Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

요약

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

초록

단백질 단백질 상호 작용은 릴레이 신호 변환 가장 세포질 과정;에 대 한 기본 메커니즘 그러므로, 소설 단백질-단백질 상호 작용 쌍 및 단백질 상호 작용 역동성을 모니터링 드러내는 식물 환경 요인 및 발달 신호에 응답 하는 방법에 대 한 특별 한 관심의 이다. 접근의 과다 단백질 단백질 상호 작용, 체 외에서 또는 vivo에서검토 개발 되었습니다. 그 중 최근에 설립 된 luciferase 보완성 (협회) 이미징 분석 결과가 이다 vivo에서 단백질-단백질 상호 작용 위한 간단 하 고 빠른 방법. 이 분석 결과에서 단백질 또는 단백질 B는 융합 luciferase의 아미노 맨끝 또는 carboxyl 터미널 반 각각. 단백질 단백질 B로 할 때, luciferase의 두 반쪽 기능과 활성 luciferase 효소를 형성 하는 재구성 된다 것입니다. 루미 노 또는 CCD 카메라 luciferase 활동을 기록할 수 있습니다. 다른 방식에 비해, 질적 및 양적 협회 분석 결과 단백질 단백질 상호 작용을 보여줍니다. Nicotiana benthamiana 잎에서 Agrobacterium 침투 과도 단백질 표정에 대 한 널리 사용된 시스템입니다. 협회 및 과도 식의 조합으로, 이러한 접근 COP1와 SPA1 간의 실제 상호 작용 jasmonate 치료 후 서서히 감소 되었다 보여줍니다.

서론

환경과 성장 조정 하려면 식물 감각, transduce, 신호 신호에 응답 하는 우아한 신호 경로 진화해왔다. 릴레이 경주에서 주자 처럼 단백질은 식물 신호 변환에 필요한 선수. 그것은 널리 인정 되었습니다 단백질 단백질 상호 작용 (PPI) 셀룰러 통신에 대 한 주요 역할을 한다. 단백질 인 산화, acetylation, 및 저하 모두 대상 단백질 및 그것의 수정 효소 간의 실제 상호 작용에 따라 달라 집니다. 예를 들어 Jasmonate ZIM 도메인 단백질 (JAZ) 가족 단백질 녹음 방송 요인 MYC2와 상호 작용 하 고는 transcriptional 활동^1,2를 억제. PPI의 중요성을 감안할 때 대규모 단백질 interactomes 식물에 되었습니다 탐험 최근^3,,45. 이러한 위하여 결과 더 다양 한 세포 기능을 조정 하는 복잡 한 규제 네트워크 공개.

PPI를 모니터링 하기 위한 몇 가지 설립된 접근이 있다. 효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과 PPI 탐지에....

프로토콜

1. 식물 (8 주)의 준비

1. 5% NaClO 0.1% 트라이 톤 X-100 (V/V) 솔루션 및 두고 씨앗 소독을 5 분의 1 mL를 포함 한 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 50 Nicotiana benthamiana 씨앗을 넣어.
2. 5 번 살 균 물으로 종자를 헹 굴 하 고 살 균 물 200 µ L에서 씨앗을 일시 중단.
3. 신중 하 게 장소 개별 씨앗 MS-한 천 매체 (1 l: 重 & Skoog 소금 10 g 자당, pH 5.8 x 1 (코), 1 %agar) 좋은 팁 및 발 아 동기화를 3 일 동안 4 ° C에 게 중간 접시의 표면에.
   참고: 미생물 오염을 방지 하려면 클린 벤치에이 단계를 수행 합니다. 살 균 동안 튜브를 흔들 필요는 없습니다.
4. 10 일 동안, 정상적인 성장 조건 (22 ° C, 80-90 µmolm^-2의-1 흰 빛의 강도)에서 중간 접시 놓고 토양으로 세균된 묘를 전송 합니다.
   참고: 토양에 모 종 뿌리를 삽입 하 고 뿌리를 손상 하지 마십시오. 투명 한 플라스틱 커버와 하룻밤 습도 유지 하기 위해 트레이 커버.
5. 16 h/8 h 명암 주기 및 70% 습도에 제어 성장 방에 식물을 성장 한다. 7 주....

결과

세 가지 주요 단계 단백질 단백질 상호 작용에서 vivo에서, 식물 성장, luciferase 분석 결과, 담배 침투 등 공부에 대 한이 luciferase 보완성 프로토콜에 점찍어 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 액체 A. tumefaciens 명. benthamiana 잎 (그림 1)에 침투 하는 것은.

여기에 jasmonate COP1-SPA1 상호 작용을 감소를 확인 하는이 기술의 유용의 예가입니다. Luciferase 아미노 터미널과 carboxyl 터미널 반 COP1 융합 했다 (COP1-NLuc) 또는 SPA1 (CLuc-SPA1), 각각. COP1-SPA1 상호 작용 기능 luciferase 보완성에 결과. Luciferase .......

토론

여기에 설명 된 프로토콜은 간단 하 고 vivo에서 단백질-단백질 상호 작용, 공부에 대 한 재현 고 외 인 치료에서 단백질 상호 작용 역동성을 감지 하는 데 특히 적합. 이 분석 결과 주요 단계 명. benthamiana 침투입니다. 성공을 보장 하기 위해 침투, 식물 매우 건강 해야 합니다. 또 다른 중요 한 요인은 침투 후 luciferase 활동을 확인 하는 시기입니다. 이 질문에 대 한 정확한 대답이 있다. 연구원은 다른 일은 luciferase 높은 수준에서 표시 됩니다 때 우리가 관찰 시간⁸변동 단백질 표정 수준 때문에 판단에 침투 후에 luciferase 활동을 모니터링 하는 것이 좋습니다.

그것은 가능한 아무 발광 실험에서 검색 될 수 있습니다. 적절 한 컨트롤 없이 false 네거티브를 제외할 수 없습니다. 전체 길이 luciferase 제어는 침투와 luciferase 탐지 작동을 증명.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
<강한>변환 솔루션
10 mM 모르폴린에탄술폰산	VETEC	V900336
27.8 mM 포도	VETEC	V900392
10 mM MgCl2× 6H2O	VETEC	V900020
150 &뮤; M 아세토시링곤	알드리치	D134406
pH 5.7
Luciferin 작동 완충액
5 mM Luciferin 칼륨 염	GOLD BIOTECHNOLOGY	LUCK-100
0.025% Triton X-100	VETEC	V900502
H2O to 10 ml

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