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방법 논문

일시적인 수용 체 잠재력 Vanilloid 타입-1의 Ultrapotent 주 작동 근의 순수한 작은 섬유 신경 병 마우스 모델 수립

9.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56651

⸱

2018년 2월 13일

 ,  , 
1Department of Anatomy, School of Medicine, College of Medicine, Kaohsiung Medical University, 2Department of Medical Research, Kaohsiung Medical University Hospital, 3Department of Medical Research, Ultrastructural Laboratory, Kaohsiung Medical University Hospital

이 논문에서

요약

이 연구는 resiniferatoxin (RTX)와 순수한 작은 섬유 신경 병의 실험 모델을 설정합니다. RTX의 독특한 복용량 (50 µ g/k g)은 환자 특성을 모방 하는 작은 섬유 신경 모델을 개발 하기 위한 최적의 neuropathic 고통을 기본 nociceptive 분자 의미를 조사 하는 것을 도울 수 있었다.

초록

당뇨병 mellitus (DM) 또는 화학요법 대리인의 신경 효과 발생 환자 변성 및 작은 직경 감각 뉴런, 작은 섬유 신경으로의 부상으로 인해 감각 장애를 개발할 수 있습니다. 작은 섬유 신경 병의 현재 동물 모델 모두 큰 및 작은-직경 감각 섬유에 영향을 하 고 따라서는 neuropathology 제대로 부상된 작은 직경 감각 섬유의 효과 평가 하기 위해 너무 복잡 한 만듭니다. 따라서, 그것은 순수한 작은 섬유 신경 적절 하 게 이러한 문제를 조사 하는 실험 모델을 개발 하는 데 필요한입니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 특히 작은-직경 resiniferatoxin (RTX) 유형의 일시적인 수용 체 잠재력 vanilloid 1 (TRPV1) 단일 투여를 통해 ultrapotent 주 작동 근과 감각 신경에 영향을 미치는 작은 섬유 신경 병의 실험 모델을 RTX 신경의 복 주입이 하 라고. 병 적인 발현 및 intraepidermal 신경 섬유 (IENF) 변성, 특히에 상해를 포함 하 여 작은 섬유 신경 병을 가진 환자의 임상 특성을 모방 행동 이상이이 RTX 신경 병 작은 직경 뉴런, 그리고 열 hypoalgesia 및 기계적 용어인 유도. 이 프로토콜 테스트 RTX의 3 개의 복용량 (200, 50, 및 10 µ g/k g, 각각)와 결론을 RTX의 중요 한 복용량 (50 µ g/k g)는 전형적인 작은 섬유 신경 병 발현의 개발에 필요한 고 수정된 immunostaining 절차를 준비 IENF 변성 및 신경 소마 상해 조사. 수정된 절차는 빠르고, 체계적, 경제. Neuropathic 고통의 행동 평가 작은-직경 감각 신경의 기능을 중요 합니다. 실험적인 설치류에 기계적 임계값의 평가 특히 도전 그리고 설치류에 평가의이 유형에 적합 한 사용자 지정된 금속 메쉬가이 프로토콜에 설명 합니다. 요약 하자면, RTX 신경 분자와 개입 neuropathic 통증 치료제의 개발에 대 한 기본 평가를 쉽게 설립 하 고 새로운 실험 모델입니다.

서론

Neuropathic 고통, IENFs의 변성에 의해 분명 하다를 포함 하는 작은 섬유 신경 병은 다양 한 화학요법 에이전트1,2,의 neurotoxic 효력 결과로 및 DM, 같은 조건에서에서 일반적 이다 3,,45. IENFs 지 루트 신경 절 (DRG)에 있는 작은 직경의 주변 단말기 이며 IENF 변성6의 경우에 동시에 영향을 받습니다. 예를 들어 신경 somata의 변경 된 업스트림 유전자 녹음 방송은 활성화 녹음 방송 요인 3 (ATF3)6,7의 upregulation에 의해 증명 되었습니다. 또한, 피부 생 검으로 IENFs 신경 분포의 평가 작은 섬유 신경5,,89의 진단에 유용 합니다. 전통적으로, 피부 생 검에 IENFs의 프로필 9.5 (PGP 9.5)1,,1011단백질 유전자 제품의 immunohistochemical 데모에 의존 했습니다. 함께 찍은, DRG와 IENFs의 병 적인 프로필 기능 조건 기본 작은 섬유 신경 병을 반영 하 고이 유형의 작은 직경 뉴런에서 신경 기능 결과 대 한 표시기를 있을 수 있습니다.

