Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Shanmugavel Madasamy; David Liu; Jason Lundry; Benjamin Alderete; Raymond Kong; J. Paul Robinson; Alan H.B. Wu; Edward P. Amento

doi:10.3791/56596

Research Article

콜레스테롤 입자의 형태를 변조에 지질 저하 약물의 차동 효과

November 10, 2017

Shanmugavel Madasamy¹, David Liu¹, Jason Lundry¹, Benjamin Alderete², Raymond Kong², J. Paul Robinson³, Alan H.B. Wu^1,4, Edward P. Amento⁵

¹Plaxgen Inc, ²Millipore Sigma, ³Cytometry Laboratories,Purdue University, ⁴San Francisco General Hospital, 2M16 Clinical Chemistry,University of California, San Francisco, ⁵Molecular Medicine Research Institute

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Summary

이 연구의 목적은 약물 효과 콜레스테롤 입자의 형태를 변조에 지질을 낮추는 생체 외에서 평가 했다. 지질 저하 약물의 비교 콜레스테롤 입자의 형태학 적 기능 변조에 그들의 효과에서 변화를 밝혔다.

Abstract

치료 dyslipidemia 환자 지질 저하 약물의 중요 한 감소 저밀도 지 단백질 (LDL) 수준 및 플라즈마의 고밀도 지단백 (HDL) 콜레스테롤에 있는 증가의 적당 한 수준 낮은 이끌어 낸다. 그러나, 형태학 및 콜레스테롤 입자의 배포 변경에 이러한 약물의 가능한 역할 제대로 이해 된다. 여기, cytometry 이미징 함께 패 배열 메서드를 사용 하면 콜레스테롤 입자의 형태학 적 기능 변조에 지질 저하 약물 효과의 평가 체 외에서 설명 합니다. 콜레스테롤 입자의 이미지 분석 표시로 바 스타 틴, simvastatin, ezetimibe, atorvastatin 구형 및 선형 가닥 모양 입자의 형성을 유발, 피 브 레이트 류, 심, 신과 rosuvastatin 유도 하는 반면에 만 구형 모양 입자의 형성입니다. 다음, 매우 순화 된 저밀도 지 단백질 (VLDL)과이 약물과 incubated LDL 입자 변화에서에서 보여주었다 콜레스테롤의 형태학 및 이미지 텍스처 입자 모집단. 또한, 혈 청 샘플 50의 심사 dyslipidemia (18.3%의 평균)이 일치 하는 정상 (11.1%의 평균) 샘플에 비해 과목에서 선형 모양의 HDL 콜레스테롤 입자의 높은 수준의 존재를 밝혔다. 우리는 또한 선형 감소에 지질 저하 약물 효과에 상당한 변화 모양 혈 청 샘플에서 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자 형성을 관찰. 이러한 연구 결과 지질 저하 약물, 그들의 세포 중재 낮추는 효과 뿐만 아니라 행동의 비 효소 메커니즘에 의해 콜레스테롤 입자의 형태를 조절 직접 수 있습니다 나타냅니다. 이러한 결과의 결과 동맥 경화 증의 진단 정보를 최적의 지질을 낮추는 치료 예측 가능성이 있다.

Introduction

고밀도 지단백 (HDL) 콜레스테롤에 있는 증가의 온건한 수준에 저밀도 지 단백질 (LDL) 콜레스테롤의 낮은 플라스마 수준을 감소 시키는 지질 저하 약물의 효능을 증명 하는 수많은 임상 연구는 동맥 경화 관련 심장 혈관 부작용¹^,²^,³^,^,⁴⁵의 기본 및 보조 부각을 방지할 수 있습니다. 스타 틴, HMG-CoA reductase 효소 저 해제, 그룹 낮은 회전 리드 순환 혈액⁶^,⁷에서 LDL 콜레스테롤의 수준에에서 내 인 성 콜레스테롤 합성을 차단 합니다. 마찬가지로, 니코틴산의 효과 낮추는 지질 hepatocyte diacylglycerol acyltransferase-2, triglyceride 합성⁸에 관련 된 주요 간 효소의 그것의 직접 적이 고 및 회장 저해에 의해 중재 됩니다. 비교적, ezetimibe 소장⁹의 상피 세포에 위치한 Niemann 선택 C1-Like 1 (NPC1L1) 단백질에 바인딩하여 exogenous 콜레스테롤의 흡수를 제한 하 여 플라즈마 정도를 LDL 감소 시킨다. Fenofibrate, 다른 지질 저하 약물, 실질적으로 플라스마 트리 글리세라이드의 농도 감소 하 고 또한 알맞게 peroxisome proliferator 활성화 수용 체 통로¹⁰통해 LDL 콜레스테롤을 감소. 게다가, 오메가-3 지방산은 LDL¹¹의 플라즈마 저수준에 그것의 능력 때문 항 동맥 경 화성 효과를 보고.

