방법 논문

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

DOI:

10.3791/56589

⸱

2018년 1월 8일

 ,  , 
1Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez, 2Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리는 기본 유 방 암 세포 뿐만 monocytes 그리고 콜라겐 저하, 면역 세포 모집, 셀 결과 함께 그들의 직접/간접적인 상호 작용 연구로 형태를 분석 하는 3 차원 문화 방법 설명 침공, 그리고 암 관련 된 염증의 승진.

초록

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세포 외 기질 (ECM)에 포함 된 정상 및 종양 약 상피 세포 속속들이 조 혈 및 비 조 혈 세포, 따라서 크게 영향을 미치는 정상 조직의 항상성 및 질병 결과와 통신 합니다. 유방암, 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam) 역할을 중요 한 질병의 진행과 전이, 재발; 따라서 질병을 제어 하는 것이 중요이 monocyte chemoattraction 종양 microenvironment 및 종양 세포와 그들의 상호 작용의 메커니즘을 이해. 여기, 우리는 인간 유방암 (BrC) 세포 및 인간 monocytes의 3 차원 (3D) 공동 문화 시스템에 대 한 자세한 설명을 제공합니다. BrC 셀 생산 활성화에 규제의 높은 기초 수준, 정상적인 T 세포 표현 (RANTES) 분 비, monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1), 그리고 granulocyte macrophage 식민지 자극 인자 (G-CSF), monocytes, 공동 문화에 프로 염증 성 cytokines 인터 루 킨 (IL)-1 베타 (IL 1β) 및 IL-8 매트릭스 metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, 및 MMP-10 풍성 하 게 했다. 이 종양 기질 microenvironment 승진 anoikis MCF 10A 3D acini 같은 구조, monocytes의 chemoattraction 그리고 적극적인 BrC 셀의 침공에 저항. 여기에 제시 된 프로토콜 내 종양 커뮤니케이션을 공부 하는 저렴 한 대안을 제공 하 고 3D 셀 시스템 생체 외에서 심문 종양 관련 종양 생물학의 특정 기능을 제공 하는 중대 한 잠재력의 예 침략입니다.

서론

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종양 생물학은 이전에 생각 보다 훨씬 더 복잡 한. 종양 세포는 억제 되지 않는 확산 셀;의 단순한 대량 보다 더 많은 보여주는 증거를 장착 오히려, 다른 종양 약 세포 높은 조직과 종양1내에서 계층 구조를 표시 하는 다른 기능을 수행 같다. 종양 세포는 또한 비 변형 세포와의 친밀 한 커뮤니케이션에서: 대 식 세포, 섬유 아 세포, 림프 톨, adipocytes, 내 피 세포, 다른 셀 들 모두에 몰입 하는 비 계 단백질 및 다 당 류는 ECM을 구성 하는. 수많은 직접 및 간접적인 상호 작용 변환 및 비 변형 세포 사이 및 질병 결과2,3에 강력한 영향을 미치는 ECM으로 설정 됩니다. BrC의 특정 한 경우에 그것은 특히 Tam, 고려는 Tam 발견 되었습니다는 종양의 진화에 중요 한 역할을 증가 하는 전이의 위험과 질병 재발4의 BrC 셀의 통신을 해 부하는 것이 중요 ,5.

내부 종양 상호 작용 및 그들의 가능한 결과 분석, 새로운 3D 생체 외에서 방법을 개발 되었으며, 훨씬 더 복잡 한 microenvironment를 제공 하는 ECM 추출 물의 사용에 따라 종양 생물학, 비교에서의 현실에 가까운 기존의 단층 세포 배양 세포 성장 플라스틱에 첨부. 피터슨와 Bissell6 아의 첫 번째 모델을 제공 하 고 악성 유 방 상피 세포 laminin 풍부한 지하실 멤브레인에 교양 아 인간을 차별 하는 3D organotypic 구조를 설명 하는 첫번째 이었다 그들의 악성에서 유 방 상피 세포입니다. 10 년 뒤, 모델 Debnath, Muthuswamy에 의해 개발 및 브루 게7,,89 선의 acini의 악성 변환 하는 동안 손상 하는 생물 학적 경로 명료 하 게 하는 귀중 한 도구 제공 등 통제 확산, 장애인된 셀 분극의 증거 및 anoikis, 셀 저항 결과로 acini 루멘으로 꽉 접합 단백질의 delocalization 인해 큰 acini 형성으로 프로그램 된 세포 죽음의 종류를 발생 앵커리지-종속 셀 때 그들은 주변 ECM에서 분리. Sameni, Jedeszko, 및 슬론의 모델은 밀접 하 게 침입, 종양 암10,,1112의 또 다른 중요 한 특성에 관련 된 세포에 의해 이미징 분해 활동에 집중 했다. 섞인 다른 형광 침묵 단백질 기질 단백질 행렬에 의존 하는이 모델 (DQ 젤라틴, DQ-콜라겐, 그리고 DQ 콜라겐 IV), 어떤 형광 신호에는 콜라겐의 분해 저하의 지표. 3D 모델 변형 비 둘 다의 줄기 세포 속성과 셀의 집계, spheroids 라고 하는 종양 세포를 공부 하는 데도 사용, ECM 같은 단백질 세포 분화, 비대칭의 메커니즘에 대 한 질문 또는 정지에 경작 될 수 있습니다. 세포 분열, 세포 준수, 및 세포 운동 성13,14. 침공 분석 실험 종양의 본질적인 공격 성과 침략 과정15중 chemoattractants로 봉사 하는 분자의 식별의 테스트 수 있습니다. 전반적으로, 3D 모델의 체 외에서 세포 배양 정상 및 종양 조직 morphogenesis 더 밀접 하 게 반영 하는 저렴 한 다양화를 나타냅니다.