이전에 몇 가지 실험 모델 IENF 변성 부상의 화학요법 유도 신경12,13 및 신경 압축 또는 transection14,15 로 인 한 경우의 문제 해결 , 16. 이러한 실험 모델 또한 영향을 큰 직경 신경; 그것은, 따라서, 불가능; 관찰된 작은 섬유 신경에 영향을 받는 큰 직경 신경의 기여를 제외 하 예를 들어, 유해 철수에 의해 thermosensation 장애의 검사 기능 모터 신경 섬유17,,1819에 따라 달라 집니다. 따라서, 순수한 작은 섬유 신경 모델을 수립 하 고 체계적으로 작은 직경 신경에 있는 그들의 주변 피부 신경 섬유와 신경 somata의 병 적인 상태를 조사 하 고 필요 하 고 긴급 있습니다.

RTX는 capsaicin 아날로그 및 일시적인 수용 체 잠재력 vanilloid 수용 체 1 (TRPV1), nociceptive 처리20,,2122중재는 강력한 길 항 제 이다. 최근, 주변 RTX 치료 안심 neurogenic 통증23,,2425 와 intraganglionic 주사 RTX의 유도 DRG 뉴런22의 돌이킬 수 없는 손실. 주변 RTX 관리의 효과 복용량-의존20,26,27, 과도 둔감 또는 IENFs의 퇴보 귀착되는. 글, 체계적인 높은 복용량 RTX 치료 neuropathic 고통을28, 작은 섬유 신경 병의 증 후에 지도 했다. 이 발견은 건의 한다 치료 방식과 RTX의 복용량 생산 뚜렷한 병 적인 효과 신경 응답; 즉, 주변 관리 지역 효과29 에 의해 고통 전송 방해 하 고 개발 neuropathic 동작6신경 somata를 영향을. 샨 다, 이러한 결과 나타냅니다 RTX multipotency 효과가 RTX 체계적으로 주변 IENFs 및 중앙 신경 somata 같은 주변 신경에 영향을 미칠 수 있는 특정 복용량 인지 문제를 제기. 그렇다면, RTX 특히 작은 직경 뉴런에 영향을 하 고 병원에서 작은 섬유 신경 모방 잠재적인 에이전트 수 있습니다. 예를 들어 병원에서 DM 대사 장애 등 neuropathology 작은 섬유 신경 병의 주요 특성은 주변 신경의 복잡 한 문제입니다. DM 관련 작은 섬유 신경 병의 메커니즘은 주변 신경에 영향을 미치는 주요 에이전트를 되지 않을 수 있습니다 대사 장애의 기여를 제외 하지 수 없습니다. 따라서, DM 관련 작은 섬유 신경 체계적인 대사 장애의 영향을 제외 수는 순수한 동물 모델을 필요 합니다. 이 프로토콜 수정된 immunostaining 분석에 의해 증명으로 IENF 변성 및 작은 직경 신경 상해를 포함 하 여 전형적인 작은 섬유 신경 모델을 개발 하는 RTX의 작업 복용량을 설명 합니다.

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프로토콜

설명 하는 모든 절차는 실험실 동물30에 대 한 윤리 지침에 따라 그리고 프로토콜 동물 위원회의 가오슝 의학 대학, 가오슝, 대만 의해 승인 되었습니다.

1입니다. 설립 RTX 신경의

주의: RTX은 신경 하 고 위험한. 접촉, 그것은 상부 호흡기, 점 막, 눈 자극 역할. 흡입을 방지 하 고 RTX 준비 하는 동안 실험실 안경, 코트를 착용. 충분 한 피부 접촉 또는 처리 후 물으로 씻어.

