애기 씨의 높은 처리 살 균에 대 한 표준화 된 방법

요약

이 연구의 목적은 메 마른 매체에 성장 범위의 애기 genotypes의 종자 발 아에 표 백제와 염소 가스 살 균의 효과 확인 했다. 최적화 된 살 균 프로토콜 제공 만족 스러운 씨 생존 하면서 오염 물질을 미생물의 성장을 방지 하기 위해 개발 되었습니다.

초록

애기 thaliana (애기) 묘는 종종 메 마른 매체에 성장 될 필요가 있다. 이 사전 종자 소독 씨앗 표면에 오염 물질을 미생물의 성장을 방지 하기 위해 필요 합니다. 현재, 애기 씨는 실험실 사이 다를 약간 하 고 표준화 되지 조건에서 두 가지 살 균 기술을 사용 하 여, 자주 발생 하는 과도 한 씨 사망 또는 유일 하 게 부분적으로 효과적인 살 균에 살 균. 이러한 방법 중 대부분은도 쉽게 확장 가능한 다양 한 genotypes의 씨앗 라인의 다 수 없습니다. 애기의 높은 처리량 분석을 위한 기술 확산을 계속, 다 수 다른 genotypes의 씨앗의 살 균에 대 한 표준화 된 기술을 이러한 유형의 실험 수행을 위한 필수 되고있다. 두 개의 다른 살 균 기술 애기 줄 수의 응답 종자 발 아 율 및 씨앗 오염 미생물와 다른 병원 체의 수준에 따라 평가 했다. 치료 요원과 결합 애기 씨 살 균에 대 한 최적의 조건을 확인 하 여 노출의 시간을 살 균의 다른 농도 포함. 최적화 된 프로토콜 개발 되었으며, 두 가지 다른 살 균 방법: 표 백제 (액체 상)과 염소 (Cl₂) 가스 (기상), 둘 다의 결과로 높은 씨앗 발 아 속도 최소한의 미생물 오염. 이러한 프로토콜의 유틸리티 야생 유형 및 돌연변이 씨앗의 발 아 전위의 범위 테스트를 통해 설명 했다. 우리의 결과 씨앗 수 있습니다 효과적으로 살 균 될 과도 한 씨 사망 하지 않고 메서드 중 하나를 사용 하 여 살 균의 해로운 효과와 최적의 발 아 가능성 보다는 더 낮은 씨를 위해 관찰 했다 비록 표시 됩니다. 또한, 방정식 연구원은 다양 한 크기의 밀폐 용기에 표준화 된 염소 가스 살 균 조건을 적용할 수 있도록 개발 되었다. 여기에 설명 된 프로토콜 애기 라인의 많은 수를 위해 쉽게, 효율적이 고 저렴 한 종자 살 균을 수 있습니다.

서론

애기 thaliana (애기) 식물 생물학^1,,23기초 및 응용 연구에 대 한 주요 모델 생물 이다. 동안 애기 성장에 대 한 표준 조건 잘 설립된⁴, 씨앗 씨앗 생존에 살 균의 효과 엄격 하 게 테스트 되지. 단단한 미디어 판 또는 상자에 정기적으로 레이어에서 인구, 초기에 촬영 및 루트 고기의 관찰에서에서 homozygous 치명적인 돌연변이의 식별 등 많은 실험적인 응용 프로그램에 대 한 애기 묘의 성장을 촉진 하 사용 단계, 병원 체 자유로운 조직, 많은 양의 묘 종 조직, transformants 또는 약물 내성 식물의 선택과 발 아^{1,2,3,4의 평가의 컬렉션의 격리} . 온실에서 자란 식물에서 수확 한 씨앗 또는 성장 챔버는 때때로 미생물과 먼지 오염. 메 마른 매체의 종류에 애기 묘의 성장 이전 종자 살 균을 곰 팡이 씨앗 표면에 박테리아 등 미생물 오염 물질을 제거 하 요구 한다. 효과적인 종자 살 균 정권의 사용이 높은 발, 최소 오염, 그리고 활기찬 식물의 성장을의 균형에 대 한 중요 합니다.

애기 씨 살 균을 위해 사용 하는 두 가장 일반적인 방법 상업적인 표 백제 (액체 상)와 염소 가스 (기상)를 기반으로 합니다. 다양 한 절차 두 액체 단계 살 균^{1,4,5,6,7,,89} 고용 되었습니다. ^, 애기의 ¹⁰ 및 증기 위상 살 균 씨^{8,10,11,12,13,,1415 16}. 그러나,이 절차 사용된 genotypes의 종자 살 균 달성에 효과가 있다, 하는 동안 다른 genotypes의 씨앗에 다른 살 균 처리의 효과 대 한 상세한 분석 되지 보고 되었습니다. 따라서, 이러한 살 균 절차의 최적화 효율적인 살 균 높은 발 아 속도와 결합 하는 조건을 정의 해야 합니다.

애기 생물 자원 센터 (ABRC)는 고유) 테스트의 다양 한 다른 genotypes 씨 생존 컬렉션 및 b) 활용 품질 관리 절차를 내부적으로 적용 및 사용자 피드백에 대응에서 하는 위치 씨 발 아에 대 한. 여기에 제시 된 실험의 목표 범위의 애기 genotypes의 종자 발 아에는 다양 한 살 균 방법의 효과 확인 했다. 최소한의 병원 체 오염 유지 하면서 높은 종자 발 아 율에서을 최적화 된 살 균 절차는 표 백제와 염소 가스 살 균에 대 한 표시 됩니다.

