이 프로토콜 wholemount 쥐 망막에서 생체 외에서 신경 전달 물질 글루타민 산 염의 화학 신경의 형태를 조사 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 화학 신경 망막의 포토 리셉터 퇴행 성 질환으로 인 한 돌이킬 수 없는 실명을 치료에 대 한 기존의 전기 통제에 유망한 대안 이다.
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방법 논문
쥐 망막 신경 전달 물질 글루타민 산 염에 체 외에서 의 생체 모방 화학 Neuromodulation 위한 방법론
이 논문에서
요약
초록
포토 리셉터 퇴행 성 질병 망막에 포토 리셉터 세포의 진보적인 손실 통해 돌이킬 실명을 일으킬. 망막 어 두 음 첨가 인위적으로 환자에 이해할 수 있는 시각적 인식을 도출의 희망에서 살아남은 망막 신경 세포를 자극 하 여 비전을 복원 하는 포토 리셉터 퇴행 성 질환에 대 한 신흥 치료. 현재 망막 prostheses 전기 망막을 자극 하지만 높은 시력, 환자에 게 자연의 비전을 복원에 상당한 물리적 장벽을 얼굴에 전극의 배열 사용 하 여 환자에 게 제한 된 비전을 복원에 성공 설명 했다. 기본 신경 전달 물질을 사용 하 여 화학 신경 biomimetic 전기 대체 자극 이며 전기 통제를 사용 하 여 망막 어 두 음 첨가와 관련 된 근본적인 한계를 우회할 수 있습니다. 특히, 화학 신경은 신경 전달 물질, 망막에서 사용 하는 통신의 같은 자연 대리인의 아주 소량을 주입 하 여 환자에 필적 하거나 더 나은 visual acuities와 더 많은 자연의 비전을 복원 가능성이 있다 화학 synapses 현재 전기 무생물 보다 훨씬 미세한 해상도에. 그러나, 상대적으로 미개척된 자극 패러다임으로 시험관에서망막의 화학 자극을 달성 하기 위한 아무 설립된 프로토콜이입니다. 이 작품의 목적은 망막의 화학 neuromodulation의 잠재적인 또는 이와 유사한 공부 하고자 수 사관에 대 한 망막의 화학 자극을 달성을 위한 구체적인된 프레임 워크를 제공 하는 신경 조직 체 외. 이 작품에서 우리 실험 설치 및 망막 신경 절 세포 (RGC) 스파이크 응답 비슷한 시각적 빛 응답 야생-타입에서 도출을 위한 방법론을 설명 하 고 주입 하 여 포토 리셉터 전락 wholemount 쥐 망막의 볼륨 제어 유리 micropipettes를 사용 하 여 사용자 지정 멀티 미세 장치 subretinal 공간으로 신경 전달 물질 조미료. 이 방법론 및 프로토콜 충분히 일반적인 neuromodulation 다른 신경 전달 물질 또는 다른 신경 조직을 사용 하 여 적용할 수 있습니다.
서론
포토 리셉터 퇴행 성 질환, 망막 화 등 나이 관련 황 반 변성 시력 상실의 상속 가능한 원인을 선도 하 고 현재 불 치1,2. 비록 이러한 질병은 특정 유전자 변이의 다양 한에서 발생, 포토 리셉터 퇴행 성 질환 결국 실명을 일으키는 망막에 포토 리셉터 세포의 진보적인 손실 그룹으로 특징입니다. 망막에 걸쳐 개장 하지만 살아남은 망막 신경 세포, 양극 세포와 RGCs를 포함 하 여 광범위 한 대뇌 트리거의 손실 남아 그대로 포토 리셉터 변성3 의 고급 단계에도 상대적으로 기능 ,45,,67.
기계 장치 그리고 이러한 질병의 병 리 잘 특징된3,,45,,67 하지만 효과적인 치료 하기 어려운 남아 있다. 지난 3 년간 전세계 연구자 포토 리셉터 퇴행 성 질병 유전자 치료8, 줄기 세포 치료9를 포함 하 여 영향을 받는 이들에 게 비전을 복원에 대 한 치료 치료의 다양 한 조사 망막 이식10, 그리고 살아남은 망막 신경 세포의 인공 자극11,12 . 이들의 가장 임상적으로 사용할 수는 전통적으로 전기의 목표와 특정 패턴에 양극 세포 또는 RGCs 자극 전극의 배열 활용 인공 신경 장치는 망막 어 두 음 첨가 환자11인공 시각 인식 만들기 아르고스 II13 알파 IMS14 장치, 등 현재 세대 전기 prostheses 임상 승인을 달성 하 고 그들은 향상 시킬 수 있는 삶의 질 환자에 대 한 복원 하 여 예비 연구 표명를 (망막) 다시 망막 (망막의 앞면) 프런트 및 subretinal를 사용 하 여 비전의 측정 장치15,16이식. 전 세계 연구 단체는 이러한 1 세대 장치17,,1819,20 의 성공 넘어 망막 prostheses 발전에 노력 하지만 직면 전기 족 환자에 게 법적 실명 수준 높은 시력 비전을 복원의 설계는 어려움 최근 연구는를 안전 하 게 자극 큰 전극의 사용을 필요로 달성 공간 해상도 보다 높은 해상도 현재 세대에 의해 활성화 기반 전기 prostheses 충전 주입 제한 때문에 도전 이다, 공간 해상도, 즉 시력11,21비용 하는 망막 신경 또한, 전기 자극은 더 크게 하기 때문에 그것은 본질적으로 부자연 스러운 자극 패러다임21때문에 일반적으로 모든 주변 세포를 자극 하 고 따라서 환자, 부자연 스러운 및 혼란 인식 elicits 제한. 그럼에도 불구 하 고, 전기 자극의 초기 성공 그 인공 신경 포토 리셉터 퇴행 성 질환에 대 한 효과적인 치료 될 수 있다 설명 했다. 이것은 훨씬 더 효과적인 치료는 신경 전달 물질 화학 물질, 화학 시 냅 스에서 통신의 자연 대리인과 망막을 자극 하 여 달성 될 것을 가설을 하나. 이 문서에 소개 된 방법의 목적은 biomimetic 대체 전기 자극으로 망막 신경 세포 간의 시 냅 스 통신의 자연 시스템을 모방 하고자 화학 자극의 치료 가능성을 탐구 하는 대 한 망막 족.