  1. 트윈 80 및 절대 에탄올 (각 용 매에 대 한 100 µ L)의 동등한 양의 혼합물의 200 µ L를 RTX 분말의 1 밀리 그램을 추가 합니다.
  2. 약 수 RTX 솔루션 (12 µ L/유리병) 최대 3 개월 동안-20 ° C에서 저장. 이 구성 RTX 주식; 만료에 나머지 RTX 솔루션을 삭제 합니다.
  3. RTX 주식 600 µ L의 최종 볼륨을 일반적인 염 분을 희석. RTX 솔루션의 최종 농도 0.01%, 10 µ L 차량 솔루션에서 1 µ g RTX와 같은 이어야 한다.
  4. 8 주 오래 된 성인 남성 ICR 마우스 (35-40 g)를 사용 하 여 실험 동물로 RTX 솔루션의 단 하나의 복용량을 관리 하 고 (복용량: 200, 50, 및 10 µ g/k g, 각각) intraperitoneally (i.p.) 쥐에 microinjection 주사기. 마우스 깊은 마 취에 대 한 5 %isoflurane 흡입기에 의해 anesthetized 되었습니다. 마우스 RTX 주입 중 사지의 철수 작업 면, 쥐 더 이상 흡입 마 취의를 취해야 한다.
    예: 마우스 무게 40 g, 경우 다음 그것은 받을 것 이다 50 µ g/kg의 복용량을 나타내는 RTX 솔루션의 20 µ L.
  5. 컨트롤 1 쥐 그룹이 차량 (10% 트윈 80 및 10% 절대 에탄올에 염 분 해결책)의 동일한 볼륨을 줄.
  6. RTX 주입 후는 12 h 빛/12-h에 어두운 플라스틱 케이지를 마우스 주기 및 음식을 제공 및 광고 libitum물 반환 합니다.

2입니다. Neuropathic 행동의 평가

참고: 주사 후 복구를 허용 하도록 편안한 환경 (단계 1.6)에서 동물을 유지 한다. 7 일 게시물 RTX 주사 (D7), 각 동물 행동 테스트의 효율성을 증진을 시간을 줄이고 같은 날에 핫 플레이트와 폰 Frey 머리 필 라 멘 트 테스트를 수행 합니다. 동물 순응을 최적화 하 고 행동 테스트 하는 동안 환경에 미치는 영향을 감소에 대 한 조용한 방에 안정적인 습도 (40%)와 온도 (27 ℃)에서 유지 관리 하는 동물을가지고. 테스트 기간; 동물을 방해 하지 마십시오 행동 테스트는 매주 계획 하 고 있다.

  1. 핫 플레이트 테스트와 열 대기의 측정
    1. 투명 한 유리 야 케이지로 부드럽게 금속 핫 플레이트 (27 cm × 29 cm)에 동물을 배치 (길이 × 너비 × 높이: 22 cm × 22 c m × 25 cm; 그림 1A)입니다. 52 ° c 금속 열판의 온도 설정
    2. 일단 동물의 hindpaws 핫 플레이트를 터치 하 고 동물의 hindpaws의 응답을 관찰 핫 플레이트의 단계에, 내장 된 타이머와 함께 핫 플레이트에 동물의 열 대기 기간을 측정 시작. 동물 경우 떨고, hindpaws의 사슬 또는 뜨거운 접시에 그것을 제거 하 고 동물 뜨거운 접시에 남아 있는 기간을 기록. 이 기간 개별 동물의 열 대기 시간을 정의합니다. 가장 가까운 0.1 열 대기 시간 기록 s.
    3. 각 테스트 세션에 대 한 응답 정규화 후 마지막 핫 플레이트 테스트에 대 일 분 간격으로 3 개의 시험을 수행 합니다. 25 후 세션을 중지 하는 동물 핫 플레이트에 응답이 없을 경우, 잠재적인 조직 손상을 방지 하는 s.
  2. 폰 Frey 머리 필 라 멘 트와 함께 기계적 임계값의 측정 테스트
    1. 사용자 지정 된 금속 메쉬에 동물을 넣어 (메쉬 크기: 5mm × 5mm) 반투명 실린더 유리 야 케이지로 (직경: 13 cm, 높이: 12cm) (그림 1B) 적어도 2 시간에 대 한 순응에 대 한.
    2. 폰 Frey 머리 필 라 멘 트의 다른 구경 위아래 메서드31hindpaw의 발바닥의 영역에 적용 됩니다. 5-8 s의 필 라 멘 트 적용 기간에 대 한 폰 Frey 머리 필 라 멘 트의 세트의 중간 힘에서 초기 응용 프로그램을 시작 합니다.
    3. 동물 정규화를 최적화 하기 위해 응용 프로그램 필 라 멘 트 사이 2 분 간격을 사용 합니다. 동물의 마지막 응답에 따라 적용 된 필 라 멘 트 힘을 변경 합니다.
      참고: 폰 Frey 머리 필 라 멘 트의 집합 0.064, 0.085, 0.145, 0.32, 0.39, 1.1, 및 1.7 g 강제로 응용 프로그램의 구성 됩니다. 예를 들어 hindpaw 철수 0.32 g의 초기 힘으로 발생 한 경우 다음 0.145 g 적용 됩니다. 발 철수의 부재, 0.39 g 힘 적용 됩니다. 이전 응답에 따라 적용 되는 다양 한 힘의 4 개의 추가 필 라 멘 트 그리고 기계적인 임계값31게시 수식 따라 계산 됩니다.
    4. 각 테스트 세션에 대 한 양국간 hindpaws를 포함 합니다. 각 hindpaw에 대 한 세 가지 실험을 수행 합니다. 각 동물의 의미 기계 임계값 (mg)으로이 6 개의 기계적인 임계값의 평균을 표현 한다.