지질 낮추는 약물 LDL 콜레스테롤을 낮추는에 그들의 기본 효과 외에 HDL 수준 향상, 내 피 기능을 개선, 염증, 및 감소 혈소판 억제를 포함 하 여 유익한 다 면 발현 성 효과의 번호가 집계¹²^,^,¹³¹⁴. 그러나, HDL 콜레스테롤 입자를 증가 하 고 그들의 구조 기능 수정에 이러한 약물의 기본 메커니즘 완전히 이해 되지 않는다. 이러한 의약품 심혈 관계 질환 동맥 경화 관련 (CVDs) 치료를 널리 처방 됩니다, 이후 더 그들의 가능한 역할에 형태학 기능 및 지질 입자의 분포 확인 조사 필수적입니다. 인간의 플라즈마 lipidome 약 600 독특한 지질과 다양 한 크기, 모양, 밀도, 및 작곡¹⁵^,¹⁶^,^{17에 있는 cholesterols의 종류 분자 22의 구성}. 울트라-원심 분리, NMR, 그라데이션 젤 전기 이동 법 등 분석 방법 LDL과 HDL 입자와 그들의 subfractions¹⁸^,¹⁹를 특성화 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 이러한 방법의 응용 형태 및 지질 입자의 변조에서 약물의 효과 결정 하기 위한 연구에 제한 됩니다. 교류 cytometer 기반된 패 배열 기능 생화학 분석 결과 검색에 대 한 개발 이며 혈 청의 지질 및 아 밀 로이드 플 라크 입자²⁰파생. 체 외에 이미징이 연구에서 설명 하는 방법의 장점은 변경 형태 및 버퍼 및 혈 청 샘플에서 콜레스테롤 입자의 분포에 지질 조절 약물 효과의 식별 가능

Protocol

1. 준비의 형광 표시 된 콜레스테롤과 지질 저하 약물

참고: 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 및 스타 틴 우리의 이전 기사에서 설명한 대로 준비 했다 ²¹. 시 약, 교류 cytometer, 화학 분석기 및 데이터 분석 소프트웨어를이 연구에 사용 된 이미지의 세부 정보에 대 한 테이블의 자료를 참조 하시기 바랍니다.

형광 표시 된 동결 건조 된 콜레스테롤을 solubilize (1mg, 전 / Em = 495 nm/507 nm) 100% 알코올의 1 mL에 가루.
2,040 x g에서 3 분을 위한 견본을 원심 고 성 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 패 배열 분석 결과에서 포함 된 supernatants 사용.
약물 준비에 대 한 개별적으로 simvastatin로 바 스타 틴, atorvastatin, ezetimibe, 및 100% 알코올의 1 ml에 오메가-3 지방산의 분말 (2 mg)를 solubilize.
2,040 x g에서 3 분 동안 원심 분리 후 사용 마약 분석 결과에 포함 된 supernatants.
마찬가지로 solubilize 개별적으로 분말 (2mg) 심, rosuvastatin, 니 아 신, 그리고 이온된 물 2 mg/mL의 재고 솔루션을 만들고의 1 mL에 fibrate.
2,040 x g에서 3 분 동안 원심 분리 후 사용 마약 패 배열 분석 결과에 포함 된 supernatants.

2. 패 배열 분석 결과 검토에 시험관 콜레스테롤 입자 형성을 위한

사용 화학 분석기-1 (재료의 표 참조) 패 배열 분석 결과 콜레스테롤 입자 형성에 대 한 설정. 둥근 바닥, 낮은 단백질 바인딩 96 잘 접시 섹션 1에서 준비 하는 시 약을 사용 하 여 분석 결과 수행 합니다. 200 µ L에서 각 잘에서 최종 반응 볼륨을 유지 하 고 3 중에 모든 분석을 수행.
1. 먼저, 부하 194.5 µ L 인산의 염 분 (PBS) 각 음을 버퍼링.
2. 각 잘 각 지질 저하 약물 솔루션의 2.5 µ L (5 µ g)를 추가 하 고 흔들어 30 접시를 균일 하 게 솔루션으로 약물을 섞어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s. 약 부정적인 컨트롤 샘플에 추가 됩니다.
3. 마지막으로, 각 음을 2 µ L (2 µ g) 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 솔루션을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
4. 2 h 37 ° C와 200 rpm에서 설정에 대 한 실험실 셰이 커에 접시를 품 어.
5. Cytometry 이미징 하 여 입자의 이미지를 수집 부 화, 후.

3. 캡처 이미지의 콜레스테롤 입자를 사용 하 여 이미징 Flow Cytometry

열기 데이터 수집 템플릿 올바른 악기 설정을 로드를. 클릭 " 파일 ", 다음 선택 " 오픈 템플릿 … " 하 고 서식 파일을 선택 합니다.
클릭 " 플러시, 잠금, 부하 " 샘플 로드에 대 한 악기를 준비 하.
때는 " 로드 샘플 " 대화 상자가 열립니다, 클릭 " 확인 " 이미징 교류 cytometer로 제 2에서 준비 각 샘플의 50 µ L 로드.
클릭 " 실행 | 설치 " 실시간에서 이미징 영역에서 입자를 볼.
이미징 영역에서 입자 좋은 초점에 있을 때 클릭 " 실행 | 취득 " 다크 필드 (사이드 분산형/SSC), 밝은 (BF), 녹색 형광와 노란색 형광에 대 한 높은 처리 방식으로 각 개체의 이미지를 동시에 취득 하.
반복 단계 각 샘플에서 5000-10000 입자를 얻으려고 3.2-3.5.
개체 형광 강도 및 형태학 상 변이 결정 하기 위한 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 모든 raw 이미지 파일을 분석.
1. 클릭는 " 도구 " 선택 후 이미지 분석 소프트웨어의 상단에 버튼 " 일괄 처리 데이터 파일 " 드롭-다운 메뉴에서을 열 것 이다는 " 배치 " 창.
2. 에 " 배치 " 창 클릭는 " 추가 배치 " 열립니다 단추는 " 일괄 처리 정의 " 창.
3. 에는 " 일괄 처리 정의 " 창 클릭는 " 파일 추가 " 버튼 및 raw 이미지 파일을 선택, 클릭는 " 서식 파일 " 버튼 적절 한 데이터 분석 템플릿 파일을 선택한 후 선택 " 확인 " 및 " 일괄 처리 제출 " 처리 및 raw 이미지 파일의 분석을 시작 하려면.

