Method Article

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

DOI:

10.3791/56600

⸱

December 21st, 2017

 ,  , 
1Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

In This Article

Summary

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이 원고 붙일 표시 된 DNA 프로브, 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 개별 메신저 RNA (mRNA) 성적표를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH 동시 탐지, 지역화, 고 고정된 개별 셀에 단일 mRNA 분자의 정량화를 허용 하는 시각화 방법입니다.

Abstract

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고정된 박테리아 대장균에 있는 단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 (smFISH) 실험에 사용 하기 위해 성적 증명서 개별 메신저 RNA (mRNA)를 라벨에 대 한 방법을 설명 합니다. smFISH는 성적 증명서의 subcellular 위치 뿐 아니라 관심의 유전자의 mRNA 사본 수에 셀 다양성의 측정을 허용 한다. 주요 단계는 세균성 세포 배양의 고정, 세포 막의 permeabilization 및 상업적으로 사용 가능한 짧은 붙일 레이블 oligonucleotide 조사 세트와 함께 대상 증명서의 교 잡. smFISH는 다른 형광 마커 사이의 스펙트럼 중복에 의해 부과 된 제한 같은 셀에 여러 유전자의 성적 이미지를 허용할 수 있습니다. 아래 설명 하는 프로토콜의 완료, 다음 셀 수 있을 쉽게 몇 군데 낮은 강도의 형광을 위해 적당 한 카메라와 함께 결합 하는 현미경을 사용 하 여. 셀 윤곽선 세분화 단계 대비 프레임, 또는 세포 막 얼룩에서 함께 이러한 이미지 오픈 소스 또는 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 셀의 샘플의 mRNA 사본 숫자 분포의 계산을 허용 한다. 여기 설명 하는 표기 방법은 확률적 광학 재건 현미경 (스톰)와 성적 증명서 이미지에 적용할 수 있습니다.

Introduction

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Stochasticity는 유전자 발현의 근본적이 고 피할 수 없는 측면 이며 셀 셀이1, 성적 및 단백질2,3의 수준에서 모두 증가 제공 합니다. 잘 정의 된 조건 하에서 세포 사이 가변성을 측정 독특한 창 유전자 발현 및 그것의 규칙의 기반이 되는 기본 프로세스에 제공 합니다. 셀이 박테리아에의 한 중요 한 소스는 transcriptional 수준에서 일어난다. 사본 숫자 규정 등 post-transcriptional 프로세스 뿐만 아니라 전사의 stochasticity 때문에 뿐만 아니라 작은 RNAs 및 RNAases2마다 다릅니다. 양적 패션에서이 성분에 직접 액세스 하는 한 가지 방법은 붙일 smFISH에 주어진된 유전자의 개별 성적표를 태그입니다. 이 방법론 검색 및 특정 RNA 분자의 subcellular 지 방화, 개별 박테리아 세포4고정 수 있습니다. mRNAs는 붙일 표시 된 관심5,6의 성적표에 선택적으로 바인딩할 디자인 된 ~ 20 자....

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Protocol

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1. 조사 설계

참고:이 프로토콜 이미 fluorophores 태그로 상용 oligonucleotide 프로브를 사용 합니다. 프로브는 특정 시퀀스를 대상으로 보완 집합의 구성 mRNA, 단 하나 형광 성 분자를 활용 되 고 각 프로브. 또는,5,16설명 되어 있는 대로 프로브를 형광 마커를 연결 가능 하다.

