액체 먹이 곤충 다공성 표면에서 액체의 분 양 취득 하는 기능이 있다. 이 프로토콜에는 직접 먹이 솔루션을 사용 하 여 형광, 자성 나노 입자와 다공성 표면에서 액체를 섭취 하는 곤충에 대 한 능력을 결정 하는 방법을 설명 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
액체 먹이 곤충 섭취 다양 한 환경에 풀, 필름로 또는 작은 구멍에 액체. 액체 수집의 연구 필요 평가 놓이고 구조와 함수 관계; 그러나, 액체 흡수 메커니즘 구조 건축, 실험적인 증거와 때때로 동반된의 관측에서 역사적으로 유추 됩니다. 여기, 우리 보고 나비 (나비목)와 비행 거리 (Diptera) 액체의 소량을 사용 하 여 액체 이해 능력을 평가 하기 위한 새로운 방법. 곤충은 20% 자당 해결책 특정 기 공 크기의 필터 논문에서 형광, 자성 나노 입자와 혼합으로 먹인 다. 자르기 (유체를 저장 하는 데 사용 되는 내부 구조)는 곤충에서 제거 하 고는 confocal 현미경에 배치. 자석이 곤충 체액을 섭취 수 있습니다 나타내는 나노 입자의 존재를 확인 하는 작물에 의해 손을 흔들었다. 이 방법론은 광범위 한 먹이 하는 메커니즘 (모 세관 작용 및 액체 다리 형성)은 잠재적으로 공유할 나비목과 Diptera 때 다공성 표면에서 먹이 공개 하는 데 사용 됩니다. 또한,이 방법은 먹이 액체 먹이 곤충, 질병 전송 및 biomimetics, 나노 또는 마이크로 크기의 회로 포함 하는 잠재적으로 다른 연구에서 그 중요 한을 포함 하 여 다양 한 가운데 메커니즘의 연구에 대 한 사용할 수 있습니다 어디 액체 수송 필요 확인을 합니다.
서론
많은 곤충 그룹 있다 mouthparts (proboscises) 액체에 먹이 대 한 적응, 꿀, 과일, 썩 어 등 수액 흐름 (예: Diptera1, 나비목2, Hymenoptera3), xylem (Hemiptera4), 눈물 (나비목 5)과 혈액 (Phthiraptera6, Siphonaptera7, Diptera7, Hemiptera8, 나비목9). 곤충의 체액에 피드 기능은 생태계 건강 (예: 수 분10), 질병 전송4,11, biodiversification2,12및 연구와 관련 수렴 진화13의. 다양 한 음식 소스에 불구 하 고 일부 액체 먹이 곤충 가운데 테마 마이크로 또는 나노 크기의 방울, 액체 필름 또는 다공성 표면에 국한 될 수 있는 액체의 작은 금액을 확보 하는 기능입니다.
액체 먹이 곤충 (20% 이상 모든 동물 종14,15)과 다양 한 음식 소스에 피드를 자신의 능력의 광범위 한 다양성을 감안할 때 그들의 먹이 이해 행동 및 액체 흡수 메커니즘은 많은 분야에서 중요 한. 곤충 진드기 기능, 예를 들어, 생체 모방 기술, 예를 들면, 소량 고용 된 것과 유사한 방법을 사용 하 여 체액의 수집 등의 작업을 수행할 수 있는 미세 소자의 개발에 역할을 담당해 왔습니다. 곤충16 그러나 유체 통풍 관 기계 장치,,의 연구에 근본적인 문제 뿐만 아니라 어떻게 곤충 체액에 피드 결정 이지만 메커니즘을 지 원하는 실험적인 증거를 획득. 전적으로 동작을 사용 하 여 (예: 코12,17프로 빙)로 먹이 대 한 지표로 충분 한 체액의 성공적인 이해를 확인 하지 않습니다 없으며 경로 결정 하는 방법 때문에 그 체액 여행 곤충을 통과. 또한, 소량 액체 더 나은 실험 수행 자연 먹이 시나리오를 어디 체액 제한 리소스2,12나타냅니다.
위상 대비 영상 어떻게 나비 다공성 표면12에서 체액의 작은 금액에 대 한 피드를 평가 하기 위해 바둑의 나비 (별 plexippus L.)와 함께 사용 되었다 엑스레이 모나 크 나비 코 따라 cuticular 계획 (legulae 등) 사이의 공간을 통해 모 세관 작업을 사용 하 여 음식 운하에 작은 구멍에 국한 하는 체액을가지고. 들어오는 액체 음식 운하 벽에 성장 하 고 고원 불안정12,18, 다음 머리에 빠는 펌프의 행동에 의해 나비의 용기에 운송 하 여 액체 다리에 붕괴에 영화를 형성 합니다. 기술은 쉽게 사용할 수 있는 x 선 위상 대비 영상 곤충12,19,,2021내부 유체 흐름을 시각화 하는 최적의 도구 이지만, 더 편리 하 고 메서드는 글귀 체액을 곤충의 능력의 빠른 평가 위해 필요 하 고 그들을 섭취.