화학적으로 활성화 대상 망막 신경 세포는 미세를 통해 출시 하는 조미료 같은 네이티브 신경 전달 물질의 소량에 의존 하는 화학 망막 족을 치료 화학 자극의 개념의 번역 시각적 자극에 대 한 응답에서 microports의 큰 배열을 구성 하는 장치. 이 방법에서는, 화학 망막 족 본질적으로 생체 모방 인공 포토 리셉터 레이어 자연스럽 게 화학 신호를 망막에 도달 하는 광자를 변환 하는 것입니다. 이러한 화학 신호 정상 망막 신호에서 동일한 신경 전달 물질을 사용 하 여 고 정상 시각 경로, 결과 표시에 사용 되는 동일한 시 냅 스 경로 통해 퇴 화 된 망막의 살아남은 망막 신경 세포를 자극 화학 망막 족을 통해 달성 하는 인식 더 자연스럽 고 이해할 수 있는 전기 족을 통해 갖는 것 비교 될 수 있습니다. 또한, 매우 작고 높은 밀도, 전극, 달리 기준점과는 신경 전달 물질 풀어 microports를 만들 수 있습니다 이후 잠재적인 화학 보 수도 더 초점 자극을 얻을 수 및 높은 공간 해상도 전기 족 보다입니다. 따라서, 이러한 잠재적인 이점을 바탕으로, 화학 망막 족 전기 무생물에 대 한 매우 유망한 대안을 제공 합니다.
그러나 화학 자극은 망막의,는 비교적 작은 탐험 되었습니다 최근까지. 망막의 전기 자극을 잘 작업 에 체 외22,23, vivo에서23,24, 그리고 임상 연구13 년간 특징 되었습니다 동안 ,14, 화학 자극에 대 한 연구는 몇 가지 생체 외에서 작품25,26,,2728에 독점적으로 제한 되었습니다. Iezzi 및 Finlayson26 및 Inayat 외. 27 는 망막에서 생체 외에서 를 사용 하 여 단일 전극과 multielectrode 배열 (MEA), 각각, 망막 신경의 조미료 갖는 응답의 화학 자극을 망막 프런트 시연. 더 최근에, Rountree 외. 28 subretinal 측면과 MEA에서 조미료를 사용 하 여 망막에 여러 사이트에서 신경 응답에 망막 통로의 차동 자극을 시연 했다.비록이 작품은 화학 자극의 타당성 설립 예비는, 더 연구는 많은 조사에 필수적인 측면 그 넘어이 접근의 해결 까지는25,,2627 , 28, 위에서 설명한 대로 화학 망막 족에이 개념을 번역 하기 전에 생체 외에서 그리고 vivo에서 동물 모델에서 치료 자극 매개 변수를 조정 하 고. 그러나, 현재 문학에서 망막의 화학 자극을 달성을 위한 아무 설립된 방법론 이며 이전 작품에 사용 되는 방법을 일차 연구는 필수적인 것으로 상세히에서 설명 하지 되었습니다. 따라서,이 방법 종이 대 한 근거 중 우리의 이전 연구27, 복제에 관심이 그 조사에 대 한 망막의 시험관에 화학 자극을 실시 하기 위한 잘 정의 된 프레임 워크를 제공 하는 것입니다. 28 또는 추가 화학 통제의이 초기 개념 발전.
