전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

요약

이 원고는 양성자 교통 시스템의 활동을 측정 하 양성자-선택적 전극 및 패치 방법 클램핑의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 메서드는 일반적으로 양성자 수송 활동, 적당 한 감도, 시간 해상도 및 부족 한 세포내 환경 제어 등을 연구 하는 데 사용 하는 기술의 몇 가지 제한 사항이 극복.

초록

세포 세포 막을 통해 이온의 수송 이온 콘텐츠 내부 및 외부 셀을 셀 생존을 위한 필수 불가결의 정밀한 제어를 보장 합니다. 이러한 전송 메커니즘 전문된 운송업 자 단백질의 활동에 의해 중재 됩니다. 특히, pH 역학 가늘게 나⁺같은 플라즈마 멤브레인 양성자 (H⁺) 압출 시스템에 의해 제어 됩니다 /H⁺ 교환기 (NHE) 단백질 가족. NHE 레 귤 레이 션을 기본 메커니즘을 연구를 광범위 한 노력에도 불구 하 고 NHE 가족의 속성과 분자 생물의 우리의 현재 이해 부족 하다 NHE 활동을 효과적으로 측정 하는 방법의 한정 된 가용성 때문에 . 이 원고에서는 사용 하는 H⁺-전체 셀 중 선택적 전극 패치 NHE 유도 H⁺ 플럭스 측정을 클램핑 기록. 우리는 일반적으로의 약간의 한계를 극복 하기 위해이 방법은 방사성 글귀 등 형광 막 permeants NHE 활동을 측정 하 방법을 사용을 제안 했다. 설명한 메서드를 사용 하 여 NHE 활동의 측정에는 높은 감도 및 시간 분해능 및 세포내 H⁺ 농도의 효율적 제어 수 있습니다. H⁺-선택적 전극은 운송업 자 활동 생성 이온 기온 변화도 세포 막에 가까운 근접에서 사실에 근거한. H⁺-선택적 전극까지 이동 및 반복, 진동 방식에서 세포 막에서 멀리 기록 전압 차이 H⁺ 유량에 따라 달라 집니다. 동안 H⁺-선택적 전극 전체 셀 구성에서 패치 클램프 방법 세포내 이온 구성을 제어 하는 셀을 이동 하는 H⁺ 플럭스 감지 하는 데 사용 됩니다. 또한, 거 대 한 패치 클램프 기술 적용의 이온 뿐만 아니라 지 질의 세포내 구성의 수정 수 있습니다. NHE isoform (NHE3) 3의 운송업 자 활동 phosphoinositides에 의해 NHE3 규정의 분자 기초 연구이 기술 접근을 사용 하 여을 측정 했다.

서론

이온과 플라즈마 막에 걸쳐 용액의 세포의 그리고, 따라서, 생물¹의 생존을 위해 필수적 이다. 이온과 용액의 선택적 전송 전문된 채널 및 운송업 자 단백질의 배열에 의해 이루어집니다. 이 단백질에 돌연변이 다양 한 렌더링 약리 치료¹채널 및 운송업 자 단백질 잠재적인 목표 임상 조건에에서 수시로 유래한 다. 불행히도, 기본 채널 및 전송 기능 및 규정 하는 메커니즘을 이해 종종 그들의 활동^2,,34공부에 사용할 수 있는 방법에 의해 제한 됩니다.

특히, 전송기 분할 될 수 있다 약 하 그들은 용액의 전송 동안 세포 막 횡단 잠재력을 변경 여부에 따라 두 개의 큰 그룹으로: 변경 electrogenic 이온 운송업 자 [예를 들면, 나트륨 인산 염 공동 수송 2a (NaPi2a), 나트륨 칼슘 교환기 (NCX), 등.] 또는 비 변경 electroneutral 이온 운송업 자 [예를 들면, 나트륨-양성자 교환기 (NHE), 염화 나트륨 공동 전송, NaPi2c, 등.]. 전송기의 두 클래스의 활동의 방사성 동위 원소를 사용 하 여 광범위 하 게 연구 하 고 막 permeant 형광 염료². 두 가지 방법을 특정 세포질 이온의 대량 농도 변화를 측정 하 여 전송기의 활동을 예측 하 고 두 메서드 모두 제한이, 온건한 감도 및 시간 해상도 세포내의 부적절 한 제어 등 환경입니다. 실제로, 많은 전송기의 활동 (예를 들어, NHE3, NCX), 월된 이온의 세포질 농도에 따라 달라 집니다 및 이러한 이온 농도에 변화 전송 활동² 를 조절에 중요 한 역할을 할 것으로 예상 된다 ^{, 3 , 5}. 이러한 규정적 메커니즘의 정확한 측정은 고전적인 방법을 사용 하 여 제한.

