정에서 발생합니다.

요약, 렌즈 무료 비디오 현미경은 자동으로 레이블이, 동기화, 수천 및 실험; 당 수정 되지 않은 셀을 모니터링 하는 강력한 도구 여러 가지 세포 주기를 통해 추적 되 고 각 셀입니다. 우리의 측정은 따라서 세포의 큰 인구에 간 세포 가변성을 더 중요 하 게, 하지만 몇 가지 셀 매개 변수 평균 값을 제공합니다.

프로토콜

1. 세포 배양 수집을 모니터링

1. DMEM + 글루타민 (예, GlutaMAX) 헬러 세포 성장 매체 10% (v/v) 열 비활성화 태아 송아지 혈 청, 1% 페니실린과 스 보완.
2. 6 잘 유리 하단 문화 접시 fibronectin (25 µ g/mL) 1 h 코트. 다음에 잘 당 2 × 10⁴ 셀 씨.
3. 인수, 동안 매체를 3 일 마다 변경 합니다.
4. 시간 경과 수집에 대 한 비디오 렌즈 무료 현미경 (상용)을 사용 합니다.
   참고: 이것은 근거한 전산 렌즈 무료 이미징 기술에 Ozcan 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 ¹⁶ 는 37 ° C^12,15의 제어 온도에 인큐베이터에서 지속적인 모니터링을 수행 하도록 수정 되었습니다. 그것은 1.67 μ m의 픽셀 피치와 6.4 x 4.6 m m²의 이미징 영역 보완 금속 산화물 반도체 (CMOS) 이미지 센서를 갖추고 있습니다. 여러 파장 조명 장치에 의해 멀티 칩 빛 발광 다이오드 (Led), 빨강, 녹색 및 파랑 조명 제공 제공 됩니다. 파장은 중심, 636, 521, 452 nm 각각 25, 45, 25의 스펙트럼 대역폭으로 nm 각각. 빨강-녹색-파랑 (RGB) Led 세포에서 약 5 cm의 거리에서 150 µ m pinhole 위에 있습니다. 빛 전원 LED 주변 측정은 각 파장에 10 µW 낮은 이며 조명 시간 인수 당만 1 초. 따라서, 셀 문화는 렌즈 무료 비디오 현미경 관찰 사진 독성 문제가 예상 된다.
5. 셀 문화 컨테이너 CMOS 센서 (그림 1)과 접촉을 넣어. 컨테이너를 사용 하 여 렌즈 무료 취득의 품질에 대 한 중요 한 맨 유리 coverslip로. 플라스틱 용기를 사용할 수 있습니다 하지만 렌즈 무료 취득 이러한 컨테이너의 광학 품질 때문에 타락 될 것 이다.
6. 제어 비디오 렌즈 무료 현미경 수집 (상용) 소프트웨어와 함께 시간 경과 수집 및 홀로그램 재구성을 수행 합니다. 소프트웨어 인터페이스에서 사용자가 입력 해야 하는 매개 변수는 프레임 속도 실험, 세포 배양, 즉 부착 셀 또는 부동 셀의 종류의 기간.
7. 수집 소프트웨어의 입력된 매개 변수를 설정 합니다. 1 수집 10 분 간격으로 설정 하 고 '부착' 셀 문화 유형을 설정 프레임 속도 설정 합니다.
   참고: 한 인수 10 분 마다의 프레임 속도 좋은 타협으로 안정적인 셀 추적 분석 결과 데이터 집합의 크기는 여전히 합리적인 보장. 빠른 프레임 속도이 현미경 렌즈 무료 설치와 함께 달성 한 인수 5 분 마다입니다. 과도 한 난방 문화에 있는 세포의 생존 능력에 영향을 미칠 수 있는 CMOS 센서의 결과 프레임 속도 더 증가.
8. 시간 경과 수집을 시작 하 고 홀로그램 재구성 알고리즘 (상용) 세포 배양의 위상 이미지를 렌즈 무료 수집을 자동으로 처리 됩니다. 홀로그램 재구성 알고리즘 기반으로 다중 파장 위상 검색 알고리즘¹⁷ 하며 RGB 재건된 단계 이미지의 범위에 [-π, π +] 29.4 m m²의 넓은 시야를 통해 각 단일 셀에 대 한. 밝히는 얇은 샘플 렌즈 무료 인라인 홀로 그래피의 원리는 (z = 0) (진폭 1 정규화 후)의 평면 파로 짧은 거리 z에 후속 회절 강도 이미지 CMOS 센서에 감지 하 고 = Z, 후 일반적으로 1 m m는 샘플입니다. 우리의 설정에서 조명 순차적으로 전환 3 파장 (λ₁= 0.450 µ m 이다, λ₂0.540 µ m 이다, λ₃= = 0.647 µ m) 동일한 샘플의 3 개의 회절 패턴 측정 하.