4. 배열 분석 결과 기반 평가의 지질-저하 약물 효과 플 라크 콜레스테롤 입자 정화

단계 2.1에에서 설명 된 대로 수행 콜레스테롤 입자 형성 분석 결과 정화 VLDL, LDL 및 HDL 지방 단백질/입자를 사용 하 여. 96 잘 접시에 패 배열 분석을 수행.
1. 첫째, PBS 가진 모든 우물을 로드; 200 µ L 최종 볼륨을 사용 하 여 각 잘.
부정적인 제어를 위한 4 µ g VLDL, LDL, 추가 또는 HDL 단백질/입자 각각에 개별적으로 약 없이 고 30 접시를 흔들어 s.
1. 지질 저하 약물 효과 조사, 추가 4 µ g VLDL, LDL, 또는 HDL 단백질/입자 각각을 개별적으로 잘 흔들어 30 접시 s.
2. 우물 4 µ g VLDL, LDL, 또는 HDL 추가, 2.5 µ (5 µ g) L ezetimibe로 바 스타 틴, simvastatin, 또는 니 아 신 솔루션을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1에 그것을 배치 하 여 s.
3. 마지막으로, 모든 우물을 2 µ L (2 µ g) 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 솔루션을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
37 ° C와 200 rpm에서 설정 실험실 셰이 커에 2 h에 대 한 접시를 품 어.
이미징 cytometry 다음 단계 3.1-3.5를 사용 하 여 샘플을 수집.
단계 3.7에서에서 설명한 대로 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 raw 이미지 파일을 분석.
분석 서식 파일에서 콜레스테롤 입자 모집단의 식별을 위해 다음 제어 체계 사용.
1. 녹색 채널 포화 픽셀 수 (x 축)와 어두운 필드 채널의 음모에 포화 픽셀 수 (y 축), 어느 채널에서 하나 이상의 포화 픽셀 개체 거부.
2. 녹색 채널 강도 (x 축) 및 SSC 강도 (y 축)을 사용 하 여 포화 픽셀 없이 개체/입자 플롯: 개체가 그들의 녹색 채널 및 SSC 농도에 따라 세 영역 (VLDL, LDL, HDL) 중 하나에 속합니다.
  참고: 이러한 게이츠 순화 VLDL, LDL 및 HDL 입자/단백질 약물 없이 사용 하 여 실시 하는 제어 실험에서 생성 된 데이터에 따라 만들어졌습니다.
각 샘플에 대 한 지질 저하 약물 효과 확인 하려면 계산 각 부분 모집단 (VLDL, LDL, HDL)의 비율 뿐만 아니라 총 단백 입자 농도에 설명 된 단계 6.5. 다음 수식을 사용 하 여
1. 계산 입자 농도 (입자/mL):
  
  참고:는 VLDL, LDL 및 HDL 게이팅 형광 도트-음모에서 영역 검출 ~ 그들의 각각 부분 모집단, 및 나머지의 80% ~ 20%는 입자의 다른 제어 영역 중복.

5. 혈 청 샘플에서 지질 농도의 측정

화학 분석기-2에 의해 LDL, HDL, 콜레스테롤 및 트리 글 리세 리드의 농도 결정 하는 데 사용 나이 일치 하는 정상 및 dyslipidemia 과목에서 얻은 혈 청 샘플.
LDL, HDL, 콜레스테롤, 고 중성 지방 혈 청 샘플에서 상위 및 하위 참조 값을 넘어 식별 하는 그들의 농도에 따라의 비정상적인 농도 정의.
따라 일반적인 참조 값 recommen시 약 제조 업체에 의해 공격 한: 콜레스테롤 (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), (4-100 mg/dL), LDL 및 트리 글 리세 리드 (9-200 mg/dL).
낮은 참조 값 아래 또는 더 높은 참조 콜레스테롤 및 트리 글리세라이드에 대 한 가치와 존재 및 지질 저하 약물의 부재에 심사에 대 한 그들을 사용 된 비정상적인 값 있는 혈 청 샘플 식별.