우리 인간의 상업 BrC 셀 라인 알려진된 공격적 잠재력 (luminal 및 트리플-네거티브 형식) 및 기본을 사용 하 여 상기 모델7,,1011에 따라 3D 셀 공동 문화 시스템 설계 셀 explanted BrC 환자에서. 우리가 먼저 적극적인 비 (MCF-7) 또는 공격적 (MDA-MB-231) BrC 셀 U937 monocytes 기질 추출 (ECME)와 공동 경작 했다 모델 개발-직접 셀 상호 작용을 허용 하는 3D 시스템을 기반으로. 이러한 공동 문화 어떻게이 두 세포 계보 간 통신 암 공격적인 행동에 관련 된 유전자의 세트의 녹음 방송에 영향을 결정 하기 위해 사용 되었다. 2 cyclooxygenase (COX-2) 대 본의 상당한 증가 하는 제품 중 하나는, 스타 글란 딘 E2 (PGE2), 암 진행에서 염증의 역할을 강조 하는 발견의 생산 증가와 동시에 관찰 되었다. MMP의 증가 전사 또한 적극적인 MDA-MB-231 셀 U937 monocytes DQ 콜라겐 IV 포함 된 문화에 함께 공동 경작 했다 때 큰 콜라겐 베이스와 상관 하는 관찰 되었다. 메모의, 우리의 공동 문화는 세포 세포 상호 작용 메커니즘 콜라겐 저하에 필요한 가정을 지원 하지 않았다. 그것은 오히려 두 세포 계보 간 통신 분 비 분자에 의해 중재 했다 제안 했다. 또한, 이러한 공동 문화 분석 실험에서 수확 supernatants 선의 acini MCF 10A 세포 변형 비13에 의해 형성 된 무질서 수용 성 요소 포함. 그것은 발견 하는 적극적인 고 기본 BrC 세포 분 비 상승 monocyte 혈 분자 MCP-1 GM-CSF와 RANTES의 수준. 따라서, 우리는 세포 세포 세포 상호 작용을 방지 하기 위해 셀 문화 삽입에서 분리 되었다 3D 문화 설명. 이러한 문화는 BrC 세포, monocytes 사이 간접 통신을 해결 하기 위해 사용 되었다. 이 분석 실험, 비 공격적이 고 적극적인 상업 BrC 셀 라인 및 기본 BrC 셀, 인간 monocytes의 세 가지 유형: 상업 U937 및 THP-1 셀, 그리고 기본 monocytes (PMs) (모두 건강 한 기증자의 주변 혈액에서 분리 monocytes는 활성화 되지 않은 상태에서 사용 했다) 사용 되었다. 염증 성 cytokines 일리노이-1β 및 IL-8의 증가 농도 공동 문화에 농축 될 관찰 되었다. 마찬가지로, MMP-1, MMP-2, 및 MMP 10 BrC 셀 monocyte 공동 문화, 그리고 이렇게 강화 이전 결과14에 증가 또한 했다 발견 했다. 이 원고에서 기본 BrC 세포 격리 및 3D 문화에서 테스트 포인트 워크플로 대표적인 결과 함께 제공 됩니다. 이 작품 구성 종양 생물학의 특정 측면이 3D 셀 시스템 생체 외에서 제공 하는 중대 한 잠재력의 좋은 예.

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프로토콜

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BrC 환자에서 샘플과 드 Investigación en Virología y Cáncer, 병원 Infantil 드 멕시코 페데리코 고메스의 조직 은행에서 얻은 했다. 이 연구는 과학에 의해 승인 되었다, 윤리, 및 생물 병원 Infantil 드 멕시코 페데리코 고메스의 보드 검토: 위원회 회의 드 Investigación, 위원회 회의 드 Ética en Investigación 및 위원회 회의 드 Bioseguridad. 모든 환자는 prospectively 등록 했다와 연구의 본질에 대 한 정보를 했다: 그 참여 하고자 표본 수집 전에 한 서 면된 동의 서명 하 고 윤리적 지침 및 최고의 임상 연습의 취급 했다 기관입니다. 참가자의 정체성 연구 기간에 대 한 익명 이었다. 포함 하는 환자는 침략 적인 ductal 암, 조직학 급료 2와 임상 단계 II, 조직 절제 하기 전에 아무 이전 neoadjuvant 요법으로 진단 했다. 환자 했다 모든 여성 세 평균 56.8 세 (범위 75 42)14.

