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방법 논문

Foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발

13.8K 조회수

DOI:

10.3791/56585

2018년 6월 3일

이 논문에서

요약

브리 parahaemolyticus 감지 polylactic 산 안정, 금 나노 입자 수정, 모티브로 탄소 전극으로 구성 된 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

초록

(대 parahaemolyticus) 브리 parahaemolyticus 크게 인간의 사망률과 질병 률의 속도 영향을 미치는 보건 문제의 큰 비율에 세계적으로, 기여 일반적인 foodborne 병원 체 이다. 문화 기반 방법, 면역학 분석 실험, 분자 기반 방법 등 parahaemolyticus 대 의 검출을 위한 일반적인 방법 복잡 한 샘플 처리를 요구 하 고, 지루한, 시간과 비용이 많이 드는 있습니다. 최근, 바이오 센서는 빠른 검색, 비용 효율성, 실용성의 장점으로 유망 하 고 포괄적인 탐지 방법으로 입증 했습니다. 이 연구는 높은 선택도 및 DNA 교 잡의 원리를 사용 하 여 감도 parahaemolyticus 대 감지 하는 빠른 방법 개발에 중점을 둡니다. 작업, 합성된 polylactic 산 안정 금 나노 입자 (PLA-AuNPs)의 x 선 회절 (XRD), 자외선 보이는 분광학 (UV-Vi), 전송 전자 현미경 (TEM), 필드-방출을 사용 하 여 달성 되었다 스캐닝 전자 현미경 검사 법 (FESEM), 그리고 주기적 Voltammetry (CV). 우리는 또한 추가 안정성, 감도, 및 PLA AuNPs의 재현성의 테스트 실시. 우리는 PLA AuNPs 수성 해결책에서 안정 된 나노 입자의 소리 구조 형성을 발견. 우리는 또한 감도 작은 충전 전송 저항 (Rct) 값과 활성 표면적 (0.41 c m2)의 증가 결과로 향상 된 관찰. 우리의 DNA 바이오 센서의 개발은 PLA AuNPs와 redox 표시기로 메 틸 렌 블루 (MB)를 사용 하 여 모티브로 탄소 전극 (SPCE)의 수정에 근거 했다. 우리는 차동 펄스 voltammetry (DPV)에 의해 동원 정지 및 교 잡 이벤트를 평가. 보완, 보완, 우리 그를 발견 하 고 일치 하지 않는 oligonucleotides 특별히 조작된 바이오 센서에 의해 수훈이 있었다. 그것은 또한 다양 한 식품을 매개로 병원 체에 대 한 분 연구 하 고 신선한 cockles parahaemolyticus 대 의 식별에 안정적으로 민감한 탐지를 보여주었다.

서론

최근 몇 년 동안에서 공공 및 과학적인 논쟁의 주요 주제, 식중독은 주로 3 에이전트와 관련 된: 미생물1, 화학2및 기생충3. 오염 된 음식 인간, 약한 면역 체계, 노인, 임신 여성, 아기, 그리고 어린 아이4에 그들의 더 높은 위험 그룹에서 특히 심각한 건강 결과 일으킬 수 있습니다. 아프리카, 아시아 및 라틴 아메리카에서 5 세 미만의 어린이에서 매년 발생 하는 급성 설사의 경우에 이상 백만, 식중독 주요 글로벌 질병5,6 와 세계 보건 기구 설립 7가장 중요 한 기여자 서의 미생물 비 브리 오 parahaemolyticus 가장 널리 인정 된 악성 종자 들 눈에 띈다. 그램 음성 박테리아는 높은 소금 환경에서 활성화 되 고 부적당 하 게 요리, 분실 또는 원시 해양에 먹을 때 심각한 인간의 위장염은 일반적으로 해안, 강어귀, 및 해양 환경8에서 발견, 제품9. 또한, ....

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프로토콜

참고: 모든는 화학과 생 화 확 적인 시 약 사용 될 분석 등급의 고 추가 정화 없이 사용. 살 균 이온된 수를 사용 하 여 모든 솔루션을 준비 합니다. 오토 클레이 브 살 균 전에 모든 유리.

주의: 사용 하십시오 모든 적절 한 안전 관행 공학적 통제 (연기 후드, 글러브)의 사용을 포함 하 여 실험실 활동을 수행할 때 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 외 투, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발)입니다.

1. 제조 및 특성의 수정 전극 PLA AuNPs를 사용 하 여

  1. 준비 및 PLA AuNPs의 특성화
    1. 빨리 끓는 수성 chloroauric 산 성 솔루션 (1 mM) 100 mL를 나트륨 구 연산 염 해결책 (38.8 m m)의 10 mL를 추가 하 고 주위 온도 아래로 냉각. 준비 된 AuNPs 솔루션는 노란색, 거 무스 름 한 변경으로 시작 되 고 마지막으로 어두운 루비 빨간색으로 끝나는 색상의 변화를 관찰 합니다.
    2. PLA 펠 릿 용 해 공정에 대 한 스테인레스 스틸 몰드에 놓고 10 분 따라 눌러 절차와 190 ° C의 온도에 그들을 예 열: PLA 시트 준비의 일환으로 1 분에 대 한....