프로토콜

1. Skoog (MS)와 村 重 매체 x 1의 준비

1. 추가 4.31 g 10 g 자당 기저 소금 혼합물 MS, 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic의 0.5 g의 산 (MES) 증류수와 해산 저 어 0.8 L를 포함 하는 비 커. 확인 하 고 1m 수산화 칼륨 (KOH)를 사용 하 여 5.7에 pH를 조정. 1 수 있도록 증류수를 추가 L.
2. 1 L 병, 500ml 각 미디어를 나눕니다. 각 병에의 한 천 5 g을 추가 합니다. 뚜껑을 느슨하게 유지.
3. 121 ° C, 병에 자기 볶음 바 15 psi에서 20 분 압력솥.
4. 압력가 마로 소독, 후 병 낮은 속도로 저 어 접시에 놓고 (때까지 병 맨 손으로 개최 될 수 있습니다) 45-50 ° C에 냉각 MS 매체 허용.
5. 층 류 두건에 있는 메 마른 조건에서 모든 단계를 수행 하는이 단계에서 시작 하십시오. 500 µ L를 추가 Gamborg ' s 각 병을 균일 하 게 배포 비타민 솔루션 MS 매체를 저 어 비타민 솔루션.
6. 약 접시의 깊이의 절반을 커버 하는 접시로 충분 한 미디어를 부 어.
7. 허용을 공고히 한 천 수 있도록 약 1 시간에 대 한 실 온에서 냉각 판.
   참고: 경우 판 하지 즉시 사용할 수, 플라스틱에 그들을 포장 하 고 4 ° C (냉장고 온도)에서 저장 합니다. 커버 플레이트, 상자, 또는 응고 한 튜브를 밀폐 용기에 4 ° C에서 몇 주 동안 저장 될 수 있다.

2. 살 균 표 백제와 애기 씨의

1. 섹션 1 프로토콜의 준비는 MS 판. MS 미디어로 동시에 증류수 100 mL 압력솥. 사용 하 여이 나중에 린스 물과 씨앗을 중단할 수 있도록 도금에 도움.
   참고: 원하는 경우 0.8 %agar 블렌드 (w/v) (예: phytagar) 또한 수 압력가 마로 소독이 단계에서. 한 천 혼합 도금 동안 증류수에 대 한 교체 될 수 있습니다 (단계 2.5.3.). 한 혼합의 추가 점도 쉽게 접시 또는 공장에 공간 씨 행에 필요한 경우.
2. 준비 50% (v/v) 씨앗을 살 균 하는 데 사용할 솔루션을 표 백제. 표 백제를 희석, 백제의 100 mL 증류수 100 mL를 추가 합니다. 50 µ L 트윈 20 세제의 표 백제 솔루션에 추가.
   참고: 준비 표 백제 솔루션에 대 한 저장 될 수 있다 그것은 단지 무 균 조건에서 열로 한 달에 최대.
3. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 aliquot 100 씨.
4. 50% 표 백제 솔루션을 사용 하 여 씨앗 소독.
   1. 층 류 두건에 추가 50% 표 백제 솔루션의 500 µ L 씨를 포함 하는 microcentrifuge 튜브. 표 백제 솔루션에서 씨앗을 중단 튜브의 아래쪽을 누릅니다.
      참고: 또는, 회전 또는 플랫폼 통 사용할 수 있습니다 중단 씨앗을 유지.
5. 튜브에서 표 백제 솔루션을 씻어 내어 주세요.
   1. 10 분 후에 피 펫 또는 끝에 피 펫 팁을 장착 한 흡 인기를 사용 하 여 microcentrifuge 튜브에서 표 백제 솔루션 제거.
   2. 추가 500 µ L의 무 균 튜브에 증류수. 튜브를 닫고 혼합을 반전 합니다. 씨앗은 튜브의 하단에 정착을 허용 합니다. 일단 씨앗 신중 하 게 튜브의 하단에 정착 pipetting으로 표 백제 솔루션을 제거 합니다. 반복이 6 번 과정을 rinsing.
   3. 씨앗 중단 튜브에 압력가 증류수 1 mL을 추가.
6. MS 접시에 소독된 씨앗 판.
   1. 층 흐름 후드에서 재고 이름과 현재 날짜와 MS 판의 하단 라벨.
   2. MS 플레이트에 microcentrifuge 튜브에서 씨앗을 부 어. 멸 균, 일회용 inoculating 루프 또는 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 MS 플레이트 주위 씨앗을 확산.
      참고: 지금까지 씨앗 행에 뿌려 져야 하는, 경우에 200 µ L 팁 피펫은 개별적으로 원하는 위치에 씨앗을 배치 하 사용할 수 있습니다. 씨앗의 흐름을 개선 하기 위해, 피 펫 팁의 끝 3-5 m가 위를 사용 하 여 트리밍 수 있습니다. 어떤 잘못된 씨앗이 나 씨앗의 클러스터 다음 위치를 변경할 수 또는 멸 균 일회용 inoculating 루프를 사용 하 여 분리.
   3. 배치 MS 격판덮개의 뒤에 층 류 두건 절반 닫힌 뚜껑의. MS 판에서 증발을 초과 하는 물을 허용.
   4. MS 접시에 뚜껑을 배치. 인감 외과 미소 한 구멍이 있는 종이 접시를 포장 하 여 MS 판 테이프 (재료의 표 참조).