이러한 한계를 극복 하기 위해 패치 클램프 방법 전송 활동^2,6를 공부 하는 데 사용 됩니다. 특히, 클램핑 시스템 패치를 함께 자체 참조 이온 선택적인 전극 (ISEs)^7,8 최근 있었습니다 electroneutral 운송업 자 활동^3,4 의 측정을 ^{, 5}. ISEs는 운송업 자 활동 생성 이온 기온 변화도 세포 막에 가까운 근접에서 사실에 근거한. 이 세 하 고는 반복에 세포 막에서까지 이동, 진동 패션 (µ V)의 전압 차이 기록 합니다. 전압 차이 보급^2,9Fick의 첫번째 법률을 적용 하는 교정 메서드를 사용 하 여 이온 플럭스 값으로 변환할 수 있습니다. ISEs는 사용의 밖으로 이동 하는 이온의 유출을 감지 하 세포, 두 전체 셀에 패치 클램프 방법 또는 내부 구성 막 잠재력과 세포내 이온 구성을 제어 하는 데 사용 됩니다. 또한, 응용 프로그램의 거 대 한 패치 클램프 기술 이온 뿐만 아니라 지질과 단백질^3,5의 세포내 구성의 수정 수 있습니다.

요약, 패치 클램프 방법의 다양성에 비해 그 공부는 다른 방법의 운송업 자 활동 했다 패치 클램핑 다른 이러한 방법의 일반적인 한계를 극복 하기 위해 적당 한. 자체 ISEs 및 패치 클램프 기술 참조의 조합 electroneutral 전송기 긴밀 하 게 통제 된 실험 환경에서의 활동을 측정 하 고 소설 생물 분자를 독특한 가능성을 제공 합니다. 세포 막의 수송^3,,45. 이 접근은 NHE의 활동 공부를 성공적으로 사용 되었습니다. 포유류 NHE 단백질 가족 세포내 양성자 (H⁺)^10,11 안으로 나⁺ 그라데이션 활용에 대 한 세포 외의 나트륨 (Na⁺)의 electroneutral net 교환 catalyzes. 포유류, NHE 단백질 가족 11 관련된 단백질 (NHE1-9 및 NHA1-2)와 정자 특정 NHE^10,,1213포함 됩니다.

NHEs (SLC9a 가족) 편 높은 진핵생물에 간단한 원핵생물에서 대부분 살아있는 유기 체에서 발견 되 고 중요 한 셀 함수^10,11에 셀 염 방어 제어 등의 다양 한 참여 원핵생물, 산 기초 항상성 및 셀 볼륨을 유지 하 고 다양 한 전문된 epithelia^10,12,,1415에 소금과 물을 흡수 조절 NHEs의 주요 생물학 역할 및 그들의 기능의 중요성; 여러 연구를 통해 결정 그러나, 몇 가지 연구 방법론 한계⁴때문에 포유류 NHEs의 속성과 분자 생물 조사 했습니다. 최근, 자체 ISEs 전체 셀 패치 클램핑 하는 동안 참조의 응용 NHE isoforms 이온, 단백질, 인지질^{3의 세포내 농도 있는 변화에 의해 규제의 새로운 분자 메커니즘을 밝혔다합니다 4}.