여기 wholemount 망막 야생-타입 쥐와 밀접 하 게 포토 리셉터 퇴행의 진행을 모방 하는 포토 리셉터 퇴 화 한 쥐 모델에서에서 망막 신경 세포의 체 외에 화학 자극을 실시 하는 방법을 보여 줍니다. 인 간에 있는 질병. 다양 한 자극 매개 변수의 치료 범위를 평가 하 고 것이 불가능 하거나 에서 관찰 하기 어려운 신경 응답 특성을 연구 하는 생체 외에서 모델에이 자극 방법을 개발 뒤에 있는 근거 vivo 모델, 특히 초기 연구 중에 초점을 맞춘이 접근 방법의 타당성을 평가. 이 절차에서 우리는 상업적으로 사용할 수 있는 단일 포트 유리 micropipettes 및 사용자 지정을 통해 대상 망막 신경 근처 1mm 조미료의 소량을 제공 하 여 망막의 단일 사이트와 동시 다중 사이트 화학 stimulations를 보여줍니다. 휘트스톤 다중 포트 미세 장치, 각각. 단일 사이트, 다중 사이트 stimulations 화학 neuromodulation의 치료 타당성 조사의 기본 목적을 수행 하는 동안 각각 독특한 이점을 가진 뚜렷한 목적을 제공 합니다. 단일 사이트 자극, 상용 미리 가져온된 유리 micropipettes 함께 수행할 수 있습니다, 단일 사이트에서 망막의 표면에 직접 화학 물질을 주입 하 사용할 수 있으며 관찰 RGC 스파이크 속도 하는 경우를 조사 하는 역 유사한 시각적으로 갖는 빛 응답 응답 사출 사이트 focally elicited 수 있습니다. 다른 한편으로, 특수 가공된 멀티 미세 장치 필요, 다중 사이트 자극 망막의 표면에 여러 사이트에서 공간적으로 화학 물질을 주입 하는 데 사용할 수 있습니다 하 고 얼마나 잘 조미료 갖는 RCG 조사 하는 역 응답 패턴 패턴 자극 연구에 조미료 주입 패턴에 해당합니다.
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프로토콜
모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 국가 연구 위원회의 가이드에 의해 제시 된 지침에 따라 실시 했다. 동물 취급 및 안락사 프로토콜 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 시카고에 일리노이의 대학에 의해 승인 했다.
1. 동물 모델
- 야생-타입 긴 에반스 쥐
- 표준 12 h 주/야 리듬으로 제기 하거나 섹스의 24-32 일 이전 야생-타입 긴 에반스 두건이 있는 쥐를 조달.
- 다크는 실험 시작 전에 1 시간에 대 한 완전히 어두운 방에 배치 하 여 쥐를 적응.
- S334ter-3 쥐
- 유전자 변형 흰둥이 homozygous S334ter 3 쥐 선을 (중 성별), 포토 리셉터 변성 하는 안료 heterozygous S334ter 3 쥐를 생산 하는 안료 야생-타입 긴 에반스 쥐와 돌연변이 rhodopsin 유전자의 두 복사본을 표현 인간의 망막 화29,30진행에 유사 합니다.
- 표준 12 h 주/야 리듬 heterozygous 자손을 올리고 어느 섹스의 쥐를 사용 하 여 다음 포토 리셉터 변성 단계에 해당 하는 다음 연령의 실험: 초기 단계 변성: 14-20 일; 중간 단계 변성: 21-27 일; 늦게 단계 변성: 28-35 일; 완전히 장 님: > 50 일.
- 다크는 실험 시작 전에 1 시간에 대 한 완전히 어두운 방에 배치 하 여 쥐를 적응.
2. 임의 중간 솔루션 및 관류 시스템 준비
그림 1: 실험적인 체제의 도식. 유리 제 micropipette (A) 및 사용자 정의 멀티 포트 미세 장치 (B)를사용 하 여 화학 자극에 대 한 실험적인 체제의 회로도 망막은는 pMEA에 놓이고 신선한 산소 임 중간 솔루션에서 모두 위아래 pMEA 구멍을 통해 지속적으로 끼얹는다. 신경 응답 신호는 pMEA의 전극에 의해 선택 데이터 수집 컴퓨터에 MEA 증폭기를 통해 먹인 다. 시각 및 화학 자극은 각각, 녹색 LED와 8 채널 압력 인젝터를 사용 하 여 수행 됩니다. 및 두 자극 또한 정밀 3 축 통해 피 펫을 배치 하는 데 사용 되는 전용된 자극 컴퓨터에 의해 실행 됩니다. micromanipulator입니다. 거꾸로 현미경 실험 동안 망막을 관찰 하는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 실험적인 체제. 모든 부품의 상대적 위치를 보여주는 완전 한 실험적인 체제의 (A) 사진. MEA 앰프 시스템은 거꾸로 현미경, 시각 망막을 검사 하 고 디지털 실험 기간 동안 연결 된 고속 카메라를 사용 하 여 장치-망막 인터페이스를 이미지 하는 데 사용 되는 위에 배치 됩니다. 위쪽 및 아래쪽 관류는 독립적으로 제어 하지 관류 솔레노이드 제어 시스템을 사용 하 여. 사출, 위치 제어 및 임피던스 측정 압력 인젝터, micromanipulator, 및 패치 클램프 증폭기를 사용 하 여 수행 됩니다 (오렌지 상자; B에서 자세히 표시), 각각. Micropipette 또는 장치 임피던스 측정을 위한 패치 클램프 headstage에 삽입 되 고는 갠트리에 장착 (녹색 상자에 표시 된, C에서 자세히 표시)는 micromanipulator를 사용 하 여 위치를 촉진 하기 위하여. (B)는 실험에 사용 된 측정 및 제어 계기의 클로즈업: 8 채널 압력 인젝터, micromanipulator 제어 시스템, 임피던스 측정에 대 한 패치 클램프 증폭기 및 관류 제거에 대 한 흡입 용기. (C) 다중 포트 장치를 보여주는 주입 시스템 갠트리의 클로즈업 피펫은 홀더, 패치 클램프 headstage와 micromanipulator 인터페이싱. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 관류 설치. 최고의 관류 및 흡입 뿐만 아니라 시각적 빛 자극을 위해 사용 하는 녹색 LED의 위치를 보여주는 MEA 앰프의 상단 (A) 사진. (B) 최고의 관류 및 흡입, pMEA, 고 임피던스 측정에 사용 되는 참조 전극의 정확한 위치를 보여주는 pMEA 관류 챔버의 클로즈업. (C) 바닥판 관류의 photomicrograph. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
참고: 그림 1, 그림 2및 그림 3
- 실내 온도 (~ 21 ° C)에 드 이온된 물 900 mL에 밖으로 측정 하 고 1 L 용기에 배치.