figure-protocol-1
그림 1입니다. Resiniferatoxin (RTX)의 마우스 모델에 neuropathic 고통의 평가 위한 맞춤 유리 야 케이지 및 금속 메쉬-작은 섬유 신경 병 유발. (A, B) 이러한 그래프 표시 (A)를 측정 하는 데 사용 되는 장비와 투명 한 유리 야 케이지 금속 핫 플레이트 (27 cm × 29 cm)에 의해 열 대기 (길이 × 너비 × 높이: 22 cm × 22 c m × 25 cm) 및 (B) 사용자 지정된 메타에 의해 기계적 임계값 평가 l 메시 (메쉬 크기: 5 m m × 5 m m) 반투명 실린더 유리 야 케이지로 (직경: 13 cm, 높이: 12cm) RTX 유도 작은 섬유 신경와 쥐에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3. 피부 생 검 준비 및 IENFs 신경 분포의 평가

  1. 동작 테스트 후 5 %isoflurane 동물을 anesthetize 하 고 0.1 M 샌드위치에 4 %paraformaldehyde (4 P) 다음 0.1 M 인산 버퍼 (PB) (pH 7.4) intracardiac 관류에 의해 동물 희생.
  2. 재 관류 후 두 hindpaws의 첫 번째 올리십시오 고 후 다른 6 h. 전송 노상 강도 조직 장기 저장을 위한 4 ° C에서 0.1 M PB에 대 한 4 P에 그들을 흥분.
  3. PB 하룻밤에 30% 자당과 30 µ m 두꺼운 조각에 발바닥 표면 방식으로 수직 컷 Cryoprotect 올리십시오. 노상 강도 섹션을 순차적으로, 라벨 그리고-20 ° c.에 부동 액에 저장
    참고: 부동 액 조성은 다음과 같습니다: 증류수, 에틸렌 글리세롤, 글리세롤, 그리고 3:3:3:1 비율에 2 x PB.
  4. 을 보장 하기 위해 적절 한 샘플링은 노상 강도의 모든 세 번째 섹션을 선택 합니다.
    1. 코팅된 유리 슬라이드에 선택한 노상 강도 섹션을 넣어 하 고 그들을 건조.
    2. 슬라이드 및 표준 immunostaining 절차와 과정에 플라스틱 coverplate 커버.
      1. 메탄올 30 분에 1% H2O2 와 노상 강도 섹션을 냉각 하 고 트라이 톤 X-100 0.5 M Tris 버퍼 (Tris) 1 시간에에서 0.5% 무 지방 건조 우유와 0.1% 차단 합니다.
      2. 4 ° c.에 하룻밤 팬 axonal 마커, PGP 9.5 (제기에 토끼; 1:1, 000)에 대 한 antisera 노상 강도 섹션을 품 어
      3. 노상 강도 biotinylated 염소-토끼 IgG 이차 항 체 상 온 (RT) 1 시간에 대 한 섹션을 품 어 그리고 45 분 동안 RT에서 avidin 비타민 b 복합체 복합물으로 품 어.
      4. 0.05% 반응 제품 시각화 45 3, diaminobenzidine (DAB)-3' 솔루션 s. 다음 증류수와 노상 강도 섹션을 세척 하 고 설치를 위해 그들을 건조.
        참고: 기본 및 보조 antisera 0.5 M Tris에서 0.5% 무 지방 건조 우유 희석 됩니다.