3. 염소 가스와 애기 씨의 살 균

1. 섹션 1 프로토콜의 준비는 MS 판. 압력솥 MS 미디어; 동시에 증류수 100 mL 이 나중 도금에 도움 씨앗을 일시 중단 하려면 사용 됩니다.
   참고: 원하는 경우 0.8 %agar 블렌드 (w/v) (예: phytagar) 또한 수 압력가 마로 소독이 단계에서. 한 천 혼합 도금 동안 증류수에 대 한 교체 될 수 있습니다 (단계 3.6.2.). 한 혼합의 추가 점도 쉽게 접시 또는 공장에 공간 씨 행에 필요한 경우.
2. 시작 하기 전에 살 균, 염소 가스를 생산 하는 데 필요한 표 백제 및 염 산 (HCl)의 양을 계산.
   1. 6.1% Cl ₂ 살 균을 위한 필요를 생산 하기 위해 필요한 HCl의 양을 계산.
   2. 다음 수식을 사용 하 여:
      
      6.1% Cl ₂;로 살 균 컨테이너의 볼륨으로 7000 mL와 HCl의 볼륨은 계산 3 mL.
      참고: 컨테이너 및 % Cl ₂의 다른 볼륨에 대 한 계산을 수행 하는 프로그램 스프레드시트 추가 표 1로 제공 됩니다.
3. 0.5 mL microcentrifuge 튜브에 aliquot 100 씨앗. 각 유리병의 뚜껑을 닫고, 튜브에 플라스틱 랙 하 고 따로 설정.
   참고: 씨앗 만큼 그들은 적절 한 조건에 저장 된이 시점에서 시간의 오랜된 기간 동안 저장할 수 있습니다. 저장 조건 Rivero, 동료 ⁴ 섹션 3.3.2 프로토콜의에서 찾을 수 있습니다. 96 잘 접시 포맷을 사용할 수 있습니다.
4. 염소 가스 살 균을 수행 하는 데 필요한 자료를 준비.
   1. 표 백제와 HCl 저장소 위치에서 얻기.
   2. 대형 파라핀의 스트립 영화 (재료의 표 참조) 단계 3.5.3에서에서 사용 하는 컷. 살 균 컨테이너를 봉인 하.
   3. 있는 살 균 열린다 증기 두건 안쪽 뚜껑을 가진 플라스틱 컨테이너를 놓습니다. 모든 씨앗 튜브에 열고 플라스틱 컨테이너 안에 전체 씨앗 랙 배치.
5. 수행 상 온에서 염소 가스 살 균.
   주의: 표 백제와 산 별도로 작동 합니다. 유출의 위험을 줄이기 위해 세척제 중 병을 두지 마십시오. 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) 장갑과 실험실 외 투를 포함 하 여 사용 합니다. 표 백제 또는 산 장갑에 밝아진, 다른 자료를 취급 하기 전에 장갑을 변경 합니다. 항상 장갑의 경우에 표 백제 또는 산 오염 증기 두건에서 제거.
   1. 컨테이너 안에 250 mL 비 커를 배치 하 고 백제의 100ml 추가.
      참고: 표 백제와 HCl 사이의 반응 백제의 적어도 22 볼륨 초과를 필요합니다. 반응은 HCl을 사용 하 고 부산물으로 염화 나트륨 (NaCl)와 물 Cl ₂ 가스를 방출 하 여 표 백제. 블리치의 큰 과잉을 사용 하면 추가 HCl d의 소비uring 나트륨 중 탄산염 (NaHCO ₃) 양이 감소 배기 기간 처리를 위한 솔루션을 무력화 하는 데 필요한.
      주의: 비 커 표 백제 + HCl의 총 액체 볼륨을 두 번 이상 이어야 한다. 그러면 씨앗 손상, 옷, 표 백제 또는 노출 된 피부를 구울 수 있는 다음 단계는 비 커를 탈출 밝아진.
   2. 표 백제를 포함 하는 비이 커에 HCl 3 mL을 추가.
      주의: 초기 반응 가스 농도 보다 높은 6.1%에서 특히 거품을 생산할 예정 이다. 긴 팔 랩 코트는이 단계에 대 한 필요.
   3. 살 균 컨테이너를 닫고 즉시 파라핀 영화와 함께 인감.
   4. 가스 축적 되도록 살 균 시간 동안 살 균 컨테이너 모니터링, 염소 가스의 축적은 컨테이너 안의 희미 한 노란색 연 무로 표시 되어야 합니다.
      주의: 정기적으로 확인 하는 내부 압력 뚜껑 대통령직 하지는 보장 하기 위해 살 균 컨테이너 또는 파라핀 영화. 뚜껑 unseated 왔다 또는 파라핀 영화 느슨한 왔다, 뚜껑 닫고 파라핀 영화의 추가 층으로 컨테이너를 신중 하 게 포장.
   5. 1 후 h-살 균 기간, 파라핀 필름을 제거 하 고 한 모서리에 뚜껑을 열고 여 컨테이너를 엽니다. 3 h 반응 완료 하 고 염소 가스 제거를 위한 환기 컨테이너 허용.
   6. 닫고는 모든 microcentrifuge 튜브의 씨앗 랙에 모자.
      참고: 멸 균된 씨는 건조 상태에서 저장으로 도금의 시간까지 저장할 수 있습니다.
   7. 시드 랙 제거 하 고 층 류 두건에.
   8. 염소 가스 반응
      1. 추가 1.5 g NaHCO ₃ 분말 표 백제/HCl 솔루션을 포함 하는 비이 커에 천천히 중화 고 NaHCO ₃ 솔루션으로 분해 하는 유리 막대와 저 어. NaHCO ₃ 때까지 계속 추가 이산화탄소 (CO ₂) 가스 거품 형성 중지.
         주의: 천천히 밝아진을 방지 하기 위해 추가 합니다. 장갑 및 실험실 외 투를 포함 하 여 적절 한 보호구를 사용 하 여.
      2. 산도 스트립 또는 pH 미터를 사용 하 여 솔루션의 산도 테스트 합니다. 솔루션의 pH까지 필요한 중립 이면 추가 NaHCO ₃ 추가 (pH 7.0). 솔루션을 증기 두건에서 제거 하 고 모든 적용 가능한 처리 지침에 따라 폐기 수 있습니다이 시점에서.
         주의: 처리 하는 동안 어떤 냄새를 발견 하는 경우 다음 솔루션 즉시에 반환 되어야 증기 두건.
6. MS 접시에 소독된 씨앗 판.
   1. 층 흐름 후드에서 재고 이름과 현재 날짜와 MS 판의 하단 라벨.
   2. 추가 500 µ L 씨를 일시 중단 하려면 각 microcentrifuge 튜브에 멸 균된 증류수의. MS 판에 씨앗을 부 어 하 고 멸 균, 일회용 inoculating 루프 또는 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 접시 주위에 균등 하 게 씨앗을 확산.
   3. 배치 MS 격판덮개의 뒤에 층 류 두건 절반 닫힌 뚜껑의. MS 판에서 증발을 초과 하는 물을 허용.
   4. MS 접시에 뚜껑을 배치. 미소 한 구멍이 있는 종이 수술 테이프와 플레이트를 포장 하 여 MS 접시를 봉인.