D. plexippus 에 대 한 먹이 메커니즘 다른 나비목 및 파리 (Diptera) (다공성 표면에서 액체에 피드 두 그룹), 경우 확인 하려면 Lehnert 외. 13 여기에서 보고 되는 다공성 표면에서 작은 양의 액체에 먹이 곤충의 능력을 평가 하기 위한 기술 적용. 접촉을 사용 하는 연구 및 다공성 표면에 대 한 여기에 설명 된 프로토콜 이지만, 주소 풀 먹이 메커니즘 같은 다른 연구 방법론을 변경할 수 있습니다. 또한, 응용 프로그램 마이크로 및 bioinspired 기술을 포함 하 여 다른 필드를 확장 합니다.
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프로토콜
1. 곤충 종, 솔루션 및 먹이 역 설치의 준비
참고: 양배추 나비 (배 rapae L., 흰나비과) 선택 됩니다 대표 나비목의 종족으로 그들은 액체 이해 능력과 놓이고 형태학22,23의 이전 연구에서 사용 된 때문에. 집 파리 (파리 자리 부채 L., Muscidae)과 파란색 병 파리 (Calliphora vomitoria L., Calliphoridae) 때문에 그들은 종종 다공성 표면13에 먹이 관찰 하는 데 사용 됩니다.
- 23 ° C와 18 L: 6D photoperiod 순서 P. rapae pupate 환경 챔버를 성인으로 등장 하기 전 까지는 인공에 그들 ( 재료의 표참조) 다이어트는 곤충 공급 업체 및 후방에서 애벌레로 설정 합니다. M주문입니다. 부채 및 pupae로 C. vomitoria 및 P. rapae으로 같은 환경 조건에서 후면. 그들은 먹이 실험 전에 번데기에서 등장 하는 후 성인 나비와 파리를 먹이 하지 마십시오.
- 20% 자당 해결책 (제어) 및 유체 통풍 관에 대 한 테스트 20% 자당 나노 솔루션을 준비 합니다. 형광 자기 나노 입자를 추가 하 여 나노 솔루션을 준비 (철 산화물 polyacrylic 산 코팅, 약 20 nm 직경에서) 20% 자당 솔루션 (1 mg/mL의 dH2O 나노 20% 자당과24 솔루션, 1:1)입니다. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 1 배 솔루션 준비 (10 x 1 x dH2O, pH 7.4에에서 희석), 해 사용 되는.
- 클램프와 별도 먹이 단계 (플랫 플랫폼) 수동 조작으로 구성 된 먹이 스테이션을 설정 (그림 1). 먹이 무대에 오목 슬라이드를 놓고 숨 구멍 크기 직경 1, 5, 8, 11, 20, 30, 41, 또는 60 µ m 및 멤브레인 필터의 기 공 크기 직경 나일론 그물 필터 또는 먹이 실험에 대 한 인근 10 µ m.
2. 먹이 프로토콜
- 곤충의 몸, 다리, 및 날개 접힌된 휴지로 바꿈. 머리와 mouthparts 노출 되도록 곤충을 놓습니다. 곤충 먹이 단계 (그림 1) 위에 중단 되도록 조작자에 클램프에 의해 함께 개최 됩니다 두 현미경 슬라이드 사이 곤충의 날개를 놓습니다.
- 오목 슬라이드의 중심에 20% 자당 해결책 또는 20% 자당 나노 솔루션은 micropipette 30 µ L 물방울을 관리 합니다. 되도록 필터 종이의 중심 나노 솔루션의 물방울과 오목 슬라이드에 특정 기 공 크기의 단일 필터 종이 놓습니다. 드롭릿에 필터 종이 사이의 접촉 확산 따라 필터, 숨 구멍 (그림 1)를 작성 하는 솔루션에 발생 합니다.
참고: 필터 종이 곤충 피드 필터 종이 위에 나노 입자의 잠재적인 존재를 최소화 하기 위해, 다른 방법 보다는 오히려 작은 물방울, 위에 배치 됩니다. - mouthparts의 원심 영역 으로만 먹이 단계 (그림 1)에 젖은 필터 종이 연락할 수 있도록 조작자와 곤충을 놓습니다. 곤충 핀을 사용 하 여 확장 필터 종이에 mouthparts 45에 대 한 피드에 곤충을 허용을 s.