4. DRG 섹션 준비 및 부상 작은 직경의 평가

  1. 4번째 및 5번째 해 부 요 추 DRG와 다른 2 h에 대 한 사후 수정.
  2. 샌드위치에 30% 자당 Cryoprotect DRG 조직 하룻밤 8 µ m 두께 순차적으로 잘라, 현미경 슬라이드 및 라벨에. -80 ° C 냉장고에 DRG 섹션을 저장 합니다.
  3. 적절 한 샘플링 되도록 80 µ m 간격에 Immunostain DRG 섹션입니다.
    1. 이중 라벨 immunofluorescent 절차를 제외 하 고는 노상 강도 섹션의 DRG immunostaining 절차를 수행 합니다. 또는, ATF3 포함 (제기에 토끼; 1: 100), 부상 마커, 그리고 peripherin (에 올려진된 마우스; 1:800), 기본 antisera에 작은 직경 신경 마커.
    2. DRG 섹션 4 ° c.에 하룻밤 기본 antisera의 혼합물을 품 어
  4. DRG 섹션 중 텍사스 레드 또는 fluorescein isothiocyanate (FITC)을 품 어-보조 antisera (1: 200), 해당 1 h, RT에서 적절 한 기본 antisera 하 활용 한 정량화에 대 한 다음 탑재.

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결과

이 프로토콜 RTX 신경 장 해, 특히 IENF 변성, 감각 장애 (그림 2)와 관련 된 포함 하는 작은-직경 신경에 영향을 미치는의 소설 마우스 모델을 설명 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜에 따라 동물 전시 열 hypoalgesia와 D7 게시물 RTX 주사 기계 용어인. 이 작은 섬유 신경 모델, RTX의 3 개의 복용량을 설정 하려면: 200, 50, 및 10 µ g/k g i.p. 경로 의해 관리 되었다. RTX 복용량 (50 µ g/k g)이 중요 한 것으로 간주 됐다 고 예비 연구는 높은 복용량 RTX (200 µ g/k g) 발생 높은 마우스 치 사 율 (그림 3).

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토론

병원에서 작은 섬유 신경 병의 효과적 치료는 기능 복구 및 환자의 삶의 질 증진을 위한 필요 합니다. 현재, 거기에 작은 직경 신경 상해 기본 분자 메커니즘의 포괄적인 이해의 부족으로 인해 작은 섬유 신경와 관련 된 감각 장애를 대상으로 치료 가이드의 부족이 이다. 신경의 이전 모델 일반적으로 영향을 모두 큰 및 작은-직경 감각 신경; 예를 들어, 화학요법 유도 신경12,,3233 및 기계 유도 신경34,35의 모델. 따라서, 모터 약점 및 큰 직경 감각 신경 손상의 기여 수 제외할 수 없습니다 완전히 이러한 신경 모델의 행동 테스트. 현재 프로토콜 IENFs 변성의 병 적인 기능 증거를 제공 하 여 작은 직경 감각 신경에만 영향을 마우스에 작은 섬유 신경의 ...

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공개 사항

저자 공개할 게 없다

감사의 글

이 작품은 사역의 과학 및 기술 (106-2320-B-037-024), 카오 슝 의과대학 (KMU-M106028, KMU-S105034) 및 상위 대학 그랜트 (TP105PR15), 카오 슝 의과대학, 대만 대 한 목표에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Chemical reagent
ResiniferatoxinSigmaR8756
Tween 80SigmaP1754
3,3'-diaminobenzidineSigmaD8001
avidin-biotin complexVectorVector PK-6100
NameCompany카탈로그 번호코멘트
>Primary Antisera
PeripherinChemiconMAB-1527
ATF3Santa CruzSC-188
PGP9.5UltraCloneRA95101
< strong>NameCompany카탈로그 번호Comments
Secondary Antisera
Biotinylated goat anti-rabbit IgGVectorBA-1000
Texas Red-conjugated goat anti-mouseJackson ImmunoResearch115-075-146
이소티오시아네이트(FITC)-활용 당나귀 항토끼잭슨 면역연구711-095-152
NameCompany카탈로그 번호Comments
Equipment
Hot plateIITC모델 39
폰 프레이 필라멘트Somedic Sales AB10-600-0001
NameCompany카탈로그 번호Comments
Material
Shandon 커버 플레이트Thermo 과학72110017
슬라이드 랙Thermo scientific73310017

참고문헌

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