특히,이 원고에 제공 된 프로토콜 설명 방법 및 활동을 연구 하 고 규제 NHE isoform 3의 (NHE3) 나⁺, Cl^-, HCO₃^- 및 액체의 흡수에 중요 한 선수에 대 한 접근은 솔 국경 막 신장 및 장 epithelia^14,16. 세포내 phosphoinositides에 NHE3 활동의 감도에 차이에 대 한 새로운 통찰력 (phosphatidylinositide 4, 5 bisphosphate [PI (4, 5) P2] 및 phosphatidylinositide 3,4,5 3 인산 염 [PI(3,4,5]P3]) 보고. 채널 및 전송기, 같은 세포 수송 단백질 phosphoinositides¹⁷에 의해 통제 되 고 NHE3는 직접 PI (4, 5) P2 및 P3 파이 (3,4,5)¹⁸를 바인딩합니다. 현재 문학을 바탕으로, 어느 phosphoinositide NHE3^5,,1819의 생리 적 또는 병 태 생리 규제에 대 한 관련 수 있습니다. 우리의 연구 결과 PI (4, 5) P2와 파이 (3,4,5) P3 NHE3 활동의 규칙에 대 한 별도 역할을 지원합니다. 이 구별이 세 기술 함께 전체 셀 패치 클램프 기록의 응용 프로그램 때문에 가능 했다. 이 기술에는 또한 NHE3 활동의 측정 하는 동안 다른 phosphoinositides의 세포내 관류를 통해 phosphoinositide 세포 내용 제어할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 두 개의 앰프는 패치 클램핑, 전체 셀 구성 및 높은 들이 닥 침 증폭기 (에 셀을 유지 하기 위해 패치 클램프 앰프와 함께에서 자체 참조이 세 여 electroneutral 전송기의 활동을 기록 하는 데 필요한 전위 계)는이 세 통해 전송 활동을 기록 하 (재료의 표 참조). 패치 클램프 앰프 터미널 수집 보드에 직접 연결 됩니다. 전위 계는 신호를 증폭 및 필터링을 활용 하는 차동 증폭기에 연결 된다. 차동 증폭기는 터미널 수집 보드에 연결 됩니다. Capmeter, 셀 용량을 모니터링 하는 패치 클램프 소프트웨어 이전 연구²⁰ 에 사용 되었습니다 (재료의 표 참조). 녹음 실 및 관류 솔루션 37 ° c.에 유지 된다

1입니다. 펫 ISEs에 대 한 준비

1. 1.2 m m의 외부 직경을 붕 규 산 유리 모 세관에서 펫을 당겨 ( 재료의 표참조) 피 펫 끌어당기는² 를 사용 하 여.
2. 폴란드어는 microforge를 사용 하 여 피 펫. 피 펫 팁의 직경은 2-3 µ m 이어야 한다.
3. 펫에 대 한 병 보유자에는 펫 피 펫 팁 ( 테이블의 자료참조)을 향하도록 넣습니다.
   주의: 환기가 화학 증기 두건에서 1.4-1.6 단계를 수행 합니다.
4. Bis (dimethylamino) 디 메 틸 실 란 및 사염화 탄소 10 방울 1 방울 (~ 150 µ L)의 구성 된 siliconization 혼합물을 혼합 ( 재료의 표참조).
5. 항아리에 siliconization 혼합물을 부 어 하 고 단단히 뚜껑을 닫습니다.
6. 혼합물은 완전히 증발 때까지 실내 온도에 화학 증기 두건에서 24-48 h에 대 한 siliconization 혼합 항아리를 품 어.
7. 약 2-4 mm의 열을 만드는 백필 적절 한 이온 선택적 수 지와 피 펫.
   참고: 수소 ionophore 나 칵테일 B usedfor 녹음 NHE 활동 일 수 있다 ( 재료의 표참조).
8. 팁에 이온 선택적 수 지를 배포 하는 피 펫의 끝을 누르고 아래로 피 펫 피 펫 팁 용기 거치대에 세로로 배치.
9. Checkunder 해 현미경 수 지 칵테일 팁의 끝에 도달 했습니다. 필요한 경우, 긍정적인 압력 끝에 수 지를 적용.
10. 적절 한 솔루션으로 백필 반 피 펫 (~ 100 μ). 여기,를 사용 하 여 100 mM KCl와 10 mM HEPES pH 7.0에서 ionophore 사용 하는 경우 나 칵테일 b.
11. ISE는 전위 계에 연결 고 ISE의 팁 목욕 솔루션 기록을 위해 사용 합니다. 제로 전위 계.
12. H⁺테스트-목욕 해결책의 pH를 변경 하 여 선택이 세 응답. 평균 H⁺-선택적 세 응답은 ~ 58 단위 pH 당 mV.
13. 주기적으로 교정에이 세 응답을 평가 합니다.