4. MS 판에 애기의 성장

1. 4 ˚C와 주위 습도에서 3 일 동안 위에 뚜껑 접시를 놓습니다.
   참고:이 프로세스 계층 이라고 하 고 개별 씨앗의 발 아를 동기화 하는 역할.
2. 성장 환경에 격판덮개 전송.
   23 ° C에서 유지 온도 빛의 강도 120-150 µ / m ² s 16 h 빛 / 8 h 어두운
   1. photoperiod. 뿌리 성장 매체에 접시 위에 뚜껑 성장 환경에 평면 배치.
3. 접시에 모 종 8 일 동안 성장 하자.
   참고: 8 주 성장 기간 늦게 발 아 씨앗을 출 수 있습니다. 모든 씨는 출 아 했다 경우 접시 8 일 보다 빨리 득점 될 수 있습니다.
4. 발 아 속도 점수.
5. 레코드 수가 씨를 출 아 했다 그리고 그가 안 출 아 했다
   . 출 아 했다 종자의 수를 분할 하 여 발 아 율을 계산 판에 씨앗의 총 수.
   주: 발 아는 radicle 씨 코트 밖에 서 예상은 하 고 두 cotyledons 표시 계산 됩니다.
6. 종자 살 균 조건의 효과 결정 하는 형에 의해 영향을의 수를 계산 하는 또한.

결과

애기 씨 오픈 필드, 온실 또는 성장 챔버 로부터 수집 때로는 곰 팡이 및 박테리아^1,4처럼 다양 한 미생물에 의해 오염. 따라서, 메 마른 매체에 씨를 출 아 특히 도전 수는 접시의 오염으로 인해 씨앗 공급이 제한 하는 경우에 특히. 표 백제와 염소 가스 살 균을 위해, 결과 아래 제공 됩니다, 최적화 된 프로토콜이이 문제를 최소화 하 고 높은 처리 응용 프로그램에 필요한 씨앗의 생존 능력을 유지.

애기 열 0 씨앗의 발 아에 표 백제 살 균의 효과

표 백제는 수많은 식물 종의 살 균 씨에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 에이전트입니다. 노출 시간과 살 균 에이전트의 최적 농도 종 사이 변화 한다. 애기 씨^{1,,45,6,7,,89} 의 살 균을 위해 표 백제를 사용 하 여 여러 프로토콜 고용 되었습니다. ^{, 10}. 표 백제 5 다른 노출 시간 기간 테스트와 결과의 4 개의 다른 농도에 선물 된다 그림 1. 치료는 컬럼비아 야생-타입 (열 0) 씨앗에 적용 했다. 표 백제 농도 살 균의 시간 사이 중요 한 상호 작용에 의해 증명으로 Col 0 씨앗의 발 아에 표 백제 농도의 효과 살 균에 따라 다양 한 (그림 1, P < 0.001, ANOVA-분산 분석).

5 그리고 10 분 사이 살 균 시간을 가진 실험에서 모든 표 백제 농도와 치료 열 0 씨앗 (그림 1)의 동등 하 게 높은 발 아 율 귀착되는. 높은 발 아 율 또한 항상 살 균에 대 한 40% 및 50% 가구 표 백제 농도 대 한 관찰 되었다. 80%와 100% 표백 치료 10 분 보다 더 긴 기간 결과 중요 한에 대 한 짧은 몸을 담글 시간에 비해 발 아 비율 감소 (P < 0.01, ANOVA). 또한, 80%와 100 분에 대 한 치료, 표 백제에 대 한 발 아 크게 감소 했다 해당 40%와 50% 표 백제 치료에 비해 (P < 0.001, ANOVA).