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결과

AuNPs의 형성 나트륨 시트르산 존재와 용액의 색깔에서 변화를 통해 밝혀졌다. 이 깊은 루비 레드 빛 노란색에서 변경 하려면 색상을 발생 합니다. PLA AuNPs의 세대 표면 플라스몬 공명 (SPR) 피크의 성장 약 540에서 발견 됐다 대 한 UV 스펙트럼 (그림 1)에서 확인 되었다 nm. 형성 및 PLA AuNPs의 존재는 입자 크기37에 따라 500-600 nm 파장 범위에 표시 했다. AuNPs 및 PLA AuNPs의 XRD 패턴은 그림 2에 표시 됩니다. 모든 crystallite 봉우리 31.7, 38.2, 44.4, 64.7, 77.7 °의 2θ에서 관찰 되었다. 그들은 (100) (111) (200) (220)에 기인 했다 입방 FCC (얼굴 중심 입방) 금 (311) 결정학 비행기 (금속) nanost.......

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토론

전기 화학 바이오 센서의이 종류의 성공적인 개발을 위한 프레임 워크의 중요 한 단계는 핵 산 (DNA 여기); 변환기에 대 한 적절 한 생물학적 인식 요소 선택 트랜스듀서;의 감지 레이어를 생성 하기 위한 화학 접근 변환 자료; 최적화 DNA 동원 정지 및 교 잡; 그리고 실제 예제를 사용 하 여 개발 된 바이오 센서의 유효성 검사.

민감하고 선택적 전기 화학 DNA 바이오 센서의 성공적인 개발을 코어, immobilization와 교 잡 조건의 최적화입니다. 이 작품에서는, 우리는 복잡 한 산화로 MB를 사용. MB-DNA 상호 작용의 다양 한 원리는: (i) ssDNA와 dsDNA;의 인산 염 등뼈 음이온 혐의로 MB 양이온 책임의 정전기 상호 작용에 의해 (ii)에 의해 번갈아 dsDNA;에 G-C 기본 쌍 사이의 MB의 성공적인 삽입을 통해 MB 윤 (iii)에 의해 대상 ssDNA의 끝에 공유 결합, 생성 낮은 레이블 밀도 (하나 또는 두 개의 메가바이트 분자 DNA 가.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 Universiti 푸 트 라 말레이시아의 지원을 하 고 싶습니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세트산Merck100056
ChloroformMerck102445
Diaminoethane tetraacetic acidPromegaE5134
이염기성 인산나트륨 Sigma-AldrichS9763
디소듐 수소 인산Sigma-Aldrich255793
에탄올 Sigma-Aldrich16368
Gold(III) chloride trihydrateSigma-Aldrich520918
Hydrochloric acidMerck100317
Methylene blueSigma-AldrichM44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrateSigma-AldrichS3522
Phosphate-buffered SalineSigma-AldrichP5119
폴리(젖산) 수지, 상업용 4042DNatureWorks4042D
염화칼R& M Chemicals59435
인산이수소시그마-알드리치P9791
헥사시아노페레이트 칼륨 IIIR& M 화학 물질208019
아세트산 나트륨 무수 염시그마 -알드리치S2889
염화나트륨 시그마 알드리치S9888
구연산 트리소듐시그마-알드리치S1804
트리스 (하이드 록시 메틸) 아미노 메탄피셔 사이언티픽T395-100
트리스 베이스피셔 사이언티픽BP152-500
이중 염료가 포함된 2X PCR 마스터 믹스Norgen Biotek28240
아가로스 젤Merck101236
Bolton AgarMerck100079
Bolton BrothMerck100079
CHROMagar VibrioCHROMagarVB910
dNTPPromegaU1511
뉴클레아제가 없는 물Thermo ScientificR0581
Eosin 메틸렌 블루 한천 Merck101347
GelRedBiotium41001
글리세롤Merck104092
Go Taq 버퍼PromegaM7911
로딩 염료 100 bp DNA ladderPromegaG2101
로딩 염료 1kb DNA ladderPromegaG5711
염화 마그네슘Promega91176
만니톨 달걀 노른자 폴리믹신 한천머크105267
맥콩키 한천머크105465
영양 육수머크105443
타크 중합효소머크71003
트립티케이스 소이 육수머크105459
트립티케이스 소이 한천머크105458
염 륨 칼륨

참고문헌

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A.

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재인쇄 및 허가

태그

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