2. 기록에 대 한 패치 클램프의 준비 펫

참고: 단일 채널 녹화²¹ 에 그의 기사에서 도널드 Hilgemann에 의해 설명 하는 방법은 것이 좋습니다.

1. 붕 규 산 유리 모 세관에서 거 대 한 패치에 대 한 펫을 당겨 (2.0 mmOD / 1.5 m m ID) 피 펫 끌어당기는^2,,2223에.
2. microforge를 사용 하 여 다양 한 피 펫 팁 (10-22 μ m)²³을 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 장착. 구슬을 녹여 (~ 0.5 mL)는 microforge의 두꺼운 백 금 철사에 부드러운 유리의.
   참고: 상대적으로 두꺼운 백 금 철사는 필요한 거 대 한 패치 펫 조작 하 (~0.5 m m).
3. 부드러운 유리 구슬 가까운 패치 피펫으로 놓고 팁 손을 떼 다 때까지 전체 열을 적용. 백 금 철사 난방 centerduring 쪽으로 약간 이동 합니다.
4. 열을 끄고 부드럽게 유리 구슬에 피 펫 팁을 밀어. 냉각 와이어 철회 하 고 피 펫 팁을 깰 것 이다.
5. 부드럽게 피 펫 팁을 원하는 직경의 피 펫 팁을 만들 열을 다시 적용 합니다. 팁의 직경에 따라 달라 집니다 수를 셀의 크기 패치 (이 연구에서 8-10 μ m).

3입니다. 셀의 준비

1. 워밍업 없이 캘리포니아^{2 +} 그리고 마그네슘^{2 +}, 트립 신-EDTA 솔루션 성장 매체를 37 ° c.에 인산 염 버퍼 염 분 (PBS)
2. PBS로 두번 세척 세포입니다. 버퍼의 1 mL를 사용 하 여 35mm 직경 셀 문화 접시.
3. 35 m m 직경 셀 문화 접시에 있는 셀에 트립 신 0.5 mL를 추가 합니다.
   참고: 셀 시작 라운드-최대, 드 셀 연결 플레이트를 흔들.
4. 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보완 하는 완전 한 성장 매체의 5 mL (35 m m 직경 셀 문화 접시에 대 한 금액)를 추가 하 여 트립 신 작업을 중지 합니다.
   참고: 트립 신에 반응 시간은 셀 종속.
5. 덩어리의 형성을 방지 하기 위해 락을 통에 세포를 놓습니다.
6. Trypsinization 후 최대 2 시간에 대 한 셀을 사용 합니다.
   참고: 시간 셀 라인에 따라 달라질 수 있습니다.

4. 내 피 펫 관류 시스템의 준비

1. 석 영 튜브의 적절 한 크기로 잘라 (150 µ m OD / 75 µ m ID) 내 피 펫 관류 라인을 준비 하.
2. 200 µ L 피 펫 팁에 석 영 튜브의 한쪽을 삽입 합니다. 팁에 석 영 튜브를 접착제와 날카로운 면도날으로 팁의 끝을 잘라.
3. 실리콘 튜브 내 피 펫 관류 솔루션에 대 한 저수지 역할을의 작은 조각에 관류 선 (석 영 튜브 끝에 붙어)를 연결 합니다.
4. 긍정적인 압력을 만들려고 주사기에 실리콘 튜브를 연결 합니다.
5. 삽입은 관류의 피 펫 소유자의 폴 리 에틸렌 튜브를 통해 석 영 튜브의 무료 끝 포트 ( 재료의 표참조).
6. 피 펫 솔루션 관류 라인을 평가 합니다.