- 물 100% CO2 버블링 메커니즘을 사용 하 여 perfuse.
- 물 1 L 용기에 가루 임 매체의 8.8 g를 추가 합니다.
- 씻어 가루 임 매체의 모든 흔적을 제거 하 여 1 L 컨테이너에 추가 드 이온 물 몇 mL와 함께 임 중간 컨테이너.
- 1 L 용기를 탄산 솔루션 (7.5 %w / v31)의 25.3 mL를 추가 합니다.
- 1 나의 최종 볼륨을 솔루션을가지고 추가 물 추가
- 약 5 분 CO2 물 perfusing를 계속 합니다.
- CO2 관류를 중지 하 고 95% O2 , 5% CO2 또는 pH 7.4에 안정화 될 때까지 적어도 30 분의 의료 학년 가스 혼합 솔루션 perfusing 시작.
참고:이 프로토콜의 목적을 위해 임 매체 실 온에서 (~ 21 ° C)에서 outgassing, CO2 또는 O2 를 방지 하기 위해 실험을 통해 기포와 관류 라인을 막다 수 있는 유지 됩니다. - 70% 에탄올으로 작성 하 여 아래와 위쪽 관류 튜브를 청소 하 고 두 라인 드 이온된 물으로 3 회 세척. 하단 라인 드 이온된 수와 공기 최고 라인을 채우십시오.
3. Wholemount 망막 준비
그림 4: 망막의 해 부 및 wholemount 준비. 포토 리셉터 전락 동물에서 가져온 그대로 아이피의 (A) 사진. 그것을 밖으로 평평 하 게 경도 인하와 함께 망막의 (B) Photomicrograph (C) 망막, 병합 후 그것 메쉬 문의 포토 리셉터 사이드 메쉬 격자에 배치 되며 (관류 중간) 외부 공기에 거기 되도록 평평 주름 또는 컬된 가장자리. (D) 메쉬 및 망막 신속 하 게 전송는 pMEA 전극 연락 신경 절의 세포 쪽 이며 즉시 산소 임 매체 끼얹는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 천공된 multielectrode 배열. 프로토콜에 사용 되는 천공 multielectrode 배열 (A) 사진. 망막은 산소 임 매체와 지속적인 관류 있도록 pMEA 챔버 내 전극 배열 (B에서 자세히 표시 되는 빨간색 사각형으로 표시)에 배치 됩니다. (B) 전극 배열 전극 사이 구멍의 배치를 보여주는 자체의 photomicrograph. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
참고: 그림 4 와 그림 5
- 희미 한 붉은 조명을 제공, IACUC 프로토콜에 따라 이산화탄소 질 식 자 궁 경부 전위 또는 다른 선택한 메서드를 통해 동물을 안락사를 휴대용 빨간색 LED 손전등을 사용 합니다.
- 보석의 #5 집게를 사용 하 여 두 눈을 enucleate 하 고 약 3-4 mL 신선한 산소 임 중간 솔루션으로 60mm 직경 페 트리 접시에 enucleated 눈 장소.
- 빨간색 필터 화면 덮여 위쪽 및 아래쪽 illuminators와 해 부 stereomicroscope 통해 눈을 관찰, 메스 또는 날카로운가 위를 사용 하 여 각 막 얼굴에 작은 절 개를 하 게.
- 각 막의 가장자리에이 작은 절 개에서 자르십시오 다음 각 막의 전체 가장자리 주위 원주 섹션에서 컷을 확장 합니다. 렌즈, 반투명 수성 및 유리 humors 함께 지금 분리 된 각 막을 제거 합니다.
- 부드럽게 잡고 집게, 한 쌍으로 아이피는 신중 하 게는 아이피의 반대 측에 2 개의 작은 절 개를 확인 합니다. 다음, 집게의 두 쌍을 사용 하 여 부드럽게 각 절에 아이피 떨어져 당겨 하 고는 공 막에서 망막 분리. 천천히 sclera 및 아이피에서 전체 망막을 들어올립니다. 아직 연결 된 경우 시 신경 절단.