2. 세포 문화 데이터 분석

1. 셀 추적용 Trackmate 알고리즘, 단일 입자¹⁸의 자동화 된 추적에 대 한 오픈 소스 피지 플러그인을 사용 합니다. 에 먼저, 피지 (부하 이미지 시퀀스 명령)에 전체 시간 경과 수집 로드. 일반적으로 400 RGB 프레임 29.7 Mb의 기능, 데이터 집합의 큰 크기 때문에 빠릅니다 8 비트 포맷에 그들을 로드. 다음 Trackmate 피지 플러그인 즉 셀 감지 단계, 셀 추적 단계 및 셀 탐지 및 계산된 트랙에 적용 되는 여러 필터 셀 추적 알고리즘의 여러 단계를 통해 사용자를 안내 합니다. 모든 단계에서 알고리즘을 구성 하 고 결과 표시 즉시를, 필요한 경우, 하나 쉽게 이동할 수 있습니다와 설정을 재조정. Trackmate 인터페이스의 다양 한 메뉴는 HeLa 세포 실험에 사용 된 실제 설정 함께 그림 2 에 표시 됩니다.
2. ( 그림 2참조) 다음과 같은 수집 소프트웨어의 입력된 매개 변수를 설정 합니다. 15 픽셀, 15 픽셀 간격 닫기 최대 거리 및 3.5 트랙에 관광 명소의 수를 예상된 blob 직경 15 픽셀, 0.25 검출기 임계값, 연결 최대 거리를 설정 합니다.
   참고: 이러한 설정은 분명 다릅니다 한 실험에서 특히 '예상된 blob 직경' (1.67 μ m의 픽셀에 주어진 여기) 셀 크기에 해당 하는 다른. 같은 발언 '연결 최대 거리' 최대 거리에 대 한 계정 (1.67 μ m의 픽셀에 주어진 여기)의 연속 프레임 두 개 내 셀 여행에 적용 됩니다. 최적의 값 셀 운동에 뿐만 아니라 세포 밀도에 따라 것입니다.
3. 셀 추적 과정의 끝에, 세 개의 텍스트 파일의 형태로 결과 생성 ('분석' 버튼을, 그림 2참조). 인수, 그들의 프레임 번호 및 트랙 번호에 그들의 각각 (x, y) 위치와 검색 된 모든 셀을 나열 하는 테이블 '트랙 통계의 관광 명소' 라는 가장 유용한 파일에 의하여 이루어져 있다. 이 데이터를 기준으로 셀 세분화를 수행 하 고 전용된 알고리즘 (보충 코드 파일 참조)를 사용 하 여 세포 분열을 감지. 두 개의 다른 파일 이름이 '트랙 통계에서 링크'와 '통계를 추적 하 는'와 트랙, 트랙 기간 예를 들면 , 감지 된 간격의 수를 취급 하는 모든 결과 포함, 초기 프레임, 등을 추적.
4. 셀 분할 알고리즘을 사용 하 여 재건된 단계 이미지에서 셀 형태를 설명 하는 몇 가지 통계를 자동으로 추출 (참조 보충 코드 파일). 이러한 메트릭은 셀 표면적 (S), 세포 주 축 길이 (L), 셀 부 축 길이 (l)와 셀 가로 세로 비율 (L/l)입니다. 위상 현미경 렌즈 무료에서 발견 한 듯이¹⁵표본 층의 두께 밀도에 비례 이다.
5. 세포의 형태학 적 기능 외에 재건된 단계^13,,1920 에서 양적 셀 건조 질량 (CDM) 측정을 추출
   식 (1)
   φ(x,y)는 재건된 단계 교대¹⁹, λ는 파장 및 α = 1.8 x 10^-4 m³/k g 건조 질량^{1, 굴절률의 변화에 관련 된 특정 굴절률 19}.
6. 문화 매체의 굴절률 셀 사이의 차이의 추정을 사용 하 여 셀 간격을 평가 합니다. 셀 두께 h(x,y)와 측정 된 위상 변화 사이의 관계는²⁰에 의해 주어진 다:
   식 (2.1)
   식 (2.2)
   Δn(x,y) = n_셀 (x,y)- n_매체 (x,y), 셀 및 문화 매체의 굴절률 차이. 다음, 가정 Δ의 상수 값n 0.025 =, HeLa 세포 핵에서 측정 하는 굴절률에서 추정 되는 (n = 1.355¹¹) 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 문화 미디어의 (n = 1.33). 셀 간격 값은 가정에 기반으로 나타내는, 상대 유사 의미 하 고 나누어 셀을 검출 악용 될 수 있습니다.
7. 전용된 알고리즘을 사용 하 여 측정 두께 8 µ m 보다 큰 세포가 세포 분열의 발생을 감지 하 여 다음 세포 분열을 탐지 하기 위해 검색 된 셀 사단에 관련 된 셀 트랙을 추출 (참조 보충 코드 파일) 먼저 식별 됩니다, 그리고 확인 여부는 새 셀에 밀접 하 게 나타납니다 공간 시간. 이 방법에서는, 세포 분열의 감지 두 강력한 조건에 의존합니다. 세포 분열 탐지를 위한 더 정교한 방법과 대안 lensfree 시간 경과 인수^21,,2223에 적용할 수 있습니다.