6. 혈 청 샘플에서 콜레스테롤 입자 형성에 대 한 약물의 효과 분석

사용 화학 분석기-패 배열 분석 결과 혈 청 샘플에서 콜레스테롤 입자 형성에 대 한 설정 1. 둥근 바닥, 낮은 단백질 바인딩 96 잘 접시에에서 분석 결과 수행 합니다. 최종 반응 양의 200 µ L/잘 사용 하 고 3 중에 모든 분석을 수행.
Stepwise 방식에서 시 약을 로드 하 여 접시를 준비.
1. 제어 웰 스 준비.
2. 각 잘을 PBS의 부하 193 µ L.
3. 2.5% (v/v) 환자 혈 청 (잘 당 하나의 혈 청 샘플)을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
4. 추가 2 µ L (2 µ g) 형광 표시 된 콜레스테롤의 각 음에 솔루션을 집계 및 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
약물과 웰 스 준비.
1. 각 잘을 PBS의 부하 191 µ L.
2. 2.5% (v/v) 환자 혈 청 (잘 당 하나의 혈 청 샘플)을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
3. 추가 2 µ L ezetimibe로 바 스타 틴, simvastatin 또는 니 아 신 솔루션 (4 µ g) 부정적인 제어 웰 스 제외 하 고 모든 우물. 잘 당 하나의 약물을 추가 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
4. 형광 표시 된 콜레스테롤의 추가 2 µ L 각 우물에 솔루션 (2 µ g)를 집계 하 고 30 접시를 흔들어 화학 분석기-1 반응 접시에 그것을 배치 하 여 s.
마약 모든 우물만 로드 (제어 및 약물 치료) 그들의 각각 혈 청 샘플 로드 되었습니다 및 형광 표시 된 콜레스테롤이이 단계 끝에 추가.
37 ° C와 200 rpm에서 설정 실험실 셰이 커에 2 h에 대 한 접시를 품 어.
교류 cytometer 다음 단계 3.1-3.6에서에서 설명한 설정을 이미지에 의해 샘플을 취득.
단계 3.7에서에서 설명한 대로 동일한 서식 파일을 사용 하 여 모든 이미지 파일을 처리 하는 일괄 처리에 대 한 소프트웨어를 분석 하는 이미지를 사용 하 여.
1. 4.5와 4.6 단계에 설명 된 대로 플롯 게이츠를 그려서 데이터 분석을 수행.
지질 저하 약물 효과/응답 (낮음, 중간, 및 높은) 각 샘플에 대 한 결정, VLDL, LDL과 HDL의 총 입자 구성의 비율 뿐만 아니라 총 단백 입자 농도 계산 부분 모집단.
플롯 개체의 히스토그램에 VLDL, LDL 및 HDL 인구 ' s 밝은 필드 이미지, 구형 또는 선형 영역으로 길이 (길이-폭), 그리고 게이트에서 뺀 폭: 개체 (길이-폭) ≤ 2 µ m으로가 구형 및 선형 비율 계산에 대 한 구형 영역 모양 입자.
구형 및 선형 모양의 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자와 각 약물 없이 incubated 각 혈 청 샘플에 대 한 식별의 백분율을 비교 합니다. 각 혈 청 샘플에 대 한 가져온 triplicate 값, 중 동의 구형 및 선형 비율 LDL과 HDL 입자는 약물 효과의 결정에 대 한 SD ± 2 범위 내에 속하는 모양.

Representative Results

패 배열 분석 결과 콜레스테롤 입자 형성에 지질-저하 약물 효과의 분석을 기반으로:

콜레스테롤 입자의 형태를 변조에서 스타 틴의 효과 평가, 형광 표시 된 콜레스테롤 집계로 바 스타 틴와 simvastatin, atorvastatin, rosuvastatin, 버퍼에 심 incubated 개별적으로 했다. 이러한 모든 샘플 이미징 cytometry 그림 1 과 그림 2에서 같이 형태 분석 콜레스테롤 입자의 이미지를 사용 하 여 인수 했다. 흥미롭게도,로 바 스타 틴, simvastatin, 및 틴이 콜레스테롤 입자 다양 한 크기와 모양, 표시의 이질적인 인구의 형성 유도 표시 버퍼에 콜레스테롤 입자 형성에 약물 효과 분석 그림 3a -c. 반대로, rosuvastatin, 심, 존재 콜레스테롤 입자 형성 하 고 (마약) 없이 부정적인 컨트롤 모양 및 형태학 그림 3d-f와 같이 균질 했다. 또한, 그것은 그로 바 스타 틴, simvastatin, atorvastatin 유도 콜레스테롤 입자 모두 구형 및 선형 가닥 형태학, 전시의 형성 rosuvastatin과 심 콜레스테롤의 형성을 유도 하는 반면 관찰 되었다 만 구형 형태를 입자입니다. 선형 가닥 형성 유도에 스타 틴 효과 바 스타 틴에 대 한 16%, simvastatin, 2%, 0.2% 틴이 순서 발견 되었다.

더 입자 형성에 지질 저하 약물의 효과 평가 하려면 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 했다 개별적으로 인 큐베이 팅 ezetimibe, fibrate, 함께 신과 오메가-3 지방산. 스타 틴과 관찰이 약 유형이 다른 크기 및 모양 그림 4a-d에 표시 된 콜레스테롤 입자의 형성을 유도 한다. 그 중, ezetimibe 형성 유도 모두 구형 및 선형 가닥 형태학을 전시 하는 반면 콜레스테롤 입자의 fibrate, 니 아 신, 그리고 오메가-3 지방산 유도 구형 모양의 콜레스테롤 입자의 형성. 따라서 콜레스테롤 입자 형성 모양의 선형 가닥에 약물의 효과 ezetimibe, 0% 대 3% 순서는 fibrate, 오메가-3 지방산에 대 한 0%와 니 아 신, 0%.

형태소 분석 각 모양의 구형 또는 선형 가닥 콜레스테롤 입자 서로 연결 된 많은 작은 입자의 구성 되어 있습니다 밝혔다. 식별 하는 형광 긍정적인 구형 콜레스테롤 입자의 크기 ~ 2-60 µ m2의 범위에서 선형 모양된 입자의 크기는 2 ~ 30 µ m2의 범위에 있습니다.