- 필터 종이의 표면에 있을 수 있는 액체 영화에 먹이 곤충의 기회를 최소화 하기 위해 위치는 mouthparts를 (즉슬라이드의 평평한 부분에 닿아 필터 종이의 부분 접촉. 슬라이드의 오목한 부분 위에 직접). 곤충 먹이에 대 한 관심을 표현 하지 않습니다, 경우는 mouthparts 먹이 시간 동안 곤충 핀 필터 종이에 개최 수 있습니다.
3입니다. 해
- 곤충의 몸을 커버 하는 충분 한 솔루션 되도록 PBS 솔루션을 50 m m 시계 유리에 놓습니다. 장소는 stereoscope 옆 장비 (봄 마이크로 위, 곤충 핀, 괜 찮 포인트 집게를 해 부 해 부)을 해 부 위치와 stereoscope 곤충 아래 시계 유리.
- 수 유, 후 티슈 페이퍼에서 곤충을 제거 하 고 날개 폐쇄와 그것을 잡고. 봄 마이크로 해가 위로 머리, 다리, 및 곤충의 날개를 제거 하 고 시계 유리 (그림 2)에서 PBS 솔루션에 곤충을 놓습니다.
- 필요한 경우, anesthetize 해 전에 곤충. 집게를 사용 하 여 복 부의 원심 영역 근처 표 피에 의해 곤충을 잡아. 지배적인 손을 가진 봄 마이크로 해 부가 위를 사용 하 여 복 부, 흉부에이 때까지 후부 끝에서 시작의 측면을 따라 앞쪽으로 표 피를 잘라. 표 피만 잘라 고 (그림 2) 손상 곤충 내부 영양 운하는 특별 한 주의 분리 했습니다.
- 복 부 (그림 2) 내부 영양 운하를 공개 하 여 해가 위 표 피의 추가 컷을 확인 합니다. 곤충 핀의 도움으로 복 부 표 피, 뚱뚱한 몸, 및 다른 구조를 제거 하 고 후속 처리, 시계 유리에는 흉부 및 영양 운하를 떠나 시계 유리 밖에 서 그들을 재배치.
주: 해 부는 흉부와 복 부의 시점 근처 골목 같은 구조 (영양 운하 확장) 자르기, 발표할 예정 이다. - 자르기는 노출 되지 않습니다 경우 작물은 계시 될 때까지 위와 흉부에 추가 incisions 확인 합니다. 일단 자르기 표시, 시계 유리 (그림 2)에서 작물 영양 운하만 떠나는 곤충의 나머지 부분을 버려야 됩니다.
참고: lepidopteran 작물은 거의 투명 하 고 셀로판 같은 경우 하지 체액으로 가득 이며 확장을 인식 하기 어려울 수 있습니다 자연, 또는 경우 그것은 해 부 동안에. - Coverslip (24 x 24 mm)에 자르기를 좋은 포인트 집게 해 부를 사용 하 여 후속 이미징 (그림 2).
4입니다. 섭취 한 나노 입자의 결정
- 위치 좋은 포인트 해 집게를 사용 하 여에서 coverslip에 자르기 자르기 파열을 방지 하기 위해 신경. 20 배 확대에 이미징 거꾸로 confocal 현미경에 CY3 채널 (또는 단계 대조)를 사용 합니다. 밖으로 건조에서 그것을 방지 하기 위해 절 개 후 즉시 자르기 이미지.
- 현미경의 운영 단계의 제어에 손에 바 (41.3 m m 길이 직경에서 8 m m) 자석 저 어를 개최.
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결과
액체 먹이 곤충 가운데 액체 이해 능력에 패턴의 연구 먹이 발생 하는 시기의 결정을 필요 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 나비목 및 Diptera13중 제한 기 공 크기 가설을 테스트 하는 데 사용 됩니다. 제한 기 공 크기 가설 기 공 크기 직경12먹이 도관 직경 보다 작으면 액체 채워진 구멍에서 액체 먹이 곤충 먹이 수 없는 상태. 모 공에는 액체를 유지 하는 모 세관 압력을 극복 하 고 액체 표면에 빠는 펌프에 대 한 제공을 다공성 표면에서 들어오는 체액 고원 불안정18를 통해 안정적인 액체 다리를 형성 해야 합니다. 다양 한 크기 (그림 3)의 도관을 먹이 함께 곤충 그들은 먹을 수 있는 작은 숨 구멍 크기에 다 예상 됩니다.