5입니다. 솔루션의 준비

1. NHE (115 mM 칼륨 aspartate (KAsp), 1mm EGTA, 0.5 m m MgCl₂, 10 m m Mg-ATP, 12.5 mM HEPES, 12.5 m m, 12.5 m m MOPS, 관과 12.5 m m MES, pH 6.0 aspartic 산 조정)를 기록 하기 위한 무 겁 게 버퍼링된 피펫은 솔루션을 준비 합니다.
   참고: 주식 피 펫 솔루션 및 필터를 준비 합니다. 녹음 전에 Mg-ATP를 추가 합니다.
2. (140 mM NaCl, 2mm CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 그리고 0.1 m m Tris HCl pH 8.2) 때마다 신선한 목욕 솔루션을 준비 합니다.

6. 전송 활동의 기록

1. 운송업 자 활동은 온도 의존 하기 때문에 녹음 실과 37 ° C에서 모든 솔루션을 유지 합니다.
2. 녹음 실로 셀을 놓습니다. 그들은 챔버의 바닥에 드롭 하지만 그들 챔버에 연결 하지 마십시오 때까지 기다립니다.
3. 적절 한 셀을 선택 합니다. 눈 마이크로미터와 셀의 직경을 측정 합니다. 유사한 직경을 가진 셀을 선택 합니다.
   참고: 일반적으로, 큰 셀이 해야한다 더 세포 표면 및 따라서 또한 데 더 운송업 자 활동의 원형질 막에 표현 가능 하 게 더 많은 전송기. 그러나, 이건 반드시 올바른 전송 활동 특정 운송업 자 및 연구에서 셀 형식에 따라 달라 집니다.
4. 탑재는 micromanipulator 하 이온 선택적 microelectrode 피 펫, 백필 세포내 솔루션 패치 클램핑 피펫으로 확인 솔루션²피 펫 끝에 도달 하면.
   참고: 그것은 여러 부드러운 탭은 피 펫의 끝에 거품을 제거 하기 위해 필요할 수 있습니다.
5. ^2,,2223설정 전기 생리학의 머리 단계로 패치 클램핑 피펫으로 탑재 합니다.
   참고: 그것은 중요 하다 수평 축에 45도 각도로 대 한 머리 무대에서 계속 그러면 저항력 인감의 형성에 대 한 적합 한 피 펫에 대 한 항목 각도.
6. 작은 긍정적인 압력 (~ 5 cm H₂O) 패치 피 펫 팁, 차단의 기회를 줄이기 위해 목욕 솔루션으로 그것을 배치 하 게.
7. 팁 셀에 가깝다 면 패치 클램프 피 펫 이동 중지 합니다.
8. 피 펫 셀 접촉 하는 동안 긍정적인 압력을 완화 하 고 약간의 부정적인 압력 (~ 5 cm H₂O)를 한 > 1000 m ω (기가 옴) 인감 패치와 세포 막에 플라스틱²³.
9. 셀과 패치 피 펫이 세와 같은 초점 평면에 놓고 패치 피펫으로 ISE에 근접에 있는 셀으로 이동 (~ 5-10 µ m)^2,5 는 하지만 (그림 1A)이 세를 연결할 셀 수 있도록 하지 마십시오.
10. 잠재적인 지주 0 보장 mV.
11. 전체 셀 구성을 짧은 suctions의 시리즈와 함께 인감 파열.
12. 이 세 (또는 패치 클램프 피 펫) 이동 천천히 왼쪽에서 오른쪽 또는 아래로 전송 (그림 1B)의 활동을 기록 하.
13. 적어도 5-8 봉우리를 기록 (그림 1C, B A에서).
14. 구형 파 섭 물개 및 세포 막 커패시턴스 (그림 1)의 품질을 모니터링 하는 녹음 하는 동안 적용 됩니다.
15. H⁺ 플럭스 예측 () 세포 표면 및 대량 솔루션 (ΔH⁺) 무료 H⁺ 농도 차이에서
    
    
    참고: 및 H⁺ 고 확산 계수를 각각, 버퍼 B_T 는 총 버퍼 농도, K_D 는 버퍼의 분리 상수, r 은 셀 반경, 그리고 무료 H⁺에 작은 변화에 대 한 바운드 H⁺ 의 농도에 정상 상태 변화를 결정 합니다. H⁺ 솔루션 무료 양성자를 나타냅니다. 이전 연구 결과와 일치 하도록 H⁺ 용 변환 됩니다 electrophysiological 유량 단위는 용의 현재 항목을 계산 하 여 (/faraday) pA^3,5].
16. 셀 크기에서 산출 될 수 있다 세포 표면 또는 막 커패시턴스 양성자 플럭스를 정상화.