순화 VLDL과 LDL 입자에 지질 저하 약물의 효과 분석:

더 지 단백질의 존재 콜레스테롤 입자 형성 검사, 형광 표시 된 콜레스테롤 집계 했다 개별적으로 알을 품을 순화 VLDL, LDL 및 HDL 단백질/입자. LDL과 HDL 입자, 콜레스테롤 집계 incubated VLDL 단백질 콜레스테롤 입자, 그림 5의 더 높은 수의 형성 발생과 부 화에 비해 결과 나타났다. 또한, 콜레스테롤 입자의 두 주요 분수 콜레스테롤 형광 표시 된 집계를 가진 외피 동안 LDL 분수에 그들의 부분적인 변화를 제안 하는 VLDL 인구에서 관찰 되었다. 입자의 이미지 분석 구형 (~ 97%)과 VLDL, LDL 및 HDL 인구 가운데 선형 모양된 (3%) 입자의 존재를 표시. 구형 입자의 크기 범위는 2 ~ 30 µ m2, 반면 선형 입자 크기 범위는 2 ~ 60 µ m2.

순화 된 입자의 지질-저하 약물 효과 조사, VLDL과 LDL 입자 ezetimibe로 바 스타 틴, simvastatin와 니 아 신 incubated 개별적으로 했다. 그 결과, 약물 없이 제어 실험에 비해 VLDL 입자 형성에 관찰 약물 효과가 높았다 ezetimibe, simvastatin로 바 스타 틴, 니 아 신에서. LDL 입자 약물 incubated 주요 단일 분수 그리고 입자 형성에 약물 유발 영향 ezetimibe, simvastatin로 바 스타 틴, 니 아 신, 그림 6에서 높았다.

혈 청 샘플에서 콜레스테롤 입자의 분포를 변경에 지질 저하 약물 효과의 변화:

위의 실험 약물 효과 평가 하기 위한 순화 된 단백질의 버퍼 솔루션에서 수행 했다. 따라서, 다음 단계에서 콜레스테롤 입자 형성에 지질 저하 약물의 효과 dyslipidemia 25 과목 및 25 나이 일치 하는 정상적인 과목에서 수집 된 50 혈 청 샘플을 사용 하 여 시험 되었다. 각 혈 청 샘플에서 마약 응답 존재 및 약물의 부재에 콜레스테롤 입자 형성의 프로필에 변화에 따라 측정 되었다. 패 배열 분석 결과에서 각 혈 청 샘플 ezetimibe로 바 스타 틴, 니 아 신 약물 simvastatin, 및에 대 한 상영 되었다. 결과 이러한 약물 중 변조 LDL을 줄이고 HDL 콜레스테롤 입자 형성을 증가에 미치는 영향에 특히 혈 청 샘플, VLDL, LDL 및 HDL 입자의 분포에 차이가 나타났다. 지질 저하 약물에 대 한 독특한 응답 전시 dyslipidemia 혈 청 샘플의 3 명의 대표자는 그림 7에 표시 됩니다.

혈 청의 변조 형태에 약물 효과의 식별에는 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자 파생 된:

혈 청에서 파생 된 콜레스테롤 입자의 표현 형 분석 선형 영역과 구형 모양의 VLDL, LDL, 모두의 존재 그리고 HDL 모집단, 유사한 형태학 실험에서 확인 된 확인 모두는 버퍼에서 수행 하 고 와 그림 8과 같이 순화 된 지 단백질 입자. 그러나, 구형 및 선형 모양의 콜레스테롤 입자 모집단의 분포는 널리 dyslipidemia와 일치 하는 나이 정상적인 과목 다양합니다. 특히, 약물 없이 수행 제어 분석 선형 가닥의 분포에 차이가 모양의 LDL 콜레스테롤 입자 dyslipidemia (2.0%의 평균) 및 나이 일치 하는 정상 (1.3%의 평균) 사이의 혈 청 샘플을 보여주었다. 마찬가지로, HDL 콜레스테롤 입자 모양의 선형 가닥의 증가 수준 나이 일치에 비해 dyslipidemia 샘플 (18.3%의 평균)에서 관찰 되었다 (11.1%의 평균) 혈 청 샘플. 상관 관계, dyslipidemia 혈 청 샘플 선형 모양의 HDL 콜레스테롤 입자 형성 simvastatin (8.3%의 평균), ezetimibe (11.5%의 평균),로 바 스타 틴 (11.7%의 평균)에 상당한 감소를 보여주었다에 약물의 존재는 분석 실험 수행 그리고 니코틴산 (18.3%의 평균)에 대 한 감소. 또한, 선형 모양의 LDL 콜레스테롤 입자의 형성에 있는 감소는 dyslipidemia 혈 청 샘플 표 1에 표시 된 약물으로 알을 품을 때에 관찰 되었다.

나이 일치 하는 컨트롤 세럼 samp에 약물의 존재는 분석 수행 하는 또한,레는 simvastatin (5.0%의 평균), ezetimibe (평균 8.2%)로 바 스타 틴 (평균 8.7%), 및 표 2에 표시로 니코틴산 (평균 10.8%)에 HDL 콜레스테롤 입자 모양의 선형에 상당한 감소를 보여주었다. Dyslipidemia와 나이 일치 하는 정상 혈 청 약물 유발 감소 선형 모양의 LDL과 HDL 콜레스테롤 입자 구형 모양의 콜레스테롤 입자 (데이터 표시 되지 않음) 상대 높아졌습니다 전시 샘플링 합니다.