결과

홀로그램 재건 과정에 대 한 가벼운 분야는 스칼라 필드 설명 (어디 샘플, 그리고 측면 위치에서 거리 z 에서 비행기에 A 의 복잡 한 값은 및 파장 λ에서). 빛의 전파 전파 커널 제공 하는 호이 겐 스-프레넬 이론에 의해 모델링 됩니다 . 따라서, 필드 진폭 검출기 비행기에서 _z 다음 관계식에 의해 빛의 진폭 ₀ 에 관련 되어:

토론

이 문서에서 우리는 그 렌즈 무료 비디오 현미경 세포의 수천의 활동을 캡처 인큐베이터 안에 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 전반적인 방법론을 설명 하기 위해 우리는 어떻게 문화에 HeLa 세포의 2.7 일 경과 수집 표준 셀 추적 알고리즘으로 분석 될 수 있다 설명 했다. 2.2 x 10⁶ 셀 측정 및 10,584 세포 주기 트랙을 갖춘 데이터 집합입니다. 인수는 비교적 큰 셀 셀 거리 Hela 세포의 문화에 수행 (셀 밀도 < 500 세포/mm²) 세포 형태학 디스크 접근 될 수 있다. 이 두 기능은 같은 큰 데이터 집합을 수집 가능 하 게 하는 자동 셀 추적 분석의 응용 프로그램을 촉진 한다. 다른 셀 라인 작은 셀 셀 거리 또는 더 복잡 한 형태학 추적 하기 더 어려울 것 이다 고 후속 데이터 집합 더 작을 것 이다.

우리는이 이렇게 많은 연구, 예를 들어 세포 증식과 세포 크기 연구에 대 한 흥미로운 믿습니다. 후자는 기본적인 생물학...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Cytonote 렌즈 없는 비디오 현미경	Iprasense
Horus 획득 소프트웨어	Iprasense
6-well 유리 바닥 문화 플레이트	MatTek corporation	부품 번호: P06G-0-14-F
DMEM + GlutaMAX 매체	Gibco
열 비활성화 태아 송아지 혈청	유로바이오
페니실린과 스트렙토마이신	Gibco
피브로넥틴	Sigma Aldrich
Matlab, 이미지 처리 도구 상자	매스웍스