- 절반 또는 위를 사용 하 여 분기 섹션을 망막에 경도 상처를 확인 하 고 부드럽게 확산 나일론 메쉬 (100 µ m 스레드 직경 여 350 µ m)에 한 망막 섹션 메시에에서 신경 절 세포 (망막의 오목한 쪽) 연결.
- 메쉬와 망막 신경 절 세포 pMEA 표면 접촉 구멍된 multielectrode 배열 (pMEA)에 배치 합니다. 다음 부드럽게 장소에 망막을 잡아 메쉬 위에 가중치 슬라이스 그리드를 배치 합니다.
4. MEA 및 데이터 수집 설정
그림 6: pMEA 수준의 소음. (A) 높은 지속적인 소음을 전시 pMEA 전극의 부분 집합의 대표 기록. 이 잡음은 보통 pMEA 접촉 패드와 얇은 천공된 구체의 층의 정상적인 착용 결과로 MEA 증폭기의 핀 사이의 적절 한 접촉의 부족 접촉 패드에 특히 pMEA에. 잡음의 다른 가능한 소스는 일반적으로 솔루션 pMEA 앰프 접촉 패드에 유출. 가난한 핀으로 인해 지속적인 소음 문의 또는 솔루션 패드 pMEA 더 접촉 및 청소 및 건조 패드, 각각 증폭기 내에서 위치를 이동 하 여 일반적으로 수정할 수 있습니다 연락처를 유출. 소음 청소 또는 pMEA 위치 이동에 의해 삭제 될 수 없습니다, 경우는 pMEA 완전히 교체 해야 합니다. (B) 잡음 레벨에서 pMEA와 증폭기 사이 좋은 접촉을 가진 깨끗 한 pMEA pMEA 전극의 하위 집합에서의 대표 기록. 일반적으로, 평균 소음 레벨은 같은 µ V. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
참고: 그림 6
- 희미 한 붉은 조명 아래 pMEA MEA 앰프에 놓고 앰프 래치를 닫습니다.
- 참고 표 이미 pMEA 챔버 링에 존재 하지 않습니다, 만약 두 명의 'X' 엣지-모양의 마크 붐 스탠드 장착 된 현미경으로 약 5 mm 떨어져 지역에서 쉽게 볼 수 있는 간격.
- PMEA 챔버 내부 최고 관류 콘센트를 놓고 가기 관류 밸브 분당 약 3 mL의 관류 속도를 설정 합니다. 원하는 perfusate 수준 (~ 5 m m 깊은)에서 최고 흡입 입구를 놓고 작동 하는지 확인 합니다.
- 데이터 수집 컴퓨터에 데이터 수집 소프트웨어를 열고 데이터를 수신 하려면 '재생' 버튼을 클릭 합니다. 모든 pMEA 채널 잡음이 녹음 신경 신호 인지 확인 합니다.
- 거꾸로 현미경 시야의 라이브 디지털 이미지는 모니터에서 보고, 증거 솔루션 관류 바닥판에 흐르는 pMEA의 하단 표면을 관찰 합니다.
5. 조미료 자극 준비
그림 7: 유리 제 micropipette 및 멀티 미세 장치. (A)는 micropipette 또는 장치를 삽입 하기 전에 피 펫 홀더. 염화 전극 (50 µ m 직경) 패치 클램프 headstage와 인터페이스에 끝에 어댑터를 전기 결합 이다. (B) 유리 제 micropipette의 사진 공 압 주사를 시작 하는 데 사용 하는 압력 포트의 위치를 보여주는 피 펫 소유자와 인터페이싱. (C)는 사용자 지정 멀티 미세 장치 (1cm 1cm 0.134 cm) 사용자 지정 3D 인쇄 고정 물에 연결 된 및 스테인레스 스틸 튜브를 통해 피 펫 소유자와 인터페이스. 장치는 2 개의 층에서 조립 되었다, 하단 레이어 (340 µ m 두께)와 8 개의 내장 저수지에서 8 microports (직경 14 µ m)는 (직경 1.6 m m) 꼭대기 층 (두께 1 m m)에 조미료를 저장 하기 위한. 장치의 아래쪽 계층에서 8 microports의 각 독립적으로 하지-평면 아닌 통해 상위 계층에서 내장 저수지에 연결 되어 있고 차례로 각 칩에 저수지를 통해 8 채널 압력 인젝터의 압력 포트에 연결 된 꽃무늬 multisite 주사에 대 한 microports의 독립적인 작동을 허용 하도록 유연한 튜브. (D) 다중 포트 장치 8 독립적으로 주소 지정이 가능한 내장 저수지와 튜브 후미의 배치를 보여주는 튜브 인터페이스 고정 장치를 부착 하기 전에 핀셋에 의해 개최의 클로즈업. (E)는 pMEA의 전극으로 200 µ m 간격을 가진 3 x 3 구성에서 배열 하는 8 14 µ m 직경 microports를 보여주는 장치 아래쪽의 photomicrograph. Microports 외부 8 중앙 포트 장치의 제작 하는 동안 정렬에 대 한 엄격 하 게 사용 되었다 하는 동안 다중 사이트 주사에 대 한 활용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
주: 그림 7을 참조 하십시오.