그림 1: 콜레스테롤 입자 형태학의 생체 외에서 시각화 하는 과정을 보여주는 다이어그램. (a, b) 버퍼 또는 혈 청 샘플에서 지질 저하 약물의 추가. (c) 형광 표시 된 수용 성 콜레스테롤의 추가 샘플을 집계합니다. (d) 이미징 cytometry 사용 하 여 불용 성 콜레스테롤 입자의 형태소 분석에 대 한 결과 샘플을 취득. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 콜레스테롤 입자 이미징 cytometry 사용의 두 가지 형태학의. (a) 입자는 밝은 필드 이미지의 텍스처 분석 기반 선형 또는 구형 인구에 차별 있다 특히, 의미 H 동질성 (x 축)과 의미 H 엔트로피 (y 축)의 도트 플롯 영역이 두 문이 구형 (빨간색)을 탐지 하기 위한 고 선형 스트랜드 (파란색) 콜레스테롤 입자 모양. (b) 이미지 인구 1에서에서 확인 된 구형 모양의 입자의 형태를 표시 합니다. (c) 선형 가닥의 이미지 입자 인구 2에서에서 확인 된 모양. (d) 그들의 집중력과 모집단을 결정 하는 데 사용 하는 모든 형광 긍정적인 콜레스테롤 입자의 분포를 표시 하는 히스토그램. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 콜레스테롤 입자 형성을 변조에서 스타 틴의 효과 표시 하는 갤러리 이미지. 밝은 필드 기존의 교류 cytometer FSC와 비슷한 영역을 말합니다. 녹색 채널 형광 방출 505-560 nm에서 발견을 말합니다 그리고 노란색 채널 형광 방출 560-595 nm에서 발견. (a-e) 콜레스테롤 입자의 형태를 표시 하는 이미지 갤러리 존재로 바 스타 틴, simvastatin, atorvastatin, rosuvastatin, 그리고 심, 각각 형성. (f) 스타 틴 (부정적인 제어)의 부재에 콜레스테롤 입자 형성. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 차동 변조 콜레스테롤 입자 형성에 지질 저하 약물 효과 보여주는. (-d) 콜레스테롤 입자의 형태를 표시 하는 이미지 갤러리 각각 ezetimibe, 니 아 신, fibrate, 그리고 오메가-3 지방산의 존재 형성. 녹색 채널 형광 방출 505-560 nm에서 발견을 말합니다 그리고 노란색 채널 형광 방출 560-595 nm에서 발견. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: VLDL, LDL 및 HDL 콜레스테롤 입자의 대형의 부재에서 마약 분석. 도트-그래프: x 축 표시 녹색 형광 채널 (505-560 nm)에서 감지 콜레스테롤 입자의 스펙트럼 하 고 y 축 표시 측면 분산형. 게이팅 형광 도트-플롯에서 감지 하는 VLDL, LDL 및 HDL 입자의 영역을 보여 줍니다. (한) 존재 정화 VLDL 콜레스테롤 입자 형성. VLDL 입자의 (b) 대표 이미지. (c) 순화 된 LDL의 콜레스테롤 입자 형성. LDL 입자의 (d) 대표 이미지. (e) 순화 된 HDL의 존재 콜레스테롤 입자 형성. HDL 입자의 (f) 대표 이미지. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6: 지질에 낮추는 약물의 효과 보여주는 VLDL과 LDL 콜레스테롤 입자 정화. 약물 없이 (한) VLDL 입자. (b) VLDL 입자 ezetimibe와 인 큐베이 팅. (c) VLDL 입자로 바 스타 틴으로 인 큐베이 팅. (d) VLDL 입자 simvastatin으로 인 큐베이 팅. (e) VLDL 입자 니 아 신으로 인 큐베이 팅. (f) LDL 입자는 약물 없이 알을 품을. (g) LDL 입자 ezetimibe와 인 큐베이 팅. (h) LDL 입자는로 바 스타 틴으로 인 큐베이 팅. (나) LDL 입자 simvastatin으로 인 큐베이 팅. (j) LDL 입자는 니코틴산과 인 큐베이 팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 7: 형광 도트-플롯 지질 낮추는 약물 혈 청 샘플의 VLDL, LDL 및 HDL 콜레스테롤 입자 형성을 변조에서 차동 효과 보여주는. 맨 위 행, 세럼 1 표시 낮은 수준의 마약 응답 증가 15 %HDL 입자 형성; 0의 심사 가운데 행, 증가 50 %HDL 입자; 16에 세럼 2 보여주는 적당 한 수준의 약물 응답의 심사 맨 아래 행, 세럼 3 표시 51 100 %HDL 입자에 증가에 높은 수준의 약물 응답의 심사. (a, f, k) 약 없이 혈 청 샘플. (b, g, l) 혈 청 샘플 ezetimibe와 인 큐베이 팅. (c, h, m) 혈 청 샘플으로 바 스타 틴으로 인 큐베이 팅. (d, i, n) 혈 청 샘플 simvastatin으로 인 큐베이 팅. (e, j, o) 혈 청 샘플 니코틴산과 인 큐베이 팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 8: 혈 청에서 확인 된 콜레스테롤 입자의 형태를 표시 하는 이미지 갤러리 샘플 1. 녹색 채널이 보여줍니다; 입자에서 형광 방출의 이미지 사이드 분산형 (녹청 채널) 보여줍니다 여기 레이저의 빛은 입자에 의해 흩어져. (한) 구형 및 선형 모양의 콜레스테롤 입자는 약물 없이 형성. (b, c, d, e) 콜레스테롤 입자 각각 ezetimibe로 바 스타 틴, simvastatin와 니 아 신의 형성. 스케일 바= 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