1. 3D 세포 배양

  1. 시드 0.1 x 106 MCF 10A 셀 또는 기본 BrC 셀 5% 보충 DMEM/F12 문화 매체와 25 cm2 문화 플라스 크에 말 혈 청, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 0.5 µ g/mL 날린, 10 µ g/mL 인슐린, 그리고 20 ng/mL의 표 피 성장 인자 (EGF). 시드 0.1 x 106 상업 BrC 셀, MCF-7 셀, 및 75 cm2 MDA-MB-231 셀 DMEM/F12 문화 매체와 10 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 보충 플라스 크를 문화. 37 ° c 습도 5%에서 품 어 CO2 환경.
  2. 48 h 후 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 살 균 1의 10 mL와 함께 셀 단층을 씻어. 0.05 %trypsin 및 0.48 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 37 ° c.에 5-10 분의 3 mL 솔루션 셀 단층 trypsinize 200 µ L trypsinization 막으려고 해당 혈 청의 보충 없이 매체의 7 mL를 추가 합니다. Pipetting으로 셀 resuspend 고 Neubauer 챔버에 셀 10 µ L의 약 수를 제거 합니다.
  3. 8 잘 챔버 슬라이드 시스템의 각 우물에서 순수한 ECME, 37 ° c.에 30 분의 부 화 뒤의 40 µ L 기반 확산
  4. 각 잘에서 배치 단계 1.1 하지만 다음 변경 보완 (페 놀 레드) 없이 DMEM/F12의 400 µ L에서 resuspended 800 셀: 4 ng/mL EGF와 2%의 추가 기본 BrC 셀 및 MCF 10A 셀, ECME; MCF-7 및 MDA-MB-231, 추가 2 %ECME.
  5. 습도 5%에서 37 ° C에서 문화를 품 어 CO2 환경. 문화 미디어 모든 48 h를 교체 합니다.
  6. 형태학 상 기록 변경 셀의 모든 24 h 15 일 광학 현미경으로 합니다. 기본 BrC의 형태를 분석 하 셀, MCF 10A 및 MDA-MB-231 셀 회선이 좋은 참조 셀에 대 한 정렬 된 포상 대형 그리고 무질서 공격적인 암 같은 구조, 예 각각 합니다.
  7. 100 X 200 X 확대의에 밝은 분야 현미경 검사 법에 있는 셀의 이미지를 얻 및 참조 MCF 10A와 MDA-MB-231 셀 라인 (그림 1) 셀 형태를 비교 합니다.

2. 종양 조직에서 기본 암 세포를 얻기

참고: 얻기 위해 종양 상피 세포 사용 BrC 환자에서 절제 기본 종양에서 조직 없이 이전 neoadjuvant 요법; 괴 사 성 영역을 방지 하 고 종양 조직의 0.5 c m3 의 최소와 함께 작동.

  1. 살 균 1 x PBS 가진 종양 조직 린스를 기계적으로 메스와 함께 1-2 m m 조각으로 세분화 합니다.
  2. 실내 온도 (RT) 따라 솔루션의 2 mL에 2 h에 모자 살 균 20 mL 유리 유리병에 조직 소화: 어 DMEM/F12 매체 포함 100 U/mL 페니실린에 100 µ g/mL 스 100 U/mL hyaluronidase 1 mg/mL 콜라 유형 혼합 지속적인 교 반으로.
  3. 소화 되지 않은 조직의 큰 조각을 제거에 얇은 명주 그물의 멸 균된 조각 통해 결과 정지를 필터링 합니다. 다음 필터링 소독된 100 µ m 기 공 세포 막을 통해 세포 현 탁 액.
  4. 430 x g RT에서 5 분 동안에 세포를 작은 하 고 살 균 1 x PBS로 두 번 그들을 씻어. DMEM/F12 매체와 5% 말 혈 청, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 0.5 µ g/mL 날린, 10 µ g/mL 인슐린, EGF의 20 ng/mL 보충에 문화 기본 셀. 모든 48 h. 유지 습도 5%에서 37 ° C에서 문화 매체를 대체 CO2 환경.
  5. 고립 된 세포 상피 세포 immunocytochemistry14의 표준 프로토콜 인지 확인 합니다. 3 상피 마커 테스트: cytokeratins (PanCK)의 패널 mucin-1 (Muc-1), 그리고 상피 세포 접착 분자 (EpCAM).