씨앗의 표백 및 shriveling 높은 표 백제 농도 15 분 이상 사용 하는 경우 다양 한 수준의 표시. 또한 상대적으로 높은 (최대 32%까지) 씨 사망, 세균된 씨 자주 cotyledons 전개 및 연장, hypocotyls의 실패에 반영 성장 결함을 보여 이러한 조건에서 살 균 개발 체포 결과. 대부분 치료 (14 중에 20)은 완전히 형 무료, 전체 몰드 레벨 평균 0.21% ± 0.003의 (표 1)의 결과로.

50% 표 백제와 몸을 담글 시간 10 분을 치료 하기 때문에 그것은 높은 발 아 비율 함께 표면 병원 체 성장의 좋은 억제 최고의 살 균 정권으로 선정 됐다. 이 치료는 아래 설명 된 대로 다른 돌연변이 라인에 표 백제 살 균의 효과 테스트 선정 됐다.

Col 0 씨앗의 발 아에 염소 가스 살 균의 효과

염소 가스 살 균 조건 최적화, 염소 가스의 3 개의 다른 농도 두 기간 (표 2)에 대 한 열-0 씨앗 소독 하 사용 되었다. 가스 농도 집중된 HCl의 볼륨에 다음과 같은 수식을 사용 하 여 살 균 컨테이너의 볼륨을 기준으로 계산 했다:

이 방정식은 12.3 M HCl, 23 ° C의 온도, 표준 기 압 101.3 kPa의 가정 이상 기체 법칙을 사용 하 여 파생 되었다.

Col 0 씨앗의 발 아에 염소 가스 농도의 효과 시간과 농도 요인 사이의 중요 한 상호 작용에 의해 표시 된 대로 살 균의 시간에 따라 표시 했다 (그림 2A, P < 0.01, ANOVA) . 염소 가스 농도 1 시간 살 균 대상이 열 0 씨앗의 발 아에 더 큰 영향을 했다. 이 살 균 시간으로 염소 가스의 모든 농도 승진 마찬가지로 85% 이상의 발 아의 높은 수준 (P > 0.05, ANOVA). 다른 한편으로, 3 h 긴 살 균 귀착되 었 다 두 더 낮은 가스 농도와 비교 하는 염소 가스의 최고 농도 대 한 발 아 율에 큰 감소 (P < 0.05, ANOVA). 이 결과 나타냅니다 애기 씨앗 1 h에 대 한 테스트 염소 가스 농도 또는 3 h 16.5% 아래 가스 농도의 치료 때문에 발 아 율은 항상 큰 씨앗 생존을 보존에 동등 하 게 효과적인 보다 82%. 그러나, 16.5% 가스 3 h에 대 한 씨앗을 살 균 했다 씨앗 발 아에 해로운.

금형의 발생률 또한 가스 농도 및 노출 시간에 의존 했다. 1 h 동안 치료에 대 한 염소 가스를 6.1%와 16.5%의 상대적으로 높은 농도 3 h (그림 2B)에 대 한 모든 가스 농도 효과적으로 형 성장을 저해 했다.

1 h (표 2) 6.1%의 가스 농도와 치료 최고의 기상 살 균 조건으로 선정 되었다 높은 발 아 율 (결합 이후 다른 돌연변이 선에 가스 살 균의 효과 테스트 이러한 결과 바탕으로, 85%) 금형 오염 (0.02%)의 매우 낮은 수준.

잠재적인 다른 발 아 씨앗에 표 백제와 염소 가스 살 균의 효과

통계 분석 했다 살 균 방법 발 아 응답 라인의 발 아 가능성에 의존 했다 (그림 3A, P < 0.01, ANOVA). 표 백제도 염소 가스 살 균 높은 발 아 잠재적인 (그룹 4와 5)와 씨앗의 발 아 율 감소. 어느 치료가 했다 최저 발 아와 그룹의 이미 낮은 발 아 율에 영향을잠재력 (그룹 1)입니다. 반면, 염소 가스 살 균 결과 상당한 감소 약 12-18% (P < 0.01, ANOVA) 중간 발 아 가능성 (그룹 2와 3) 종자의 발 아에. 표 백제 살 균 또한 그룹 2의 13% 발 아 속도 감소 하지만 그룹 3의 발 아 율을 감소 하지 않았다. 비록 어떤 발 아 그룹에서 가스 치료 표 백제와 염소 사이의 발 아 속도에 큰 차이 없었다 (그림 3A, P > 0.442, ANOVA), 씨앗 소독 표 백제를 사용 하 여 약간 더 높은 있었나요 모든 발 그룹에 가스 소독 씨앗 보다 발 아 속도입니다.

크게 변경 하는 살 균 처리 (P < 0.001, ANOVA) 씨앗 형 (그림 3B)에 의해 영향을의 %. 적은 금형 성장 귀착되 었 다 두 염소 가스와 표 백제 살 균 (P < 0.05, ANOVA) 아무 살 균에 비해. 어떤 그룹에서 가스와 표 백제 살 균 사이 감지 형 수준에 차이가 없었다 (그림 3B, P > 0.4, ANOVA).

