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방법 논문

동맥 경화 증의 영상에 대 한 펩 티 드 Amphiphile Micelles Monocyte 타겟팅의 합성

7K 조회수

DOI:

10.3791/56625

2017년 11월 17일

이 논문에서

요약

이 종이 합성 및 펩 티 드 amphiphile micelles monocyte 대상의 특성을 포함 하는 메서드를 제공 하 고 해당 생체 적합성 및 monocytes에 바인딩할는 micelle의 능력에 대 한 테스트 분석 실험.

초록

동맥 경화는 매년 17.3 백만 생활을 요구 하는 심혈 관 질환, 세계, 죽음의 주요 원인에 큰 기여. 동맥 경화는 급 사, 심근 경색, 불안정 플 라크 파열 및 경고 없이 혈관을 가리고 하는 사주의 주요 원인 이기도 합니다. 현재 modalities 이미징 안정과 불안정 플 라크 파열을 구별할 수 없습니다. 펩 티 드 amphiphiles micelles (PAMs)로 다양 한 병에 걸린 조직을 구체적으로 바인딩할 moieties를 대상으로 수정할 수 있습니다이 결점을 극복할 수 있다. Monocytes는 monocytes의 큰 축적은 플 라크 파열 경향이 연관 동맥 경화 증의 조기 표식 되도록 표시 되었습니다. 따라서, monocytes 대상 나노 차별 동맥 경화의 다른 단계를 사용할 수 있습니다. 이 위해, 여기, 우리 PAMs monocyte 타겟팅의 준비에 대 한 프로토콜 설명 (monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs 15의 형태로 나노 입자에 온화한 조건에서 합성을 통해 조립 자체는 중립 표면 충전 근처와 직경에서 nm. 생체 외에서 PAMs 생체 발견 했다 및 monocytes에 대 한 높은 바인딩 선호도 했다. 여기에 설명 된 방법을 다른 염증 성 질환 및 동맥 경화에 다양 한 응용 프로그램에 대 한 약속을 보여줍니다.

서론

심혈 관 질환 약 17.3 백만 죽음 전세계1와 세계적으로 죽음의 주요한 원인에 남아 있다. 심혈 관계 질환 동맥 경화, 있는 패 동맥, 억제 함으로써 혈액에는 바디2,3의 셀에 산소 흐름을 구축 하는 조건에 의해 크게 기여 하고있다. 동맥 경화 증의 진행 한 염증 반응, 불규칙 한 지질 물질 대사, 및 패 형성, 플 라크 파열과 심근 경색4,5로 이어지는 두껍게 및 동맥의 경화를 포함 한다. 내 피 세포 cytokines와 접착 분자, MCP-1 C-C chemokine 수용 체 (CCR2) monocytes6,,78의 표면에서 발견을 포함 하는 표현. 산화 된 콜레스테롤 플 라크 형성, 지역에서 염증 반응을 증폭 하 고 조직 상해와 불안정 하거나 취약 한 패9, 의 형성의 초기 단계 동안 세포 monocytes ....

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프로토콜

참고: 시 약에 대 한 MSDS를 읽고을 로컬 기관에 의해 필요에 따라 모든 화학 안전 조치를 따르십시오.

1입니다. MCP-1 PAMs의 준비

  1. MCP-1 펩 티 드의 준비
    1. Fmoc L 리스 (Boc)의 0.25 mmol을 무게-반응 선박 (RV)에 왕. 화학 증기 두건에서 5 mL dimethylforamide (DMF)와 RV의 측을 씻어.
    2. 자동된 벤치탑 펩 티 드 합성기에 RV를 로드 합니다. 사전 패키지 된 아미노 산 성 튜브, N '-CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS-C', C N-말단을 로드 합니다. 최종 deprotection 단계 끝에 빈 병을 포함 합니다.
      참고: 시퀀스, N '-CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK-C', 스크램블된 펩 티 드 수 또한 될 합성 같은 프로토콜을 사용 하 여.
    3. 합성이 완료 되 면 전송는 펩 티 드 수 지에는 RV에서 2-3 mL 메탄올을 가진 섬광 유리병에 수 지의 모든 전송 되기 전 까지는. 수 지 바닥에 침 몰 했다, 후 표면에 뜨는 메탄올을 제거 하 고 건조까지 남은 증발. 진공 건조는 추가적인 2 시간 또는 하룻밤 실 온에서.
    4. 화학 증기 두....