  1. 디자인 smFISH 프로브 Arjun Raj (밴 Oudenaarden 연구소, 매사 추세 츠 공대);에 의해 개발 된 프로브 디자이너16 알고리즘을 사용 하 시퀀스 smFISH 프로브이 원고에 사용 되는 재료의 테이블에 나열 됩니다.
    참고: 최소 감지 신호에 대 한 집합에 프로브 수 ~ 30입니다. 정확한 숫자는 매우 짧은 성적 측정 하는 경우에 특히 관심의 유전자에 따라 달라질 수 있습니다.
  2. 광 설치에 맞는 염료를 선택 (재료의 표 참조).
    참고: Cy3 염료 또는 사진 표백 낮은 민감도와 광학 동일한 염료가 좋습니다. 듀얼 라벨에 대 한 후보는 Cy5 또는 광학 동일한 염료 (재료의 표 참조). 레이블이 지정 된 mRNA의 폭풍 이미징에....

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Results

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우리는 대장균 세포에 galK 및 sodB 내용은의 smFISH 측정에 실시 한다. 녹취 록은 특정 시퀀스 단 하나 형광 성 분자를 활용 되 고 각 조사 대상 시퀀스를 보완의 세트로 때 교배 (재료의 표 참조). 형광 및 위상 대비 MG1655 야생-타입의 이미지 E. 콜라이 긴장 (WT) 또는 JW0740 (게이오 컬렉션)19 galK 삭제 긴장 (ΔgalK) 2 m m D-fucose 그림 1A 및 1B에 표시 됩니다에 노출 됐다. 셀 D-fucose에 노출 후 적어도 3 시간을 고정 했다. 그림 1A (위)에 패널 표시 한 프레임에 해당 하는 셀 윤곽에 있는 초점, 가변 extracellular D-fucose 농도에 대 한 응답 g.......

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Discussion

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우리 smFISH 방법2를 사용 하 여 대장균 세포에 다른 유전자의 사본 수 우리의 실험실에서 측정 했습니다. 간단히,이 절차는 다음 단계로 구성 됩니다: 셀 고정, 프로브 삽입을 허용 하는 세포 막의 permeabilization 교 잡, 프로브 및 영상 표준 형광 현미경을 사용 하 여 샘플. 이 절차는 일부 수정6,,716게시 했던 것 들을 기반으로 합니다. 그것은 이전 알려졌다 그 smFISH 필요 oligonucleotide 프로브 수 신호 배경7이상 거짓말을 달성 하기 위하여 범위 48-72에에서 거짓말. 우리는이 수 실제로 작은20, 유전자 시퀀스의 관심, 광학 설치, 및 특정 실험 조건에 따라 있을 수 있습니.......

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Disclosures

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저자는 공개 없다.