그림 1: 애기 열 0 씨앗의 발 아에 표 백제 농도 살 균의 효과. 값은 수단 ± SD 5 독립 복제 실험에서 얻은입니다. 표 백제 농도의 범위에 대 한 기간을 몸을 담근 채 5 분을 기준으로 상당한 차이 나타냅니다 (P < 0.01, ANOVA). ^#기간 80%와 40% 및 20 분에 대 한 50% 100% 표 백제 농도의 중요 한 차이 나타냅니다 (P < 0.01, ANOVA). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 염소의 효과 가스 농도 살 균 시간 애기 열 0 씨에. (A) 발 아 율 및 (B) 형 수준. 오차 막대 수단 ±를 SD 5 생물학 및 실험의 5 기술 복제에서 가져온 나타냅니다. 편지를 공유 하지 않는 의미는 크게 다른 (P < 0.05, ANOVA). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 잠재적인 다른 발 아 씨앗에 표 백제와 염소 가스 살 균의 효과. (A) 발 아 율 및 (B) 형 수준. 100 솔 크 T DNA 라인은 어떤 살 균 제의 부재에 발 아 율으로 정의 잠재적인 그들의 발에 따라 5 개의 그룹으로 분류 했다. 발 아 율에 따라 그룹은 다음과 같습니다: 그룹 1 (0-20%), 그룹 2 (21-50%), 그룹 3 (51-70%), 그룹 4 (71-90%)와 그룹 5 (91-100%). 라인 무작위로 선택 했다 고 그들의 발 아 잠재적인 유전자 형에 의존 하지 않았다. 값은 수단 ± SD 3 개의 독립적인 복제 실험에서 얻은입니다. 각 값 위에 문자 ("a", "ab", "c", 등등) 분류 방법의 통계 그룹을 나타냅니다. 편지를 공유 하지 않는 의미는 크게 다른 (P < 0.05, ANOVA). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

살 균 시간 (분)	표 백제 농도 (%)
	40	50	80	100
5	0.00%	0.00%	0.00%	2.13%
8	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%
10	0.00%	0.50%	0.00%	0.36%
15	0.00%	0.00%	0.00%	0.68%
20	0.19%	0.28%	0.00%	0.00%

표 1: 표 백제 살 균 열-0 씨의 금형 수준.

표 백제	HCl	시간	% 염소 가스 (Cl2/mol 총 가스 몰)
(mL)	(mL)	(h)
25	1	1	2.1
25	1	3	2.1
100	3	1	6.1
100	3	3	6.1
200	9	1	16.5
200	9	3	16.5

표 2: 염소 (Cl₂) 컬럼비아 야생-타입 씨앗 7 L 컨테이너를 사용 하 여 살 균 처리 가스.

보충 표 1: 스프레드 시트 컨테이너 및 % Cl₂의 다른 볼륨에 대 한 계산을 수행 하는 프로그램. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

메 마른 매체에 애기 씨, 성장 하는 때 살 균의 일종이 적용 되어야 한다. 표 백제와 염소 가스 살 균 치료 결과 비슷한 발 아 율 및 금형 성장 저해. 어느 살 균 방법 잠재적인; 높은 발 아 씨앗 발 아 율에 상당한 감소를 발생 그러나, 표 백제 살 균 것이 좋습니다 줄 때문에 소형, 낮은 발 아 가능성 (20-70%), 비-중요 한, 발 아 율 향상 (그림 3A) 가스 살 균에 비해 이기는 하지만.

애기 씨 최대 10 분 동안 40-100%에서 표 백제 농도와 살 균 만족 발 아 비율 및 효과적인 몰드 억제를 제공 한다. 비록 40% 미만 표 백제 농도 40%의 농도 또는 제비 조차 무 겁 게 오염 된 씨앗의 높은 보장 효과적인 살 균을 사용 하 여 대부분 씨앗 많은 대 한 적절 한 살 균을 제공. 그것은 살 균의 10 분을 초과 하는 표 백제 농도 동등한을 사용 하는 경우 중요 또는 높은 씨 사망률과 종묘 개발에 결함을 피하기 위해 80% 보다 더 높은.

6.1% 나 높은 발 아 속도 적절 한 금형 제거에 1 h 결과 16.5%의 염소 가스 농도와 애기 씨를 치료. 살 균 3 h의 기간을 증가 시켜 낮은 염소 가스 농도 (2.1%)을 성공적으로 사용할 수 있습니다.

몇 줄 소독 될 필요가 있다, 10 분에 대 한 50% 표 백제의 솔루션에 액체 살 균 것이 좋습니다. 라인의 큰 숫자, 1 h 6.1%의 가스 농도와 살 균 가스 때문에 많은 라인 수 멸 균 수 신속 하 고 쉽게 적은 조작으로 더 나은 옵션입니다.