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토론
곤충 진드기 기능 역사적으로 심한 형태학의 학문에서 유추 (예., 마시는 밀 짚25,26lepidopteran 코 기능 관련); 그러나, 실험적 증거를 통합 하는 최근 연구 곤충 mouthparts 및 구조-기능 관계2,,1213 의 복잡성에 대 한 우리의 이해에 패러다임의 변화 결과 , 22 , 27.23전자 현미경 검사 법, confocal 현미경 검사 법22, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT)
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 국립 과학 재단 (NSF)에 의해 지원 되었다 no를 부여. IOS 1354956입니다. 우리 닥터 앤드류 D. 워렌 (나비목 및 생물 다양성, 플로리다 자연사 박물관의, 프로 리 다의 대학에 대 한 맥과 어 센터) 나비 이미지를 사용 하는 허가 대 한 감사 합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 20% 자당 용액 | 도미노 설탕 | dH2O | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | 곤충 해부를 위한 dH2O에서 1X로 희석된 10X 농도 |
| 함몰 오목 슬라이드 | AmScope | BS-C6 | 슬라이드는 공급 단계 설정에 |
| 여과지 | EMD Millipore | NY6004700(60 &마이크로; m) | 곤충 먹이를 위한 다공성 표면을 생성하는 데 필요한 나일론 그물 필터 및 이소공 필터 |
| 여과지 | EMD Millipore | NY4104700(41 µ m) | 곤충 먹이를 위한 다공성 표면을 생성하는 데 필요한 나일론 그물 필터 및 이소공 필터 |
| 여과지 | EMD Millipore | NY3004700(30 µ m) | 곤충 먹이를 위한 다공성 표면을 생성하는 데 필요한 나일론 그물 필터 및 이소공 필터 |
| 여과지 | EMD Millipore | NY2004700(20 &마이크로; m) | 곤충 먹이를 위한 다공성 표면을 생성하는 데 필요한 나일론 그물 필터 및 이소포어 필터 |
| 종이 | EMD Millipore | NY1104700(11 µ m) | 곤충 먹이를 위한 다공성 표면을 생성하는 데 필요한 나일론 그물 필터 및 이소공 필터 |
| 여과지 | EMD Millipore | TCTP04700(10 &마이크로; m) | 곤충 먹이를 위한 다공성 표면을 생성하는 데 필요한 나일론 그물 필터 및 이소공 필터 |
| 여과지 | EMD Millipore | TETP04700(8 &마이크로; m) | 곤충 먹이를 위한 다공성 표면을 생성하는 데 필요한 나일론 그물 필터 및 이소공 필터 |
| 여과지 | EMD Millipore | TMTP04700(5 &마이크로; m) | 곤충 먹이를 위한 다공성 표면을 생성하는 데 필요한 나일론 그물 필터 및 이소공 필터 |
| 여과지 | EMD Millipore | RTTP04700(1 µ m) | 곤충 먹이를 위한 다공성 표면을 만드는 데 필요한 나일론 그물 필터 및 이소공 필터 |
| 홍채 미세 해부 가위 | Carolina Biological Supply Company | 623555 | 해부에 사용되는 가위 |
| 곤충 핀 | 4Bioquip 제품 | 1208B1 | 해부 및 먹이 시험 중에 사용되는 핀 |
| 미세 점 해부 겸자 | Carolina Biological Supply Company | 624684 | 해부 장비 |
| Leica M205 C 입체 현미경 | Leica Microsystems | M205 C | 입체 경 해부에 사용되는 입 |
| 현미경 도립 컨포칼 현미경 | Olympus | IX81 | 자기 나노 입자를 감지하는 데 사용되는 형광 현미경 |
| Fisherbrand PTFE 일회용 교반 막대 | Fisherscientific | S68067 | 나노 입자를 감지하는 데 사용되는 자석 |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34155 | 먹이 실험 중 곤충을 확보하는 데 사용되는 조직 |
| 집파리(Musca domestica) 번데 | Mantisplace.com | 실험용 곤충 | |
| 푸른병파리(Calliphora vomitoria) 번데 | Mantisplace.com | 실험용 곤충 | |
| 양배추나비(Pieris rapae) 유충 | Carolina Biological Supply Company | 144102 | 실험용 곤충 |
| Finnpipette F1 | ThermoFisher Scientific | 4641080N | 액체 분주용 마이크로피펫 |
| Finntip 250 피펫 팁 | ThermoFisher Scientific | 9400250 | 마이크로피펫 팁 |
| 현미경 유리 커버 슬라이드(=커버슬립)(24 x 24mm) | AmScope | CS-S24-100 | 컨포칼 현미경으로 곤충의 작물을 보기 위한 커버슬립 |
참고문헌
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