3. 말 초 혈액에서 오후 세포 분리

  1. 건강에서 말 초 혈액의 추출 약 40 mL 자원 봉사, 살 균도 무료 1 x PBS와 1:3 비율에서 혈액을 희석 하 고 밀도 그라데이션 분리 대상.
  2. 원뿔 튜브에서 1.077 g/mL의 조밀도 가진 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 매체의 2 개 mL를 놓습니다. 신중 하 고 천천히 8 mL 희석된 혈액의 오버레이. 실시간 사용은 원심 분리기의 느린 가속-감속 속도에서 765 x g 30 분 동안 원심 분리기.
    참고: 원심, 후 4 층 형성 됩니다 아래에서 위로: 적혈구 펠 릿, 밀도 그라데이션 중간 레이어, 단 세포 층 (정밀한 백색 반지로 표시), 그리고 플라즈마 레이어.
  3. 신중 하 게 살 균 파스퇴르 피 펫으로 그라데이션에서 단 셀 계층을 검색 하 고 그들을 씻어 세 번 1 x PBS를 가진 느린 원심 분리 하 여 각 시간 (430, 275, 및 191 x g) 실시간에서 10 분
  4. 부정적인 선택 프로토콜을 사용 하 여 세포의 활성화를 방지. 이러한 프로토콜의 예로 다음과 같은:
    1. 단 셀 버퍼링 세척 솔루션 (0.5% 소 혈 청 알 부 민, 2 mM 1 x PBS에 EDTA)을 한번 씻는 다. Neubauer 챔버에 셀 고 버퍼 솔루션의 1 x 107 셀/30 µ L의 밀도에 그들을 조정 합니다.
    2. 모든 1 x 107 셀에 대 한 FcR 차단 시 약 및 안티 인간 CD3, CD7, CD16, CD19, CD56, CD123, 및 Glycophorin A (상업 키트에 포함)를 포함 하는 monocyte biotin 항 체 칵테일의 10 µ L의 10 µ L를 추가 합니다.
    3. 혼합 셀 및 4 ° c.에 15 분 동안 품 어 추가 버퍼링 세척 솔루션의 추가 30 µ L 플러스 20 µ L의 안티 비오 microbeads (키트에 포함); 혼합 셀 및 4 ° c.에 20 분 동안 품 어
    4. 워시 셀 한번 버퍼링된 솔루션 RT에서 5 분 동안 430 x g에서 원심과 1.5 mL에 resuspend 자력 분리에 대 한 솔루션을 버퍼링 합니다.
    5. 미리 씻어 서 자력 분리 열에 세포 현 탁 액을 로드 하 고 버퍼 솔루션의 7 mL를 추가 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 monocyte 농축 분수 수집, 셀, 및 즉시 경작 하지, 하는 경우 동결 monocytes DMEM/F12 매체 −80 ° C에서 50 %FBS 10 %DMSO 보충의 2 x 106 셀/1 mL의 농도에서
      참고: 그들의 생존을 손상 될 수 있습니다 대로 동결, 2 개월 이상 후 monocytes를 사용 하지 마십시오.
  5. DMEM/F12 매체와 6 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 습도 5%에서 37 ° C에서 100 µ g/mL 스 보충에 PMs의 문화를 유지 CO2 환경.
  6. 활용 하 여 하지 PMs 적어도 두 명의 다른 기증자 로부터 독립적으로, 다른 기증자 로부터 풀링 monocytes monocyte 활성화 될 수 있습니다 실험의 각 세트를 수행 합니다.