우리의 결과 다른 genotypes의 씨앗의 많은 수와 잠재적인 낮은 발 아 된 씨앗을 살 균에 대 한 표준화 조건을 제공 합니다. 이러한 살 균 기술에 대 한 유일한 제한은 그들이 씨앗 발 아 률 광범위 한 씨 사망으로 인해 20% 미만에 적용할 수 없습니다입니다. 쥡니다¹⁷, 살 균의 부재에 발 아 율을 높이기 위해 같은 대체 방법, 이러한 경우에 도움이 될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.65mL 마이크로 원심분리기 튜브	GeneMate	C-3260-5	튜브: 멸균을 수행하기 위해 Arabidopsis thaliana 씨앗을 배치
1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브	GeneMate	C-3262-1	튜브: 멸균을 수행하기 위해 Arabidopsis thaliana 씨앗을 배치하는
7L 플라스틱 용기	Sistema	1016265438	가스 살균이 수행되는 용기
염소	가스를 생성하는 과정에 사용되는	Sigma-Aldrich	320331
일회용 멸균 접종 루프	Fisher Scientific	22-363-603	루프는 MS 플레이트에 애기장대 씨앗을 퍼뜨리거나 배치하는 데 사용됩니다
Gamborg' S 비타민 해결책	Sigma-Aldrich	G1019	비타민 해결책은 MS 매체를 만드는 과정에서 이용
가구 표백제	Clorox	일정한 표백제	염소 가스와 액체 sterliziation
MES 수화물	Sigma-Aldrich	M2933	화학물질을 만드는 과정에서 이용되는 MS 매체
Micropore 외과 테이프	3M	1530-1	년을 만드는 과정에서 이용됩니다MS 플레이트를 밀봉하는 데 사용되는 미세다공성 수술용 종이 테이프
Murashige와 Skoog 기초 염 혼합물 (MS)	Sigma-Aldrich	M5524	화학물질 MS 매체를 만드는 과정에서 사용되는
화학물질 Parafilm M	Bemis Company	#PM996	살균 용기를 밀봉하는 데 사용되는 Parraffin 필름
Petri 접시 100 X 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713	Arabidopsis thaliana pH 지시약 스트립을 성장시키기 위해 MS 배지를 붓는 페트리 접시
	Whatman	2613991	중성 염소 및 중탄산나트륨 용액의 pH를 확인하는 데 사용
Phytoagar	Fisher Scientific	50-255-212	종자 도금 과정에서 애기장대 종자의 현탁을 돕기 위해 사용
중탄산나트륨	시그마 - Aldrich	S5761	염소 가스 반응 중화 과정에 사용되는 화학 물질
자당	그마 - 알드리치	S0389	MS 매체
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100	액체 살균 과정에 사용되는 화학 물질
Arabidopsis thaliana 씨앗	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org	CS70000 (Col-0)	을 통해 주문애기장대(Arabidopsis) 야생형 씨앗
Arabidopsis thaliana 씨앗	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_037606C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 Arabidopsis 씨앗
	TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_041402C	의 일부로 테스트에 사용된 Arabidopsis
씨앗	TAIR www.arabidopsis.org	SALK_059101C	를 통해 주문그룹 1 애기장대 탈리아나 종자 ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자
	; TAIR www.arabidopsis.org 통해 그룹	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_063470C 애기장대 종자를
		자의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자를	주문
	증권 시세 표시기; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 그룹		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_072240C 애
장대 탈리아나 종자		하고, TAIR www.arabidopsis.org 를 통해	의 일부로 테스트에 사용된 SALK_084124C 애기장대 종자를
애기장대 탈리아나 씨앗	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_085049C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애
	TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_089717C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 씨앗
	TAIR www.arabidopsis.org	SALK_107354C	를 통해 주문그룹 1
애기장대 탈리아나 종자	; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 그룹		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_110111C 애기장대 종자를
			일부로 테스트에 사용한 애기장대 종자를
	증권 시세 표시기; TAIR www.arabidopsis.org 통해 그룹		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_113109C 애기장대 종자를
애기장대 탈리아나 종자		하고, TAIR www.arabidopsis.org	통해 그룹 1의 일부로 테스트에 사용된 SALK_114872C 애기장대 종자를
애기장대 탈리아나 씨앗	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org 통해 주문	SALK_115657C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애
	TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_116803C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 씨앗
	TAIR www.arabidopsis.org	SALK_039445C	를 통해 주문그룹 2 애기장대 탈리아나 종자 ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자
대 탈리아나 종자		TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문; 그룹
	증권 시세 표시기; TAIR www.arabidopsis.org	SALK_045828C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애
			의 일부로 테스트에 사용된 SALK_048556C 애기장대 종자를
	하고, TAIR www.arabidopsis.org 를 통해	2의 일부로 테스트에 사용된 SALK_049514C 애기장대 종자를
Arabidopsis thaliana 씨앗	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_049725C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 Arabidopsis 씨앗
			ABRC의 일부로 테스트에 사용된 Arabidopsis 씨앗
	TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081176C	를 통해 주문그룹 2 애기장대 탈리아나 종자 ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자
	; TAIR www.arabidopsis.org 통해 SALK_081770C		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애
	일부로 테스트에 사용된 SALK_082262C 애기장대 종
자를	주문하십시오.증권 시세 표시기; TAIR www.arabidopsis.org	SALK_082289C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애
	하고, TAIR www.arabidopsis.org		의 일부로 테스트에 사용된 SALK_082702C 애기장대 종자를
	TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문하고,	그룹 2의 일부로 테스트에 사용된 SALK_083630C 애기장대 종자를
애기장대 탈리아나 씨앗	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_084635C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애
	TAIR www.arabidopsis.org 통해 그룹		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_085337C 애기장대 씨앗
	; TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085656C	를 통해 주문그룹 2 애기장대 탈리아나 종자 ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자
	; TAIR www.arabidopsis.org	SALK_093049C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자를
			일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자
	증권 시세 표시기; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 그룹		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_105336C 애기장대 종자
		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_105704C 애기장대 종자를
	TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	그룹 2의 일부로 테스트에 사용된 SALK_106388C 애기장대 종자를