- 1mm 조미료의 작업 농도에 0.5 mL 샘플을 얻기 위해 주식 조미료 solutionwith 산소 임 중간 솔루션을 혼합 하 여 조미료 솔루션을 준비 합니다.
- 신중 하 게 미리 뽑아 10 µ m 직경 micropipette 또는 표준 피 펫 홀더 포함 된 50 µ m 직경은 염화 와이어 전극으로 멀티 포트 미세 장치에 연결 된 스테인리스 막대를 삽입 합니다.
참고: 임피던스 감지를 사용할 수 없는 경우은 염화 와이어 전극 생략할 수 있습니다. - 인터페이스 패치 클램프 headstage와 피 펫 홀더 유리 제 micropipette, 활용 하는 경우 압력 주입 체계의 1 채널 피 펫 소유자의 압력 포트 luer 연결 연결 또는 연결의 각각의 압력 포트 luer 연결 압력 분사 시스템, 멀티 포트 장치를 사용 하는 경우 1-8 채널 8 주입 포트.
- 수동으로 압력 분사 시스템을 설정 하 고 설정 채널 1 (또는 해당 되는 경우 채널 1-8). 시스템은 대기로 배출 하 고 0.1 psi에 사출 압력을 설정 확인 하십시오.
- 켜고 micromanipulator 조작 컨트롤러에서 '보정' 버튼을 누르면 그것을 교정. 위치는 micromanipulator는 micropipette 팁 (또는 해당 하는 경우 장치의 하단) 나 앰프 위에 약 30 m m.
- 조미료 솔루션 (표준 임 중간에 1mm 조미료) 작은 페 트리 접시와는 micromanipulator 아래 놓습니다. 압력 주입 시스템 (H2O-13의 흡입 압력)에서 '채우기' 버튼을 누르면 micropipette 팁 (또는 장치) 솔루션 및 채우기 낮은 솔루션의 약 20 m m 유리 제 micropipette에서 볼 수 있다 때까지 또는 멀티 포트 장치 튜브입니다.
- 멀티 포트 장치를 사용 하 여 오프 압력 인젝터의 채널 1을 설정 하 고 채널 2-8에 대 한 프로토콜을 반복 합니다. Micropipette 팁 또는 장치 솔루션에서 페 트리 접시를 제거 들어올리고는 micromanipulator pMEA 챔버 위에 위치 합니다.
- 붐 스탠드 마운트 stereomicroscope를 사용 하 여 맞춥니다 micropipette 팁 또는 장치의 모서리 pMEA 챔버 링에 새겨져 참고 표. '저장소 참조 A'와 ' 저장소 참조 B' 단추를 사용 하 여 제어 소프트웨어에 조작 위치를 저장 (또는 단순히 수동으로 조작 좌표를 참고) 지도 pMEA 전극 가진 조작의 좌표 시스템을.
- 조작 제어 소프트웨어를 사용 하 여 강력한 자발적인 활동 대상 pMEA 전극 선택 하 고 유리 micropipettewith 대상 전극에 맞게 '채널 이동' 버튼을 클릭 합니다.
6. 망막와 인터페이스
- 임피던스 측정을 사용할 수 있는 패치 클램프 앰프 설정 하 고 피펫으로 홀더 안쪽은 염화 전극의 임피던스를 시각화 하기 위해 '시작' 버튼을 클릭 하 여 임피던스 시각화 소프트웨어를 시작. 관찰 하는 동안 실시간으로 임피던스 신호를 천천히 낮은 micropipette 또는 장치 임피던스의 급속 한 증가 의해 표시 된 대로 그것은 망막 표면에 연결 될 때까지 신호 ( 그림 8참조). 저장 하거나 망막 표면의 위치를 기록 합니다.
- 임피던스 측정에 사용할 수 없는 경우 검색 시각적 관찰을 통해 망막 표면 접촉이 덜 정확 하 게 될 것입니다. 낮은 피 펫 또는 장치 가시 MEA 챔버에 임 중간 솔루션의 위쪽 표면 연결 때까지.
- 다음, 거꾸로 현미경으로 망막의 상단을 관찰 하면서 천천히 낮은 피 펫 또는 장치는 망막의 위쪽 표면 가시 왜곡, 접촉 망막 표면으로 수행 되는 때까지. 저장 하거나 망막 표면의 위치를 기록 합니다.
- 표면 자극에 대 한 피 펫 더 낮은 40 µ m (S334ter-3 망막)에 대 한 또는 70 µ m (야생-타입 망막)에 대 한.
- 압력 주입 (0.1 psi) 시스템을 사용 하 여 셀 근처 micropipette 팁 또는 장치 microports는 데이터 수집으로 신경 신호를 관찰 하 여 조미료 자극을 수용 하는 몇 가지 짧은 기간 (10-30 밀리초) 주사 수행 소프트웨어입니다.
참고: 성공적인 주사는 명확 하 게 보이는 스파이크 속도 버스트 또는 스파이크 금지를 이끌어내는 것입니다 ( 그림 9참조). 응답을 관찰 하는 경우 다른 전극에 micropipette 또는 장치를 재조 정할.