4. 3D 구축 공동 문화

  1. 간접적인 상호 작용 3D 공동 문화
    참고:     24-잘 평면 바닥 문화 접시 0.4 µ m 기 공 크기의 멤브레인과 폴 리 카보 네이트 셀 문화 삽입을 사용 하 여 이러한 분석을 수행. 이 분석 결과에서 supernatants 및 세포 실험의 끝에 검색할 수 있습니다.
    1. 10% 보충 RPMI 1640 매체의 10 mL에 2 x 106 U937 및 THP 1 monocytes 육성 FBS, 1% 항생제/antimycotic, 신선한 PMs 보충된 DMEM/F12 매체 (이전에 표시 된 단계 3.5), 습도 5%에서 37 ° c에서 배양 하 고 CO2 환경입니다.
    2. 4 x 105 monocytes 1 mL/그들의 해당 매체의 접시 (2 ECME %와 2% 보완 U937 및 THP 1 monocytes, 또는 2 %ECME 및 6% FBS FBS PMs에 대 한).
    3. 각 잘에 삽입 하 고 해당 매체에 0.9 mL 4 x 105 BrC 세포 현 탁 액의 추가 (보완 2 ECME %와 2 %FBS 상업 세포 선 또는 5%에 대 한 기본 BrC 셀에 대 한 혈 청 말). 총 미디어의 절반 대체 모든 48 h.
    4. 37 ° c 습도 5%에서 품 어 5 일에 대 한 CO2 환경은 supernatants 복구. 이후 분석을 수행 하는 경우 trypsinization으로 셀을 검색 합니다.
    5. 개별 셀 문화는 해당 미디어의 컨트롤을 포함 합니다.
  2. 직접 상호와 3D 공동 문화
    1. BrC 전지와 monocytes mRNA 및 단백질 발현의 분석에 대 한 문화 후 각 세포 계보의 독립적인 정렬 있도록 세포 배양 전에 다른 형광 성 염료와 레이블을 지정 합니다. 자유롭게 살아있는 세포의 세포 막 통과 coumarin rhodamine의 상용 파생 상품을 사용 합니다. 라벨에 대 한 일반적인 프로토콜은 다음과 같습니다.
      1. BrC (25 cm2 문화 플라스 크에 2 × 106 세포)의 세포의 단층을 준비 하 고 형광 염료 표준 기본 매체에 형광 염료의 (1:2, 000의 충분 한 사전 예 열된 작업 솔루션으로 표준 매체를 대체 없이 어떤 보충). 습도 5%에서 37 ° C에서 30 분을 품 어 CO2 환경. 염료 솔루션을 발음 하 고 린스 부드럽게 충분 한 1 x PBS. PBS를 발음 하 고 표준 매체를 추가 합니다.
      2. 37 ° c.에 5-10 분에 대 한 0.05 %trypsin 및 0.48 m m EDTA의 솔루션의 2 mL로 세포 단층 trypsinize 200 µ L trypsinization 막으려고 FBS의 보충 없이 특 파 원 매체의 7 mL를 추가 합니다. Pipetting으로 세포를 resuspend. 셀 Neubauer 챔버에 10 µ L의 약 수를 가져가 라. 셀 계산 후 공동 문화 프로토콜 계속 합니다.
      3. 430 x g RT에서 5 분 동안에 세포를 작은 (이것을 수행 하는 것은 처음 monocytes 정지에서 성장 하기 때문). 상쾌한 삭제 하 고 형광 염료 (보충 없이 표준 기본 매체에 형광 염료의 1:2, 000)의 미리 데워 작동 솔루션의 3 mL로 세포를 부드럽게 resuspend. 습도 5%에서 37 ° C에서 30 분 동안 품 어 CO2 환경.
      4. 셀을 다시 작은 염료 작업 솔루션을 삭제 하 고, 부드럽게 1 x PBS의 5-7 mL와 함께 resuspend. 한 번 더 작은, PBS, 삭제 하 고 표준 매체의 5-7 ml에서 셀 resuspend. 셀 Neubauer 챔버에 세포 현 탁 액의 10 µ L의 약 수를 가져가 라. 셀 계산 후 공동 문화 프로토콜 계속 합니다.
    2. 공동 문화를 다음과 같이 설정:: 4-그럼 챔버 슬라이드 시스템의 각 음에도 레이어를 우물의 바닥에 충분 한 ECME 확산. 5 × 105 잘 당 BrC 셀 표시를 포함 하는 단일 셀 서 스 펜 션의 20 µ L 플레이트.
    3. 37 ° C에 외피의 15-20 분 추가 2.5 x 10의 정지 후5 표시 80 µ L 분석 결과 매체에 monocytes (60% 보충 ECME).
    4. 37 ° c.에 15-20 분을 강화 하기 위해 ECME를 허용
    5. BrC 셀 및 monocyte 문화 미디어의 1:1 믹스의 1 mL를 추가 합니다.
    6. 습도 5%에서 37 ° C에서 공동 문화를 품 어 24 h, 48 h, 또는 다른 시간 지점에서 변경 내용을 추적 하는 5 일 공동2 환경.
    7. 문화에서 세포를 회복 하기 위해 ECM 단백질을 저하. 발음 매체 삭제, 0.1 %trypsin 1 x PBS와 0.25 %EDTA 0.5 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 3 h에 대 한 품 어 부 화, 후 추가 10 %1 x PBS의 0.5 mL FBS 트립 신, 중화 하 고 세포를 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 적극적으로 pipetting으로 resuspend를.
    8. RT에 5 분 동안 765 x g에서 세포를 작은, 상쾌한, 폐기 및 10 %1 x PBS의 5 mL에 셀 resuspend FBS. 일단이 단계를 반복 합니다.
    9. 적절 한 장비 (FACS)를 정렬 하는 형광 활성화 셀으로 셀 서 스 펜 션 적용. 확인 마지막 인구는 적어도 95% 순수).
    10. 정렬 후 살 균 1 x PBS, 펠 릿 (430 x g RT 5 분), 셀을 세척 하 고 살 균 1 x PBS에 resuspend. 세포는 RNA 격리 또는 단백질 분석에 대 한 특정 프로토콜에 따라 처리할 수 있습니다.
    11. 반복 각 분석 결과 3 번, 각 개별 셀 혈통의 컨트롤로 3D 문화를 포함 하 여.
  3. 콜라겐 저하를 평가 하기 위해 3D 공동 문화의 직접 상호 작용
    1. 4.2, 유형 IV 콜라겐 fluorescein isothiocyanate는 ECME에 표시의 32.5 µ g/mL을 추가 하는 추가 단계와 단계에 설명 된 대로 3D 셀 공동 문화를 설정 합니다. 콜라겐 IV는 ECME에서의 최종 농도 0.5% 이다. 페 트리 접시에 35 mm coverslip에 문화를 성장.
    2. 페 트리 접시의 바닥에 ECME의 40 µ L의 레이어를 확산. 37 ° c.에 공고히 ECME 허용
    3. 매체의 10 µ L에서 2.5 x 105 BrC 셀을 추가 하 고 셀 정착을 허용.
    4. (DQ 콜라겐 IV 라는 ECME의 60% 보충) 40 µ L 분석 결과 매체에 1.25 x 105 U937 monocytes 정지를 추가 합니다.
    5. 37 ° c.에 15-20 분을 강화 하기 위해 ECME를 허용
    6. BrC 셀 및 monocyte 문화 미디어의 1:1 혼합의 2 개 mL를 추가 합니다.
    7. 습도 5%에서 37 ° C에서 5 일 동안 공동 문화를 품 어 CO2 환경. 문화 미디어 모든 48 h를 교체 합니다.
    8. 공초점 레이저 스캔 현미경에서 형광 방출 분석 하 고 문화의 50 µ m2 당 (IOD) 통합된 광학 밀도 측정. IODs를 비교 하 여 개별 문화와 문화 시간 0에서 (그림 2)에 대 한.

5. 3d에서 Supernatants의 분석 공동 간접 상호 문화

  1. 5 일 후 공동 문화, 상단 및 3D 공동 문화의 더 낮은 구획 및 개별 3D 문화 컨트롤은 supernatants를 복구 합니다. 잘 각 상쾌한 pipetting으로 혼합. 약 수, 그리고 저장소 사용 (최대 한 달)까지 −20 ° C에 상쾌한.
    참고: 저장 한 달 이상 될 경우 supernatants −80 ° C에 유지.
  2. 분석 결과, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA), 또는 제조 업체의 권장된 절차에 따라 비드 기반 immunoassays 멀티플렉싱과 supernatants 분석.
    참고: Supernatants 또한 서쪽 오 점 분석 하거나 특정 기 공 필터 zymography 분석16,17수행 하 크기 농축 단백질 분수를 통해 집중 수 있습니다. 또는 사용 하는 supernatants 바른된 미디어로 다른 실험에 대 한 아래 설명 된 대로. 바른된 미디어는 일반적으로 5 일 문화 (그림 3)에서 얻어진 다.