혈 청 ID	약물 (통제) 없이	Ezetimibe와	로 바 스타 틴과	Simvastatin으로	니 아 신으로
	% 선형, LDL 입자	% 선형, HDL 입자	% 선형, LDL 입자	% 선형, HDL 입자	% 선형, LDL 입자	% 선형, HDL 입자	% 선형, LDL 입자	% 선형, HDL 입자	% 선형, LDL 입자	% 선형, HDL 입자
PNDS-01	1.73	45.2	0.81	18.1	0.61	16.1	0.59	13.9	2.26	33.6
PNDS-02	2.86	35.9	1.26	30.9	1.27	22.7	0.73	15.2	3.03	37.7
PNDS-03	2.04	35.8	0.87	4.82	1.02	4.14	0.36	3.06	0.45	9.57
PNDS-04	2.56	32.9	1.15	21.8	1.12	18.6	0.77	17.2	3.37	36.5
PNDS-05	0.42	29.2	0.24	5.62	0.22	8.72	0.16	9.91	0.35	22.2
PNDS-06	1.8	28.1	0.4	16.8	0.62	15	0.42	9.27	2.28	38.4
PNDS-07	1.8	26.5	0.85	10.5	1.18	19.9	0.62	7.32	1.29	23.4
PNDS-08	0.98	22.8	0.86	7.28	1.55	10.2	0.14	5.98	0.59	13.3
PNDS-09	3.87	22.1	1.98	9.56	1.87	10.3	1.46	7.96	2.86	9.88
PNDS-10	4.46	21.9	2.57	13.6	4.04	17.1	2.28	11.9	0.71	25.7
PNDS-11	1.57	19.2	1.15	9.24	1.37	6.98	0.74	5.03	1.37	16
PNDS-12	1.06	16.7	0.66	4.38	0.7	4.74	0.99	6.36	1.14	4.73
PNDS-13	4.85	16.6	1.28	30.4	1.4	32.6	0.8	16.6	4.02	31
PNDS-14	2.08	16	0.68	15.4	0.64	16.5	1.97	10.2	1.25	20.11
PNDS-15	1.5	11.9	1.14	13.3	1.21	11.4	0.8	6.12	1.38	4.59
PNDS-16	1.82	10.4	2.04	9.59	1.24	5.62	0.91	5.38	1.31	7.61
PNDS-17	1.05	10.3	1.02	4.7	1.78	15.1	0.93	7.81	1.27	13
PNDS-18	1.11	8.76	0.54	3.68	0.61	3.51	1.01	5.03	1.02	6.69
PNDS-19	1	8.52	0.75	6.67	0.76	5.86	0.91	8.36	1.22	11.9
PNDS-20	3.54	7.92	3.78	12	3.56	5.81	3.28	8.28	3.44	12.3
PNDS-21	1.88	7.69	2.12	11.4	1.73	9.54	1.77	8.34	2.32	16.7
PNDS-22	1.64	7.17	0.35	5.75	0.56	13.2	0.14	4.33	1.23	17.8
PNDS-23	1.54	6.27	1.25	7.24	1.02	6.12	0.73	3.58	1.42	6.69
PNDS-24	0.53	6.22	0.52	4.49	0.91	5.57	0.54	4.01	0.65	10.5
PNDS-25	2.97	5.1	1.59	11	1.88	9	1.03	6.54	2.61	29.1

표 1: dyslipidemia의 상영 패 배열 분석 결과에서 혈 청 샘플 보여 지질 저하 약물의 차동 효과. 약물 (열 2, 3) 없이 컨트롤에 비해, 혈 청 샘플 incubated ezetimibe (열 4, 5)로 바 스타 틴 (열 6, 7), 함께 simvastatin (열 8, 9), 고 선형 모양 LDL과 HDL 콜레스테롤 유도에 보여준 니코틴산 (열 10, 11) 입자 형성입니다.

혈 청 ID	마약 없이	Ezetimibe와	로 바 스타 틴과	Simvastatin으로	니 아 신으로
	% 선형, LDL 입자	% 선형, HDL 입자	% 선형, LDL 입자	% 선형, HDL 입자	% 선형, LDL 입자	% 선형, HDL 입자	% 선형, LDL 입자	% 선형, HDL 입자	% 선형, LDL 입자	% 선형, HDL 입자
PNAN-01	2.05	26.8	0.62	11.9	0.56	16.9	0.52	9.28	1.4	11.9
PNAN-02	1.35	26.3	1.68	21.8	2.59	23.6	0.79	6.92	2.16	29.7
PNAN-03	2.4

