Method Article

Orthotopic 폐 암 세포 Engraftment의 효율성 증가 사전 조건 Bleomycin와 쥐의 기도

DOI:

10.3791/56650

⸱

June 28th, 2018

 ,  , 
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

상해 항공을 미리 조절 하 여 murine 폐에 폐 암 세포의 orthotopic engraftment를 크게 향상 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법은 또한 폐 microenvironment, 전이성 보급, 폐 암 공동 morbidities stromal 상호 작용 연구에 적용 될 수 있습니다 그리고 파생 xenografts 환자를 보다 효율적으로 생성 하.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

폐 암은 생물학적으로 이기종은 치명적인 치료 내 화 질병입니다. 이해 하 고 효과적으로 치료 흉부 악성의 전체 임상 스펙트럼, 다양 한 인간의 폐 암 하위 유형 및 단계 정리 수 추가적인 동물 모델 필요 합니다. 이식 또는 종이 식 모델 다재 다능 하 고 tumorigenic 용량에 vivo에서, murine 또는 인간 기원의 악성 세포를 사용 하 여의 정량화를 활성화. 그러나, 폐 암 세포 engraftment의 앞에서 설명한 방법 orthotopic 이식 세포는 폐로의 비 효율으로 인해 마우스의 측면 등 생리 적 비 사이트에서 수행 되었습니다. 이 연구에서 우리가 미리 섬유 증 유도 에이전트 bleomycin와 쥐의 기도 조절 하 여 orthotopic 폐 암 세포 engraftment를 강화 하는 방법을 설명 합니다. 개념 증명 실험으로 우리 쥐의 다양 한 긴장으로 마우스 또는 인간의 소스에서 얻은 폐 선 암 하위의 종양 세포를 engraft에이 접근을 적용. 우리는 0-17에서 종양 세포의 engraftment 증가 종양 세포 주입 전에 bleomycin과 항공 부상 입증 71-100% %. 상당히,이 방법은 폐 종양 발생과 이후의 파생물을 다른 모델 및 마우스 긴장을 사용 하 여 향상. 또한, engrafted 폐 암 세포 관련 먼 장기로는 폐에서 보급. 따라서, 설정 하 고 셀 또는 biospecimen의 양의 제한 폐암의 새로운 orthotopic 모델을 유지 하 고 양적 폐 암 세포 생리학 관련 설정에서의 tumorigenic 용량을 평가 하기 위해 사용할 수 있는 프로토콜 제공 .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

폐암은 주요 원인의 암 관련 사망 세계1. 폐암 환자 결국 굴복 하는 전이에서 먼 장기에, 특히 중앙 신경 조직, 간, 부 신 분 비, 및 뼈2,,34. 흉부 악성 작은 세포 폐 암 (SCLC) 또는 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC)5전통적으로 분류 되어 있다. NSCLC 이며 가장 자주 암 진단 폐 선 암 (LUAD)와 폐 편평 상피 세포 암 (LUSC)6을 포함 하 여 다른 조직학 하위로 세분화 될 수 있습니다. 절제 인간의 기본 폐 암의 게놈 분석 주어진된 histotype 내 종양 또한 다양 한 분자 섭, 더 그들의 분기 임상 진행에 기여 하 고 환자의 예 후를 혼동을 표현할 수 있는 공개 했다. 폐 암의 놀라운이 합리적인 디자인, 전 임상 테스트 및 효과적인 치료 전략의 구현에 중요 한 도전을 나타냅니다. 따라서, 다양 한 세포 기원, 분자 하위,이 질병의 단계를 공부 하 고 온순한 실험 폐 암 모델의 레 퍼 토리를 확장 하는 필요가 있다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 실험 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 예일 대학에 의해 승인에 따라 실행 되었다.

1. 설정 /는 시 약의 준비.

  1. Bleomycin
    주의: 기반에 세계 조화 시스템 (GHS) 분류와 화학 물질의 라벨, bleomycin GHS08 건강 위험으로 분류 됩니다.
    1. 화학 후드에서 bleomycin을 준비 합니다. 멸 균 인산 염의 5 mL로 15 U resuspend 버퍼링 식 염 수 (PBS).
    2. Aliquot 100-200 µ L 유리에 솔루션의 리 바이 알 및 나중에 사용-20 ° C에서 그들을 동결. 제대로 물의 resuspension의 날짜와 튜브 라벨. 이 날짜 로부터 6 개월 이내 사용 합니다.
      참고: 각 마우스 스트레인 bleomycin26에 다른 감도 있다. 각 마우스 스트레인에 대 한 bleomycin의 다른 복용량을 테스트 하는 것이 좋습니다. 마우스 긴장 및 bleomycin 대표 실험에 사용 된 해당 복용량은 표 1에 나열 됩니다.
  2. 마우스
    1. 쥐 실....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LUAD 암 세포 engraftment 쥐의 폐에의 효율성 증가, 우리는 먼저 사전 조건 항공 bleomycin orthotopic 종양 세포 주입 (그림 1) 다음을 사용 하 여 프로토콜 개발. 우리는 immunocompromised athymic 마우스에 투여 하는 경우에 bleomycin 과도 섬유 증에 의해 유도 된 하루 14 기도 건축과 증가 교원 질 공 술 서 (그림 2)의 손실에 의해 입증으로 확인 했다. 이 마우스에 총 섬유 증 해결 50 일 이전 연구24일치 bleomycin 주입 (그림 2, 오른쪽 패널)를 게시.