6. 특성화는 효과의 Supernatants 기본 BrC 셀에서 Acini 형성과 Acini 구조에의

  1. 8 잘 챔버 슬라이드의 각 잘에서 시스템 ECME의 40 µ L 기반을 확산 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 응고
  2. 씨 800 MCF-셀/잘 1.2 단계에서 설명한 대로 보충된 DMEM/F12 문화 매체의 400 µ L에서에서 최대 10A
  3. 인간 재조합 형 일 1β의 20 ng/mL와 바른된 미디어 또는 보충된 DMEM/F12 문화 매체의 400 µ L를 추가 합니다.
  4. 장소 챔버 슬라이드 35 mm 페 트리 접시를 포함 하는 유리 페 트리 접시에 습도 환경을 만들기 위해 PBS의 2 mL으로 가득 합니다.
  5. 미디어/상쾌한 모든 48 h를 교체 합니다.
  6. 기록 선 acini 형성 모든 24 h 14 일에 대 한 광학 현미경으로.
  7. 14 일 후 문화, 100 µ L의 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 100의 농도에서 acini 얼룩 세포 핵을 관찰 하기 위해 1 x PBS에 nM. 지속적인 교 반에 RT에 25 분 동안 품 어. 지속적인 교 반 실시간 마운트에 형광 염색에 대 한 특정 설치 매체와 준비에 각 시간 5 분, 1 x PBS로 3 번을 씻어. 투명 매니큐어로 밀봉 하 고 유지 4 ° c.에 빛 으로부터 보호
  8. acini acini (그림 4A, B, C)의 다른 깊이 횡단 스택 이미지를 복용 하는 confocal 현미경으로 분석 합니다.
  9. 적절 한 얼룩 프로토콜 acini에 다른 세포 단백질을 시각화. 예를 들어, 전자 cadherin은 세포 세포 접착, 세포 극성 및 루멘 형성18 (그림 4D) 평가 하 스테인드.

7. 마이그레이션 분석 실험

참고: U937의 마이그레이션 분석을 수행, 폴 리 카보 네이트를 사용 하 여 24-잘 평면 바닥 문화 접시에 THP-1, 그리고 신선한 PMs 셀 8 µ m 기 공 크기의 멤브레인과 문화 삽입. 그것은 이전 발산 GM-CSF, MCP-1, 그리고 RANTES 공격적 BrC 셀 라인의 개별 3D 문화에 높은 농도에서 분 비 발견 했다 시연 했다. 그것은 이러한 cytokines 유치 monocytes 기본 종양;의 사이트에 중요 했다 제안 했다 이 chemoattractants는 cytokines를 사용 하 여 마이그레이션 분석 실험에서 시험 되었다.

  1. 문화 U937, THP-1, 또는 신선한 PMs 4.1.1 단계에 설명 된 대로.
  2. 막 화에 세라 없이 RPMI 1640의 200 µ L로 한 번 각 삽입 린스.
  3. 찬 ECME의 50 µ L 채워, 삽입 바닥이-24-잘 빠진 문화 접시에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 유해를 ECME를 허용
  4. 접시의 위 구획에서 FBS 없이 RPMI의 180 µ L를 추가 합니다. GM-CSF의 어느 100 ng/mL으로 보충 RPMI의 버블링 800 µ L 없이 낮은 챔버에 추가 MCP-1, 또는 chemoattractant로 RANTES. cytokines 없이 매체를 사용 하 여 부정적인 컨트롤. Chemokine 그라데이션 설정 하 37 ° C에서 30 분 동안 품 어.
  5. 1.5 x 105 monocyte 무 균 튜브, 세척 두 번의 각 유형의 1 mL PBS, FBS 없이 RPMI의 20 µ L에서 실시간 Resuspend monocytes에 5 분 동안 430 x g에서 원심 분리기 x 1의,와 함께에서 넣어 삽입 그리고 매우 신중 하 게 균질 세포 현 탁 액 (상단 챔버의 최종 볼륨은 200 µ L).
  6. 습도 5%에서 37 ° C에서 24 h에 대 한 진행에 셀 마이그레이션 허용 CO2 환경.
    참고: Monocytes는 비 점착, 철새 셀 일반적으로 더 낮은 구획의 미디어에 있을 것입니다.
  7. 삽입을 제거 하 고, 미디어, 검색 하 고 2, 4, 6, 및 24 h Neubauer 챔버 또는 교류 cytometer;를 사용 하 여 셀의 개수 또는 셀 미디어에서 발견 하는 경우에 특히 디지털 카메라 이미지 삽입의 하단 부분을 취득. 3 임의의 필드 (100 배 확대)에서 평균 세포 수 분석 (그림 5)에 사용 됩니다.