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결과

MCP-1 팸의 준비
MCP-1 단백질 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] 또는 스크램블된 펩 티 드 [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] CCR2-바인딩 모티브 (잔류물 13-35) N-말단에 시스테인 잔류물을 추가 하 여 수정 되었습니다. MCP-1 펩타이드 자동된 펩타이드 합성기를 사용 하 여 Fmoc 중재 고체 단계 방법에 의해 합성 되었다. 원유 펩 티 드 역 상 HPLC 0.1%를 사용 하 여 50 ° C에서 c 8 열에 의해 순화 되었다 이기/물 혼합물에 있는 TFA MALDI 질량 분석 (그림 1)에 의해 특징. 시스테인-포함 펩 티 드 DSPE-PEG2000-maleimide thioether 연결을 통해 DSPE 말뚝 (2000)-펩타이드 어원이 같은 말을에 활용 했다. 후 실 온에서 24 h, 원유 제품 (그.......

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토론

MCP-1 PAMs 친수성 대상 펩 티 드와 소수 성 꼬리는 나노 입자의 자기 조립된 특성을 구성 된 유망 분자 이미징 플랫폼은. 이 monocyte 타겟팅 micelle 간단한 합성 및 (2000)-MCP-1 MCP-1 펩 티 드와 DSPE-못의 정화 단계에 의해 준비 될 수 있습니다. PAMs vivo에서 분자 이미징와 같은 대 한 많은 유익한 특성을가지고 그들의 본질적인 biodegradability, 온화한 조건과 다른 이미징 moieties의 설립을 허용 하는 구조 및 화학 다양성에서 자기 조립 또는 관심의 특정 사이트를 선택적으로 제공 하는 펩 티 드를 대상으로. 그들의 입자 크기, 모양, 및 구성 펩 티 드, 소수 성 꼬리, 또는 micelle 농도, 수 있도록 다양 한 응용 프로그램22,33에 대 한 최적의 화학 및 물리적 특성을 변경 하 여 조정 될 수 있습니다.