결과

전체 셀 패치 클램프 기록 중 자체 참조이 세는 phosphoinositides에 의해 NHE3 활동의 규칙을 공부에 적용 되었습니다. PS120 구와 같은 셀²⁴, 생 플라즈마 멤브레인 NHEs의 표현 부족, 사용 되었다. NHE3 야생-타입 (NHE3 wt) 또는 NHE3 돌연변이 하지 않는 바인딩 phosphoinositides [티로신 501, 503 아르기닌과 리 505 알라닌, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)로 대체 했다] PS120 구와 같은 셀¹⁸에 안정적으로 표현 했다.

자취는 그림 2에 표시 됩니다. 셀 heldin 패치 클램핑, 피 펫에 의해 전체 셀 구성 되었고 ISE 셀 앞에 배치 했...

토론

전송기의 중요 한 기능에도 불구 하 고 그들의 활동을 공부에 사용할 수 있는 방법 효과 및 불 충 분 한 있습니다. 한 가지 한계는 사용할 수 있는 방법을 측정 이온 운동 변동 세포내 이온 조성 실험⁴동안에 고려 하지 않고 전송 활동에 의해 중재입니다. 제시 방법 세포 외 및 세포내 이온의 정확한 제어를 보장 하 고 세포내 이온, 단백질 및 지질 구성^3,4,5를 수정 하기 위한 강력한 도구를 제공 합니다.

이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 오랜 기간²⁵안정 하는 ISE의 준비 합니다. 우리의 경험에서는, 불안정 한이 세 아니다 잘 시 (예를 들어, 선택적 이온 수 지가 세 피 펫 양쪽 배분)는이 세 신호에 일정 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
패치 클램프 증폭기	분자 장치
이중 채널 차동 전위계(HiZ-223)	Warner	Instruments 64-1650
차동 증폭기(DP-301)	Warner Instruments	64-0044
MatLab 기반 패치 클램프 소프트웨어	수집 도구 상자		커패시터 미터 소프트웨어 권장
ThermoClamp-1 온도 제어 시스템	AutoMate Scientific	03-11-LL	인라인 히터
단일 채널 온도 컨트롤러 (TC-324C)	워너 인스트루먼트	64-2400
싱글-배럴 표준 보로실리케이트 유리 튜빙	월드 정밀 Instruments	1B120F-3	이온 선택성 전극에 사용
마이크로피펫 보관 항아리	World Precision Instruments	E212
Bis(dimethylamino)dimethylsilane	Sigma-Aldrich	14755-100ML
탄소 테트라클로라이드	Sigma-Aldrich	319961-500ML
수소 이오노포어 I - 칵테일 B	Sigma-Aldrich	95293
얇은 벽 보로실리케이트 튜빙	Sutter Instrument	B200-156-15	패치 클램프 피펫에 사용
소프트 글라스 (Corning 8161 패치 유리)	워너 인스트루먼트	64-0815
실리카 캐필러리 튜빙 (150um OD/75um ID)	Molex (Polymicro Technologies)	106815-0018	피펫 내 관류 시스템에 사용됨
염화칼	Sigma-Aldrich	P9333
칼륨 아스파르테이트	시그마-알드리치	A6558
EGTA	시그마-알드리치	E3889
염화마그네슘	시그마-알드리치	M4880
mg-ATP	시그마-알드리치	A9187
헤페스,	시그마-알드리치	H3375
파이프	, 시그마-알드리치	P6757
걸레,	시그마-알드리치	M1254
MES	Sigma-Aldrich	M3671
염화칼슘	Sigma-Aldrich	C5670
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
염산	Sigma-Aldrich	H1758
Apyrase	Sigma-Aldrich	A6535
포스파티딜이노시톨(4,5) 비스포스페이트 diC8	Echelon 생명과학	P-4508
포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 diC8	Echelon Biosciences	P-3908