8. 침공 분석

참고: 8 µ m 기 공 크기의 멤브레인과 폴 리 카보 네이트 셀 문화 삽입을 사용 하 여 24-잘 평면 바닥 문화 접시에 BrC 셀의 침입 분석을 수행 합니다. 우리의 원래 학문에서는, IL-8 BrC 셀/monocyte 3D 공동 문화 supernatants에 농축 하는 cytokines 중 하나 였다. 이 cytokine BrC 셀 라인의 침공에 참여 하 고 있는지 여부를 테스트 했다.

  1. BrC 75 cm2 플라스 크에 세포를 확장 합니다. MCF-7, T47D, HS578T, 및 MDA-MB-231로 설명 단계에서 1.2 (그러나 ECME 없이) 및 기본 BrC 셀 2.4 단계에서 설명한 대로.
  2. 각 폴 리 카보 네이트 8 µ m-공 막 세포 배양 세라 (사용 하는 매체는 테스트 셀 라인에 따라 달라 집니다) 없이 매체의 200 µ L로 삽입 한 번 씻어 수 화 멤브레인을.
  3. 50 µ L 찬 ECME (FBS 없이 1:4 희석 ECME:cold 매체)의 삽입을 채워, 삽입 바닥이-24-잘 빠진 문화 접시에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 유해를 ECME를 허용
  4. ECME 생산은 일단 FBS 없이 각각 셀 미디어의 180 µ L를 추가 합니다. 삽입의 가늘고 길게 찢어진 곳을 통해 FBS 없이 800 µ L 미디어를 추가 합니다. IL-8 그라데이션 설정 하 37 ° C에서 30 분 동안 품 어.
    참고: 미디어에 거품을 만들지 마십시오. 미디어 사용 하지만 FBS 없이 100 ng/mL IL-8의 chemoattractant, 또는 FBS, 부정적인 컨트롤 없이 순수한 미디어로 보충.
  5. 다음과 같이 6 x 10의 총 각 셀 라인의5 셀 얻을.
    1. Supernatants 폐기, 1 x PBS의 10 mL와 함께 한 번 헹 구 고 셀 분리를 37 ° C에서 0.05 %trypsin / 0.48 m m EDTA 2 분의 2 개 mL를 추가. 트립 신 반응을 중지 pipetting으로 적극적으로 resuspend 보충된 매체의 4 mL를 추가 합니다.
  6. 10 µ L Neubauer 챔버에 셀 셀 서 스 펜 션의 aliquot 가져가 라. 6 x 105 셀을 포함 하는 세포 현 탁 액의 볼륨을 가져가 라. RT에 5 분 동안 430 x g에서 centrifuge, 상쾌한, 삭제 하 고 셀 1 x PBS의 1 mL에 린스. 한 번 더는 린스를 반복 합니다.
  7. FBS 없이 각각 미디어의 20 µ L에서 세포와 FBS 없이 각각 미디어의 180 µ L을 포함 하는 삽입에서 resuspend. 조심 스럽게 pipetting으로 세포 현 탁 액을 균질.
  8. 습도 5%에서 37 ° C에서 48 h에 대 한 진행에 셀 침공을 허용 CO2 환경.
  9. 48 h 후 삽입을 제거 하 고 삭제는 상쾌한 린스 1 x PBS의 200 µ L로 한 번 아주 신중 하 게 삽입. 솜 밀고 주걱으로 PBS의 과잉을 제거 합니다.
    참고: 침략 적 세포 일반적으로에 연결 삽입의 다른 쪽으로이 경우에 어디 셀 부착.
  10. 1 mL를 포함 하는 24-잘 평면 바닥 문화 접시의 우물에 삽입을 배치 하 여 셀을 수정/실시간 후에 15 분 동안 4 %paraformaldehyde의 잘 씻어 1 x PBS 한번 삽입.
  11. 1 mL를 포함 하는 24-잘 평면 바닥 문화 접시/솜 밀고 주걱 제거 막의 상단에서 모든 ECME와 실시간 신중 하 게,에서 45 분 동안 0.2% 크리스탈 바이올렛으로 1 x PBS의 우물에 삽입을 배치 하 여 세포를 얼룩 마이그레이션되지 않은 셀을 포함 하 고 매우 신중 하 게 제거 하지 않으려면 증류수 린스 침략 셀 고정.
  12. 거꾸로 현미경 삽입의 하단 측면을 관찰 하 여 침입 세포를 계산. 3 임의의 필드 (100 배 확대)에서 평균 세포 수 사용 됩니다. 셀 클러스터로 침공 하 고 개별적으로 계산 하기 어려운 경우, 디지털 카메라와 함께 (100 배 확대)에서 3 임의의 필드에서 이미지를 획득. 이미지 분석 소프트웨어와 함께 이미지를 분석 하 고는 IOD를 사용 하 여 계량 셀 침공 (그림 6).