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자 남부 캘리포니아 대학, 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 (NHLBI), R00HL124279, Eli와 Edythe 넓은 혁신 상 수상, 고 L.K. 위 티어 재단 비 암에서 재정 지원을 인정 하 고 싶습니다. 번역 상 연구 상 EJC 부여입니다. 저자 감사는 센터 전자 현미경 및 Microanalysis, NanoBiophysics에 있는 우수의 센터, 분자 특성 분석을 위한 우수의 센터 및 들어가게 이미징 센터에 남부 캘리포니아 대학에 경 음악 설정입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
펩타이드 합성을 위한1,2-에탄디티올VWRE0032
10mL 일회용 혈청학 피펫VWR89130-898세포 배양을 위한
15mL 원심분리 튜브, 폴리프로필렌VWR89401-566다양한 응용 분야용
2,5-디하이드록시벤조산, 99%MALDI
일회용 세포 배양을 위한VWR89130-900
2-메르캅토에탄올, 50 mMThermoFisher Scientific31350010세포 배양을 위한
mL 일회용 혈청학 피펫VWR89130-896세포 배양을 위한
50 mL 원심분리 튜브VWR89039-658다양한 응용 분야를 위한
75 cm2 배양 플라스크Fisher Scientific세포 배양을 위한 13-680-65
펩타이드 합성을 위한75mL 반응 용기Protein Technologies3000005
96웰 세포 배양 플레이트MTS 분석을 위한VWR40101-346
, 아세토니트릴, HPLC 등급Fisher ScientificA998SK-4HPLC 정제를 위한
붕규산 유리, PAM합성을 위한VWR66011-041
Borosillicate 유리 피펫, 다양한응용 분야를위한VWR14673-043
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm컨 포칼 현미경 검사 용Fisher Scientific12-542B
펩타이드 접합용 Abcamab146463
Diethyl ether, ACS 등급Fisher ScientificE138-1펩타이드 침전
주사기, 20 mLFisher Scientific14-817-54HPLC 정제용
이중 뉴바우어 규칙 혈구계VWR63510-13세포 계수용
DSPE-PEG(2000) 아민 Avanti880128P펩타이드 접합
DSPE-PEG(2000) 말레이미드Avanti880126P펩타이드 접합
DSPE-PEG(2000)-NHS 에스테르용 에 대한 접합NanocsPG2-DSNS-10K
세포 배양Sigma AldrichD5796-500ML
태아 소 혈청, 적격, 열 비활성화ThermoFisher Scientific10438026세포 배양
Fmoc-L-Ala-OH / HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-A펩타이드 합성
펩타이드 합성을 위한 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBF
타이드 합성을 위한Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NT
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CT펩타이드 합성을
위한Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QT
펩타이드 합성을 위한Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-I
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-L펩타이드 합성을 위한
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBC펩타이드 합성을 위한
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-F
펩타이드 합성을 위한Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SB
합성을 위한Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TB
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YB펩타이드 합성
을 위한Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-V
Fmoc-Lys(Boc)-wang 수지,펩타이드 합성을 위한Novabiochem
856013 포름산, HPLC 정제를 위한 optima LC/MS 등급Fisher ScientificA117-50
컨포칼 현미경 검사용글리세롤VWRM152-1L
계수용핸드 탈리 카운터Fisher ScientificS90189
자기 교반 막대, 펩타이드 접합
메탄올, ACS 인증PAM 합성을 위한Fisher ScientificA412-4
MTS 세포 증식 비색 분석 키트VWR10191-104MTS 분석
N,N-디메틸포름아미드, 펩타이드 합성 N-Methylmorpholine을 위한Fisher ScientificBP1160-4
Protein TechnologiesS-1L-NMM펩타이드
합성용 파라포름알데히드Fisher ScientificAC416780250세포 고정용
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010049다양한 응용 프로그램에 사용
페니실린/스트렙토마이신, 10,000 U/mL배양을 위한ThermoFisher Scientific15140122
, 25 mL & 주의;펩타이드 합성을 위한Fisher ScientificCG186011
포스포텅스텐 산 Fisher ScientificA248-25TEM
PiperidineSpectrumP1146-2.5LTGL펩타이드 합성용
평면 유리 현미경 슬라이드 75 x 25 mmFisher Scientific12-550-A3컨포칼 현미경 검사용
시약 저장고, 멸균 세포 배양을 위한VWR95128093
자체 폐쇄 핀셋TedPella515TEM
지원 필름TedPella01814FTEM
Trifluoroacetic acid 펩타이드 절단 및 HPLC 정제를 위한Fisher ScientificBP618-500
트리이소프로필실란VWRTCT1533-5ml펩타이드 절단용
트리판 블루 솔루션, 0.4%계수를 위한ThermoFisher Scientific15250061
컨포칼 현미경 검사용범용 톱니 모양VWR231-SA-SE
WEHI-274.1ATCCATCC  CRL-1679쥐 단핵구
자동화 벤치탑 펩타이드 합성기Protein TechnologiesPS3 벤치탑 펩타이드 합성제
&알파;- 시아노-4- 하이드록시신남산, 99%MALDI용Sigma Aldrich476870-2G
25mL용 Fisher Scientific AC165200050혈청학 피펫 세포 배양을 위한 5 , , 1 드램 긴 팁 용 일회용 Cy5 Dulbecco의 변형 독수리 매체 - 고 포도당을위한 용 펩타이드 합성을 위한 펩타이드 합성을 위한 펩타이드 펩타이드 합성을 위한100-200 메쉬 세포 염기서열 분석 등급 세포 세포 ,

참고문헌

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12....

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MCP 1HPLC