24.9 0.53 7.54 0.57 13.8 0.55 5.82 1.7 4.71 PNAN-04 1.99 21.5 1.54 9.45 1.56 8.25 0.31 3.74 2.88 20.8 PNAN-05 1.77 18.8 1.49 6.03 1.65 5.5 0.54 4.67 1.2 8.19 PNAN-06 1.12 15.2 0.67 4.42 2.68 13.3 0.5 2.37 1.54 16.3 PNAN-07 1.03 14.4 0.79 6.83 1.45 7.91 0.67 5.36 1.57 12 PNAN-08 0.98 14.3 0.88 4.48 2 7.1 0.19 2.66 1.02 18.1 PNAN-09 2.85 14.1 1.95 12.6 2.34 12.5 0.7 6.24 1.84 18.7 PNAN10 1.01 10.4 0.8 5.07 0.51 5.9 0.87 6.5 1.63 10.9 PNAN-11 0.92 12.4 0.21 9.94 0.29 3.31 0.29 6.52 0.58 10.4 PNAN-12 0.6 10.5 0.56 5.78 1.06 4.74 0.4 3.32 0.91 11.8 PNAN-13 1.25 10.3 0.45 3.79 0.67 6.53 0.27 3.17 0.8 6.28 PNAN-14 1.03 9.86 1.12 8.51 1.05 6.91 0.6 5.94 1.05 8.14 PNAN-15 2.28 8.1 1.93 10.4 2.14 8.86 1.56 6.84 2.31 8.61 PNAN-16 1.98 7.69 0.45 4.36 1 5.46 0.27 2.89 0.49 4.12 PNAN-17 1.72 6.72 0.75 14.8 0.74 9.26 0.49 5.58 1.98 12.8 PNAN-18 2.45 6.38 0.85 16.8 0.89 14.2 0.58 5.9 1.8 20.6 PNAN-19 1.67 5.12 0.58 8.63 0.65 5.7 0.64 8.8 1.88 2.08 PNAN-20 1.17 4.41 0.85 7.77 0.91 6.43 0.69 5.08 1.21 6.12 PNAN-21 0.31 4.18 0.48 6.95 0.19 5.09 0.15 2.1 0.29 5.93 PNAN-22 0.77 4.02 1.24 7.41 0.61 5.02 0.29 3.49 0.42 3.98 PNAN-23 0.4 1.25 0.75 6.25 0.88 5.91 0.9 5.06 0.82 6.71 PNAN-24 0.45 1.1 0.63 2.5 0.55 5.32 0.9 4.3 0.71 3.5 PNAN-25 0.36 1 0.73 2.4 0.66 5.1 0.82 4 0.7 3.4

표 2: 패 배열 분석 결과에서 나이 일치 하는 제어 혈 청 샘플의 지질 저하 약물의 차동 효과 보여. 약물 (열 2, 3) 없이 컨트롤에 비해, 혈 청 샘플 incubated ezetimibe (열 4, 5)로 바 스타 틴 (열 6, 7), 함께 simvastatin (열 8, 9), 고 선형 모양 LDL과 HDL 콜레스테롤 유도에 보여준 니코틴산 (열 10, 11) 입자 형성입니다.

Discussion

박사 Madasamy Plaxgen, Inc에서 보조금 지원을 받고 있으며 경쟁 금융 관심 있습니다. 다른 작성자 공개 경쟁 금융 관심 없습니다 있어야 합니다.

Disclosures

Acknowledgements

이 작품은 Plaxgen의 연구에 의해 투자 되었다 SM (PLX-1008)에 게 수 여 하는 그랜트. 우리는 IRB 승인 아래 동맥 경화 과목에서 혈 청 샘플을 수집 하기 위해 팔로 알토 의학 연구 재단 연구소를 감사 합니다.

Materials

TopFluor 형광 콜레스테롤	Avanti Polar 지질은	100 &마이크로를 저장합니다. l -20에서 부분 표본 ° C
simvastatin (pro-drug)	Cayman Chemicals	store 100 µ l -20에서 부분 표본 ° C
lovastatin (pro-drug)	Cayman Chemicals	store 100 µ l -20에서 부분 표본 ° C
rosuvastatin	Cayman Chemicals	store 100 µ l -20에서 부분 표본 ° C
아토르바스타틴	케이맨 화학 물질	저장 100 &마이크로; l -20에서 부분 표본 ° C
플루바스타틴	케이맨 화학 물질	저장 100 &마이크로; l -20에서 부분 표본 ° C
ezetimibe (프로 마약)	케이맨 화학 물질	상점 100 µ l -20에서 부분 표본 ° C
Niacin	MilliporeSigma	스토어 100 &마이크로; l -20에서 부분 표본 ° C
피브레이트	MilliporeSigma	스토어 100 &마이크로; l -20에서 부분 표본 ° C
오메가-3 지방산	MilliporeSigma	store 100 &마이크로; l -20에서 부분 표본 ° C
정제 VLDL 단백질/입자	Lee Bio
정제 LDL 단백질/입자	Lee Bio
정제 HDL 단백질/입자	Lee Bio
Human 연령 일치 혈청	Dx Biosamples
인간 죽상경화증 혈청	Bioserve
인간 정상 혈청	Stanford 혈액 센터
LDL 측정 시약 팩	Roche Diangostics
HDL 측정 시약 팩	Roche Diangostics
총 콜레스테롤 측정	Roche Diangostics
96웰 마이크로타이터 플레이트
트리글리세리드 측정	Roche Diangostics
Amnis 이미징 유세포 분석기	Amnis Inc
IDEAS 이미지 분석 소프트웨어	Amnis Inc
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902	Awarness Technology
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400	Roche Diangostics

References

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