다른 근원의 LUAD 세포 했다.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

눈에 띄는 임상 유사물 폐암 및 폐36의 다른 만성 질환 사이 문서화 되었습니다. 특히, 환자 특 발성 폐 섬유 증 (IPF) 개발 폐암에 대 한 증가 취향이 있고이 협회는 독립적인 역사37,38흡연의. IPF 폐 건축과 ECM39의 증 착을 통해 장애인된 호흡 기능의 진보적인 파괴에 의해 특징입니다. 또한, 외과 절제술 다음 초기 단계 NSCLC 환자 동시 IPF 가난한 결과40있다. 대부분 NSCLC 종양 진단의 시간에 거리 구성 요소를 포함 하 고이 실질 반응의 정도 빈약한 예 지18와 상관 관계가. 섬유 증에서 급성 또는 지속적인 조직의 손상을 tumorigenesis 여러 가지 방법으로 부각을 증가할 수 있습니다. 예를 들어, 부상, 후 상피 재생.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 국립 암 연구소 (R01CA166376 및 D.X. 구 엔에 R01CA191489)와 국방부 (W81XWH-16-1-0227 D.X. 구 엔 하)에서 교부 금에 의해 투자 되었다.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
블레오마이신시그마B5507-15UN주의 건강 위험 GHS08
엑셀 카테터 24G피셔1484121바늘을 제거합니다. 기관내 주사용
케타민(Ketaset inl 100mg/mL, C3N, 10mL)Butler Schein56344마우스
Xylazine마취 Butler Schein33198마우스 마취
Ketoprofen, 5,000mgCayman Chemical10006661진통제
Puralube 수의학 안과 연고BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897마취 중 안구 건조를 방지하기 위해
D-Luciferin 분말Perkin Elmer Health Sciences Inc122799발광 이미징용. 15mg/mL의 작업 농도를 위해 PBS로 분말을 재구성합니다. 빛으로부터 보호
설치류 삽관 스탠드Braintree ScientificRIS-100기관내 주사에 권장되는 스탠드
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823M조명하고 시각화하기 위해
, 2.75 (7 cm) 길이의 세라트RobozRS-5111기관내 주사기용
주사기 Luer-Lok Sterile 5mlBD / Fisher309646
Satiny Smooth by Conair 듀얼 포일 습식/건식 충전식 면도기Conair-To면도 마우스
본 가위, 3.5" 스트레이트 15mm 샤프/샤프 슈어 컷 블레이드RobozRS-5840SC
15mL 원추형 튜브BD / Fisher352097
1.5mL 원심분리기 튜브USA SCIENTIFIC INC1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPIFisher701350
필터 피펫 팁 (200 μ L)USA SCIENTIFIC INC1120-8710
인산염 완충 식염수Life Technologies14190-144
0.25% 트립신-EDTALife Technologies25200-056
DMEM 고포도당Life Technologies11965-092
RPMI 매체 1640Life Technologies11875-093
소 태아 혈청 USDA라이프 테크놀로지10437-028
페니실린-스트렙토마이신라이프 테크놀로지15140-122
암포테리신 B시그마A2942-20ML
트리판 블루 스테인 0.4%라이프 테크놀로지15250-061
백작 자동 세포 계수기라이프 테크놀로지AMQAX1000
플라스크 T/C 75cm sq 경사 넥, 블루 캡Fisher / Corning353135
IVIS Spectrum Xenogen BioluminiscencePerkin Elmer Health Sciences Inc124262in vivo 생물 발광 이미징
Living image softwarePerkin Elmer Health Sciences Inc128113 <em>in vivo 생물 발광 분석
XGI-8 가스 마취 시스템Perkin Elmer Health Sciences Inc118918Isoflurane 마취용
BD Ultra-Fine II 짧은 바늘 인슐린 주사기 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in)BD / FisherBD328418레트로 오비탈 루시페린 주사기
용 주사기 1mlBD / Fisher14-823-434복강 내 주사용
26 G x 1/2 in. 바늘BD / Fisher305111복강 내 주사용
4% 파라포름알데히드VWR43368-9M주의 건강 위험 GHS07, GHS08. 조직 고정용
Pipet-Lite 피펫, Unv. SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL
Mayer's HematoxylinELECTRON MICROSCOPY SCIENCES517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57%Fisher67-63-0
Masson Trichrome Stain KitIMEB IncK7228콜라겐 시각화를 위한 masson trichrome stain Superfrost
plus glass slidesFisher
6웰 플레이트CorningC3516
범용 마이코플라스마 검출 키트ATCC30-1012K
OCT 임베딩 컴파운드ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES62550-12동결 절편용 임
슈 Leica CM3050 S Research CryostatLeicaCM3050 S염색 분석을
위한 티슈 절편용Keyence 올인원 형광 현미경KeyenceBZ-X700
ImageJ미국 국립보건원IJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) 생쥐Charles RiverNIH-553
NSG(NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) 마우스Jackson Laboratories5557
B6129SF1/J 마우스Jackson Laboratories101043
NIH-H2030 세포ATCCCRL-5914
368T1Monte Winslow (Standford University)-
Nguyen DX et al. Cell. 2009; 138:51–
BrM3 세포Nguyen DX 외. Cell. 2009; 138:51– 62-
기관 Graefe 집게를 스 스 스 스 17014411 1255015베딩 티PC9 세포에서 관대하게 제공, 62-H2030 ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in a....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Orthotopic Lung CancerBleomycin Pre ConditioningTumor Cell EngraftmentLung Adenocarcinoma ModelIntratracheal InjectionBioluminescence ImagingMouse Strain VariabilityMetastasis DetectionFibrosis InductionXenograft Tumor Models

Related Articles