Acknowledgements

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이 작품은 이스라엘 과학 재단 부여 514415 (대표)와 BSF NSF (MCB) 그랜트 2016707 (대표)에 의해 지원 되었다. 지 그 프 리드와 Irma Ullman 교수의 자 (제) 또한 인정에서 지원 합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
덱스트란 황산염 나트륨 염Sigma-AldrichD8906
순수 에탄올, 99.5%, ACS 시약, 절대Mallinckrodt Baker - Avantor8025.25
Diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma-AldrichD5758
RNase-free 20X SSCLife Technologies/AmbionAM9763
RNase-free 10X PBSLife Technologies/AmbionAM9625
TE 완충액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, 분자생물학용Sigma-Aldrich93283
뉴클레아제가 없는 물Thermo Fisher Scientific10977035
분자생물학용 포름알데히드 용액, 물 중 36.5-38%Sigma-AldrichF8775
탈이온화 포름아미드, 뉴클레아제 무함유Thermo Fisher Scientific/AmbionAM9342
E. coli tRNA (리보 핵산, 대장균에서 전달 유형 xx)Sigma-AldrichR1753-500UN
UltraPure BSA (50mg / ml)Thermo Fisher Scientific / AmbionAM2616
Vanadyl-ribonucleoside complex, VRC, 200 mMNew England BiolabS1402S
폴리 -L- 라이신시그마P4707
시스테아민 및 산소Sigma-Aldrich30070
Aspergillus niger의 포도당 산화효소, 유형 VII, 50KUSigma-AldrichG2133
카탈라아제Sigma-AldrichC40
D-포도당Sigma-AldrichG8270
D-fucoseSigma-AldrichF8150
Vybrant DiO 세포 라벨링 솔루션수명 TechnologiesV2286
Agarose, 저융점 시약Sigma-AldrichA9414
접착 실리콘 절연체 24-2mm 직경 X 1.8mm 깊이 JTR24R-A2-2.0Grace Bio-LabsJTR24R-A2-2.0 666208
poly-D-lysine 코팅 유리 바닥 유리 바닥 배양 접시MatTek CorporationP35GC-1.5-14-C
슈퍼 라이프 니트릴 파우더 무료 검사 장갑SupermaxTC-N-9889
브랜드 살균 인큐베이터 테이프Sigma-AldrichBR61750
마이크로 원심 분리기 튜브 (1.8 ml)Axygen - Corning Life SciencesMCT-175C
Falcon 둥근 바닥 폴리 프로필렌 튜브 (14 ml)BD Biosciences352059
원뿔형 바닥 원심 분리기 폴리 프로필렌 튜브 (50 ml)Corning430828
혈청학 피펫 (Corning 5 ml)Corning Life Sciences4051
혈청학 피펫 (Corning 10 ml)Corning Life Sciences4488
혈청학 피펫 (Corning 25 ml)Corning Life Sciences4251
분광광도계 큐벳Sarstedt67.742
RNase-free 피펫 팁 0.2 - 20 μ lFroggaBioFT20
RNase-free 피펫 팁 10 - 200 μ lAxigene / corningTF-200
RNase-free 피펫 팁 100 - 1000 μ lFroggaBioFT1000
RNase-free 피펫 팁 100 - 1000 μ lSorenson14200
주사기 일회용 10 mL 바늘 G-21Becton Dickinson, BiosciencesBD-309643
Minisart 0.2 um 주사기 필터Sartorius16534 K
Nikon 기기 현미경 유형 A 침지 오일 A, 8ccNikonMXA20233
현미경 슬라이드 76 x26, 3"x1"x1mmThermo Fisher Scientific421-004ET#
0 커버슬립 슬라이드 24x60Thermo Fisher Scientific/MenzelBNBB024060A0
Orbital shakerM.R.CTOU-50
핫 블록M.R.C
VortexFried Electric CompanyG-560-E
마이크로 원심분리기Eppendorf5427R
원심분리기Eppendorf5810R
휴대용 피펫 보조 XP2, 피펫 컨트롤러Drummond Scientific Company4-000-501-I
OD600 세균 성장 속도용 분광 광도계 DiluPhotometerMidsciOD600-10
ixon X3 EMCCD 카메라AndorDU-897E-CS0-#BV
Eclipse Ti 현미경NikonMEA53100
CFI 계획 apochromat DM 100X 기름 목적 lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13NikonMRD31905
필터 세트 (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LPNikon49005
필터 세트(CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660PNikon49009
Nis-elements AR 자동 해상도 소프트웨어NikonMQS31000
STORM 현미경VutaraSR-200
NA 1.2 침수 objective Olympus
SRX 이미지 수집 및 분석 소프트웨어Vutara
Evolve 512 EMCCD 카메라광도계
스텔라리스® FISH 프로브, CAL Fluor®를 사용한 맞춤형 분석; 빨간색 590 염료Biosearch Technologies IncSMF-1083-5
GalK mRNA에 대한 프로브 서열:
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Stellaris® FISH 프로브, Quaser Fluor®를 사용한 맞춤형 분석; 빨간색 670 염료Biosearch Technologies IncSMF-1083-5
Probe Sequence for sodB mRNA:
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References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
  2. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14)....

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Single molecule FISHE coli mRNA labelingvisualizationFluorescent oligonucleotide probesBacterial cell fixationPermeabilization protocolHybridization bufferAgarose gel mountingFluorescence microscopySTORM imaging

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