애기장대 탈리아나 씨앗	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_109575C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기
	TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_110580C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 씨앗
	TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110617C	를 통해 주문그룹 2 애기장대 탈리아나 종자 ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자
	; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 그룹		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_111424C 애기장대 종자를
		자의
	증권 시세 표시기; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 그룹		의 일부로 테스트에 사용된 SALK_112097C Arabidopsis 종자
Arabidopsis thaliana 종자		; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 그룹	2의 일부로 테스트에 사용된 SALK_115837C Arabidopsis 종자를
애기장대 탈리아나 씨앗	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_019535C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기
			ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_026478C 애기장대 씨앗
	TAIR www.arabidopsis.org	SALK_046565C	를 통해 주문그룹 3 애기장대 탈리아나 종자 ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자
대 탈리아나 종자		TAIR www.arabidopsis.org www.arabidopsis.org 통해 주문;	일부로 테스트에 사용된 SALK_049339C 애기장대 종자를
	증권 시세 표시기; TAIR www.arabidopsis.org 통해 그룹		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_056307C 애기장대 종자를
	하고, TAIR www.arabidopsis.org 통해		의 일부로 테스트에 사용된 SALK_081292C 애기장대 종자를
	하고, TAIR www.arabidopsis.org 통해	그룹 3의 일부로 테스트에 사용된 SALK_081597C 애기장대 종자를
애기장대 thaliana 씨앗	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_083488C	의 일부로 테스트에 사용된 애
			ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_110573C 애기장대 씨앗
	TAIR www.arabidopsis.org	SALK_112793C	를 통해 주문그룹 3 애기장대 탈리아나 종자 ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자
	; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 그룹		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_113658C 애기장대 종자를
	일부로 테스트에 사용된 SALK_113904C 애기장대 종
자를	주문하십시오.증권 시세 표시기; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_114673C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자
	의 일부로 테스트에 사용된 SALK_114709C 애기장대 종자를
	TAIR를 통해 주문; 그룹	3의 일부로 테스트에 사용된 SALK_115455C 애기장대 종
Arabidopsis thaliana 씨앗	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_013186C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 Arabidopsis 씨앗
	TAIR www.arabidopsis.org 통해 주문	SALK_018261C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 Arabidopsis 씨앗
	TAIR www.arabidopsis.org	SALK_062509C	를 통해 주문그룹 4 애기장대 탈리아나 종자 ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자
	의 일부로 테스트에 사용된 SALK_080639C 애기장대 종자를	TAIR www.arabidopsis.org 통해 주문
		일부로 테스트에 사용된 SALK_088586C 애기장대 종자를	TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문
	증권 시세 표시기; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 그룹		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_096651C 애기장대 종자를
	하고, TAIR www.arabidopsis.org		의 일부로 테스트에 사용된 SALK_106900C 애기장대 종자를
	그룹 4
Arabidopsis thaliana 씨앗	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_111051C	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 Arabidopsis 씨앗
			ABRC의 일부로 테스트에 사용된 Arabidopsis 씨앗
	TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113223C	를 통해 주문그룹 4 애기장대 탈리아나 종자 ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자
	; TAIR www.arabidopsis.org 통해 그룹	ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_121391C 애기장대 종자를
		자의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자를	주문
	증권 시세 표시기; TAIR www.arabidopsis.org 통해 그룹		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_201905C 애기장대 종자
장대 탈리아나 종자		; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 그룹	5의 일부로 테스트에 사용된 SALK_000662C 애기장대 종자를
애기장대 thaliana 씨	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org	SALK_029335C	의 일부로 테스트에 사용 된 애
	TAIR www.arabidopsis.org 통해 주문	SALK_047760C	의 일부로 테스트에 사용 된 애기장
씨앗	TAIR www.arabidopsis.org	SALK_071275C	를 통해 주문그룹 5 애기장대 탈리아나 종자 ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자
	의 일부로 테스트에 사용된 SALK_080530C 애기장대 종자는	TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문
		일부로 테스트에 사용된 SALK_103881C 애기장대 종	TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문
	증권 시세 표시기; TAIR www.arabidopsis.org 통해 그룹		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_110864C Arabidopsis 종자
Arabidopsis thaliana 종자		; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	그룹 5의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자를
애기장대 탈리아나 씨앗	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_132808C	의 일부로 테스트에 사용된 애
			ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 씨앗
	TAIR www.arabidopsis.org	SALK_139519C	를 통해 주문그룹 5 애기장대 탈리아나 종자 ABRC의 일부로 테스트에 사용된 애기장대 종자
		의 일부로 테스트에 사용된 SALK_140643C 애기장대 종자를	www.arabidopsis.org TAIR
		자의 일부로 테스트에 사용된 SALK_142288C 애기장대 종자를	TAIR 를 통해 주문
	증권 시세 표시기; TAIR www.arabidopsis.org 통해 그룹		ABRC의 일부로 테스트에 사용된 SALK_143304C 애기장대 종자
		의 일부로 테스트에 사용된 SALK_147597C 애기장대 종자를
	; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 그룹	5의 일부로 테스트에 사용된 SALK_209076C 애기장대 종자를
Arabidopsis thaliana 씨앗	ABRC; TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문	SALK_081081C	그룹 5 및 1
Arabidopsis thaliana 씨앗	TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문		5 및 2의 일부로 테스트에 사용 된 SALK_107487C Arabidopsis 씨앗