그림 8: 임피던스 측정. (A)는 회로도의 임피던스 측정 기법 패치 클램프 증폭기를 사용 하 여는 micropipette의 임피던스는 지속적으로 모니터링으로 망막 표면 쪽으로 천천히 낮춘 다. micropipette 망막 위에 때 임 매체의 상대적으로 높은 이온 전도도 낮은 임피던스에에서 발생 합니다. 으로 micropipette 망막 표면 접촉, 염화는 와이어를 통해 이온 전도도 감소, 측정된 임피던스에 있는 급속 한 증가 일으키는. (B) 임피던스 변화를 표시 하는 음모 기록 직전과 망막 표면 피 펫 팁의 접촉 후. 측정 된 임피던스가 상대적으로 낮은 micropipette 팁 솔루션에 있을 때 연락처 (왼쪽에 주황색 영역으로 표시) 직전. 연락처 (빨간 화살촉을 오른쪽에 녹색 지역에 의해 표시 된)는 일단, 임피던스 망막 조직을 접촉 시 감소 이오니아 전도도 때문 빠르게 증가 합니다. 실제로, 망막 표면 높이 해당 하는 측정 된 임피던스 (빨간 화살촉의 위치)의 가파른 상승의 발병으로 등록 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: 시각, 자연, 동안 신경 활동의 전극 녹음 및 조미료 주입 기록. 하이 패스를 보여주는 9 pMEA 전극에서 (A) 대표적인 녹음 각 사각형 독특한 전극에서 신경 데이터를 보여줍니다 녹색 LED와 시각적 빛 자극 동안 전극 데이터 필터링. 각 전극 녹음 왼쪽된 y 축에 표시 된 일반적인 전압 규모와 녹색 LED (타이밍 각 플롯에서 오렌지 화살표와 함께 표시)에 설정한 후 첫 번째에 수집 된 데이터를 보여 줍니다. 스파이크-18 µ V (수평 각 전극 플롯에 레드 라인)의 임계값 전압을 사용 하 여 확인 하 고 녹색 전극 데이터 검은 추적으로 표시 됩니다. 시각적 자극 빛에 대 한 금지 응답을 보유 한 최고의 센터를 제외 하 고 모든 전극에 스파이크 (여기)의 파열을 발생 합니다. (B) visual 또는 주입 자극 없이 자발적인 신경 활동을 보여주는 동일한 전극에 대 한 비슷한 줄거리. 비록 작은 파열 했다 존재, 스파이크의 패턴 매우 다르다 시각적 자극에 응답에 기록 했다. (C) 전극의 동일한 하위 집합에서 대표적인 녹음 중앙 전극 (타이밍 각 플롯에 오렌지 화살촉으로 표시)에서 조미료 주사 후 즉시 기록. 주입 된 조미료 시각적으로 갖는 스파이크 버스트 매우 유사 했다 중앙 전극에 한 버스트 elicited. 다른 모든 전극 화학 자극 기법의 좋은 공간 해상도 보여 주는 조미료 주입에 의해 영향을 하지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
7. 망막 기록 및 자극 프로그램 시작
- 망막의 윗 표면으로 녹색 LED의 방향을 정하십시오. 파일 이름을 입력 하 고 "기록" 버튼을 클릭 하 여 전용된 녹음 컴퓨터에 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여 녹음을 시작 합니다.
- 녹음을 시작 하는 자극 제어 프로그램을 열고 "읽기 자극 파일" 버튼을 클릭 하 여 기본 자극 파일을 로드 합니다. 다음, 아래 설명한 자극 및 데이터 수집 프로토콜의 구성 된 기본 자극 파일을 시작 하려면 "자극 파일 실행" 버튼을 클릭 합니다.
참고: (i) 30 재판 2 s 및 2 s OFF 전체 필드 플래시 (5 lm/m2 강도) 녹색 LED를 사용 하 여. (ii) 120 s 비슷한 날짜 표시줄을 통해 망막의 자발적인 활동을 기록 하는 녹색 LED를 사용 하지 않고 데이터의. (iii) 1 이상의 조미료 주사 10-30 ms 주입 (주입 당 약 100-300 pL) 시간으로 0.1 psi와 3 s interpulse 기간에서 조미료 주사의 30 시험의 구성의 세트. 멀티 사이트 주사의 경우 동시에 주사를 2 개 이상의 포트를 선택 합니다.