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BrC 셀 3D 문화에서의 형태소 분석:

낮은 높은 밀도에서 3D 문화에서 성장 하는 기본 BrC 셀의 형태는 5 일 동안 연구 했다. 첫 번째 48 h 동안 세포는 ECME를 준수 하 고 낮은 밀도 유지. 이 시간이 시점에서 그것은 명확 하 게 감상할 수 있습니다 세포는 길쭉한 스핀 들-모양, 명백한 셀 연락처를 표시 하지 않고 두 개 이상의 긴 세포질 예측와 일부 제시. 5 일 후 문화, 세포는 그들의 초기 형태를 유지 하면서 확산. 또한, 그들은 특정 구조 조직 없이 그물을 닮은 구조를 형성 하 고 아무 접촉 금지와 위로 쌓여 나타납니다. MCF 10A 세포 변형 비 비교는 구형 구조 선의 acini 닮은 형성 되었다. 이러한 세포 동종 크기 (약 50 µ m)의 둥근 잘 구분 및 조직 구조의 특성 형태를 표시합니다. 반대로, ...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D 공간 구조에서 상피 세포 성장 그리고 ECM 단백질의 상호 작용은 조직 항상성에 대 한. Monolayers (2D)에서 성장 하는 세포에 많은 암 연구 기반으로 되어, 비록 그들은 종양 형성 및 진행의 여러 측면을 이해 하는 데 중요 한 되어, monolayers ECM에 대 한 셀에 부과 하는 특징을 정리 하지 않습니다. 인스턴스: 확산, 접착 종속 세포 생존, 꼭대기 basolateral 극성, 개장 하는 ECM, 세포 분화, 등 제한 중요 한 것은, 뿐만 아니라 종양 세포와 ECM 사이 상호 작용은 암의 진행을 위한 필수 하지만 종양 및 비 종양 세포, 면역 세포 등 사이 통신 설립. 제공 하는 ECM에 의해 염증 반응을 이러한 상호 작용에 의해 추진 하 고이 염증 성 조건 만드는 방법 여기에 제공 된 프로토콜 환경 내에서 암 세포와 면역 세포 사이 상호 작용의 이해를 촉진 한 긍정적인 루프 monocytes의 chemoattraction과 암 세포의 더 많은 침략을 육성.

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 그들이 하지 않아도 어떤 상충 선언 합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 Fondo de Apoyo Investigación, 병원 Infantil 드 멕시코 페데리코 고메스 (프로젝트 번호 그-2014-053) 라와 CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE 프로젝트 번호 233061 Ezequiel M. 푸 엔 테 스-Pananá에 의해 지원 되었다. 프란 산체스 나 프로그램이 드 Doctorado en Ciencias Biomédicas, 대학 나시오날 Autónoma 드 멕시코 (UNAM)과 수신된 친목 231663 CONACYT에서에서 박사 학생입니다. E-S 나, 사회 보장 (IMSS)의 멕시코 연구소에서 제공 하는 금융 지원 인정.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
U937아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ATCC CRL-1593.2단핵세포주/조직구성 림프종 
THP-1아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ATCC TIB-202단핵세포주/급성 단핵구 백혈병 
MCF-10A아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ATCC CRL-10317비형질전환 유방 세포주
MCF-7미국형 배양 컬렉션 ATCC HTB-22유방암 세포주
T47D미국형 배양 컬렉션 ATCC HTB-133유방암 세포주
HS578T아메리칸 타입 배양 컬렉션 ATCC HTB-126유방암 세포주
MDA-MB-231미국형 배양 컬렉션 ATCC HTB-26유방암 세포주
RPMI 1640 중간GIBCO BRL Life Technologies11875-093
DMEM 고포도당 GIBCO BRL Life Technologies11964-0924.5 g/L 포도
DMEM/F12GIBCO BRL Life Technologies11039-021
항생제/항진균제GIBCO BRL Life Technologies15240-062100 U/mL 페니실린, 100 &마이크로; g/mL 스트렙토마이신 및 0.25 &마이크로; g/mL Fungizone
태아 소 세럼GIBCO BRL Life Technologies16000-044
말 세럼 GIBCO BRL Life Technologies16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1XGIBCO BRL Life Technologies25300-062
PBS 1X (인산염 완충 식염수GIBCO BRL Life Technologies20012-027
표피 성장 인자(EGF)PeproTechAF-100-15 (1.00mg)
인슐린SIGMA-ALDRICHI1882-100MG
하이드로코르티손SIGMA-ALDRICHH088-5G
콜레라 독소 Vibrio choleraeSIGMA-ALDRICHC8052-1MG
Matrigel Corning Inc356237Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 쥐 육종, 세포외 기질 추출물, -20°C에서 보관; 4°에서 사용할 때까지 C; C
GM-CSF페프로테크300-03
MCP-1페프로테크300-04
란테스페프로테크300-06
IL-8페프로테크200-08
IL-1&베타;PeproTech200-01B
크리스탈-바이올렛Hycel Mé xico541
파라포름알데히드SIGMA-ALDRICHP6148
트랜스웰 투과성 지지체(인서트)Corning Inc34226.5mm 직경, 8 &마이크로; M 기공 크기/24웰 플레이트 
Transwell 투과성 지지체(인서트)Thermofisher Scientific1406206.5 mm 직경, 0.4 &마이크로; M 기공 크기/24웰 플레이트 
단핵구 분리 키트 II 인간 Miltenyi Biotec130-091-153
LS 컬럼Miltenyi Biotec130-042-401
인간 사이토카인/케모카인 마그네틱 비드 패널 키트 96 웰 플레이트 분석EMD MilliporeHCYTOMAG-60K
Magpix with xPonent 소프트웨어 (레이저 기반 형광 분석 테스트 기기)Luminex Corporation40-072
Lab-Tek 챔버 슬라이드 커버 포함 (8 글쎄요)Nalge Nunc International177402
유리 바닥 마이크로웰 35mm 페트리  접시MatTek Corp.P35G-1.5-14-C
당

참고문헌

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