그림 10: 비주얼, 자연, 그리고 조미료 응답의 Peristimulus 히스토그램. (A) 대표 peristimulus 히스토그램 (30 ms binwidth) 그림 9A에 전극의 하위 집합에서 스파이크 데이터의 시각적인 가벼운 자극의 20 시련에 걸쳐 평균. 일반적인 스파이크 속도 규모 모든 전극에 적용 된 고 왼쪽된 y 축에 표시 됩니다. 각 전극 플롯에 검은 선이 녹색 LED를 켠 후 첫 번째 동안 기록 모든 스파이크에 대 한 평균 스파이크 속도를 나타냅니다. 볼 수 있는 시각 자극 상단 중앙 전극, 빛에 대 한 임시 금지 응답 했다를 제외 하 고 모든 전극에서 과도 흥분 성의 스파이크 속도 응답을 발생 합니다. (B) 평균 자발적인 스파이크 속도 응답 어떤 시각적 또는 화학적 자극 없이 동일한 전극에 기록. 자극 없이 스파이크 각 전극에 대 한 요금은 비교적 일정 합니다. (C) 평균 스파이크 속도 응답 중앙 전극 위에 위치에 조미료 주입에 대 한 응답에서 같은 전극에서 기록. 분명만 과도 응답 주사 사이트에서 직접 전극에 흥분 성의 응답이 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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결과
이 프로토콜 화학적으로 자극 하는 정상, 야생-타입 망막 뿐만 아니라 포토 리셉터를 사용할 수 있는 실질적인 셀룰러 개장은 대뇌의 손실에 의해 발생에 불구 하 고 망막 퇴 화. 전락 중 포토 리셉터와 함께 실험을 시작 하거나 야생-타입 망막, 기록 및 자극 장비 (그림 1 및 그림 2) 필요가 준비 될 및 pMEA (그림 5)을 최소화 하기 위해 청소 해야 하기 전에 각 전극 채널 (그림 6)에 잡음. 포토 리셉터 전락 비록 망막은 얇고 따라서 야생-타입 망막 보다 더 섬세 한, 같은 해 부 절차 (그림 4) 모두에 사용 됩니다. 다음 해 부, 망막은 신중 하 게 배치 pMEA ganglion 셀 면 전극,...
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토론
여기에 제시 된 방법 어떤 점에서 망막 신경 화학적으로 망막 체 외의 표면으로 네이티브 신경 전달 물질 화학 물질을 주입 하 여 자극 하는 독특한 신경 자극 패러다임을 보여 줍니다. 이 화학 자극 기술은 기존의 전기 자극 기술, 선택도 및 대상 뉴런의 높은 초점 특이성을 포함 하 여 여러 가지 이점을 제공 합니다. 세부 정보 또는 사용자 지정 휘트스톤 멀티 미세 장치 유도 신경 전달 물질의 조미료의 볼륨 공기 주입 되는 대상 망막 신경 중 하나를 사용 하 여 근처 단일 포트 유리 제 micropipette 작은 위의 프로토콜 생리학적으로 상당한 RGC 응답입니다. 이 프로토콜은만 조미료로 입증 되었습니다, 하지만 프로토콜 남아 망막 신경 전달 물질의 다른 종류의 화학 자극을 공부 하는 데 유용. 또한,이 프로토콜을 다른 MEA 설계에 명시 된 대로 electrophysiological 녹음32 는 pMEA를 사용 하는 것이 좋습니다 동안 비 천공 종류를 포함 하 여 사용...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
종이에 표시 하는 작업 했다 국립 과학 재단, 신흥 국경 연구에 의해 지원 되 고 혁신 (NSF EFRI) 프로그램 번호 0938072를 부여. 이 논문의 내용은 전적으로 저자의 책임 하 고 반드시는 NSF의 공식 의견을 대표 하지는 않습니다. 저자는 또한 디자인 하 고 테스트 화학 자극에 대 한 초기 실험 설정 및 씨 Ashwin Raghunathan 설계, 제조, 및 평가에 사용 되는 멀티 포트 미세 장치 그의 작품에 대 한 그의 작품에 대 한 박사 Samsoon Inayat 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는.
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재료
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| pMEA 다중 채널 시스템용 하단 관류 접지판 | , GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
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| 미세 조작기 제어 시스템 | 셔터 기기, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| 갠트리 스타일 선형 슬라이드가 있는 micromanipulator 스탠드 | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
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| Zoom 실체 현미경 | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| 현미경 붐 스탠드 듀얼 리니어 볼 포함 베어링 암 | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| 줌 스테레오 현미경 (C-LEDS 하이브리드 LED 스탠드 | 포함) 니콘, 도쿄, 일본 | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| 도립 현미경 시스템 | 니콘, 도쿄, 일본 | 이클립스 Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
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| 중탄산나트륨 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
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| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, 플로리다주 새러소타 | 500247 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ | |
| 메스 핸들 #4 | World Precision Instruments, 플로리다주 새러소타 | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen 해부 가위 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| 나일론 메쉬 키트 | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
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| Ag/AgCl 기준 전극 펠릿 | 다중 채널 시스템, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
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| Zyla 5.5 sCMOS 현미경 카메라 | Andor Technology, 벨파스트, 영국 | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μ m 직경) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | |
| https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 Tygon 마이크로보어 튜빙(직경 1.6mm) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-06419-01 | |
| https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 스틸 캐뉼라 | 가 있는 틸팅 툴 홀더ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | 이들 각각이 최고 관류 및 흡입에 사용되었습니다. http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | 제조사: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux 공급 업체: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & 웨슨 갤럭시 레드 손전등 | 스미스 & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | 제조사 : https://www.smith-wesson.com/ 공급 업체 : http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, 텍사스 주 오스틴 | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
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