Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

요약

이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

초록

T 림프 톨 급속 하 고, 편광 신호에 종사 하는 TCR 활성화 다음 분 이내 발생. 이 면역 시 냅 스, T 세포 활성화를 조절 하 고 이펙터 응답을 대상으로 하는 진부한 셀 교차로의 형성을 유도 합니다. 이러한 프로세스를 효과적으로 공부 하기 빠르고, 편광 응답 캡처에 맞춤화 된 이미징 접근 필요 하다. 이 프로토콜 기반으로 photoactivatable 펩 티 드-주요 조직 적합성 복잡 한 (pMHC)는 자외선에 노출 될 때까지 비 물질로 이러한 시스템을 설명 합니다. Videomicroscopy 실험 동안 타겟 decaging이 시 약의 TCR 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 및 고해상도 이미징 총 내부 반사 (TIRF) 이후 세포 응답의 모니터링 수 있습니다. 이 방법은 또한 유전과 약리 섭 동 전략와 호환 됩니다. 면역학 시 냅 스의 기반이 되는 편광 cytoskeletal 구조의 형성에 TCR 신호를 연결 하는 잘 정의 된 분자 통로의 어셈블리에 대 한 수 있습니다.

서론

T 림프 톨 (T 세포) 항 원 펩 티 드의 세포 표면 MHC 컨텍스트에서 표시를 인식 하 여 세포 면역에 중심 역할을 재생 합니다. TCR에 의해 중재 되는 항 원 인식, naïve T 세포의 분화를 구동 하 고 이펙터 인구에 의해 cytolytic와 의사 소통 응답의 납품을 촉진. TCR 참여는 또한 세포질 구조에 극적인 변화를 유도 한다. 분 이내에, T 세포 면역학 시 냅 스 (IS)^1,2로 알려진 편광된 인터페이스를 형성 하는 항 원 제시 세포 (APC)의 측에 gloms. IS cytokines의, 또는 세포 독성 T 세포 (Ctl), 송출 파괴 용균성 단백질의 경우 방향 릴리스를 사용 하 여 T 세포 효과 기 응답을 potentiates.

PMHC에 의해 TCR 참여 활성화의 T 세포 (위도), 궁극적으로 시 냅 스 골격²의 강력한 리 모델링 추진에 대 한 링커를 포함 한 여러 다운스트림 어댑터 분자의 급속 한 인 산화를 유도 한다. 대뇌 피 질의 filamentous 말라 (F-말라) T 세포 APC 표면 확산을 다음 IS 주변 및 중앙에서 고갈에 F-말라 축적으로 특징 고리 모양의....

프로토콜

1입니다. 물질로 유리 표면 준비

1. Biotinylated 폴 리-L-리 신 (바이오-PLL)와 코트 8 잘 연 발 coverglass 희석 증류수, 이온을 제거 된 물 (ddH₂O) 1: 500. 실 온 (RT)에서 30 분 동안 품 어.
2. H₂o. 세척
3. 실시간에서 2 시간 건조
4. 블록 바이오-PLL 실시간에서 30 분 동안 차단 버퍼 (HEPES 버퍼링 염 분 [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], 2 %BSA)와 표면 코팅
   1. 폴 리-L-리 신 hydrobromide 10mm NaPO₄, pH 8.5의 1 ml에서의 5 mg을 디졸브.
   2. (에서 DMSO에 100mg/mL 주식) NHS-비오 틴의 125 μmol (0.55 밀리 그램)를 추가 하 고 반응의 pH를 확인. PH 8.5이 하 있는 경우에, pH 8.5와 9.5 사이 그것을 인상 4 N NaOH의 2 μ를 추가 합니다.
   3. 30 분 동안 소용돌이입니다.
   4. 20 mM Tris pH 8.0에에서 녹아 100mm 글리신의 50 μ와 반응을 끄다.
   5. 10 분에 대 한 전체 전력에서 회전 시키십시오 그리고 새로....

결과

Photoactivation 및 이미징 접근 관찰과 급속 하 고, 편광 신호 응답의 손쉬운 정량화 할 수 있습니다. 복제의 기능을 설명 하기 위해 여기 TCR 유도 DAG 축적과 centrosome 재교육 사이 spatiotemporal 상관 관계를 조사 하는 실험 이다. 5 C. C7 T 셀 폭발 했다 2 명의 형광 기자 불리고 retrovirally: 단백질 키 니 아 제 C θ에서에서 탠덤 C1 도메인 포함 된 DAG 바이오 센서는 centrosome 모니터링 GFP (C1-GFP) RFP tubulin에 연결. T 세포 다음 photoactivatable 고객 센터-난-E^k를 포함 하는 연 발된 coverglass에 붙어 있었다. C1-GFP는 TIRF 현미경 및 RFP tubulin epifluorescence 모드에서 사용 하 여 몇 군데. 그림 2에서 같이, T 셀 아래 표면의 지역화 .......

토론

최근 몇 년 동안, 라이트는 세포질 과정의 spatiotemporally 제어 활성화를 위한 훌륭한 도구로 떠오르고 있다. 다양 한 방법론 개발 되었습니다, 각각 관련 장점과 단점. 고정, extracellular ligands의 decaging에, 기반으로, 여기에 설명 된 시스템은 급속 한, subcellular, 편광 신호 응답의 분석에 대 한 이상적으로 적합 합니다. 이 방법은 위에서 설명한 T 세포에는 대형 검사에 적용 되었습니다. 또한, 다른 수용 체에 대 한 갇힌된 ligands가 설계 되었습니다, 우리 수용 체 전화를 자연 살해 세포와 응답에 녹음 방송 요인 NF-κB의 핵 전 좌에 억제 신호를 평가 하기 위해 동일한 전략을 적용할 수 있도록 ^14,15신호.

이 프로토콜에서 물질로 ligands 그들은 이미징 실험의 기간에 대 한 자극의 고정, 편광 소스로 유지.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Nunc Lab-Tek 챔버 커버 글라스	Thermofischer Scientific	155361
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636	Biotinylated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-Biotin	Thermofischer Scientific	20217	Biotinylated Poly-L-Lysine
Streptavidin	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: BirA 비오틴-단백질 리가제 표준 반응 키트	Avidity	BirA500	은 단백질을 비오틴화하는 데 사용될 것입니다
오틴화된 Hb I-EK			단백질 접힘에 대해서는 참고 문헌 6을 참조하십시오. 비오틴화의 경우, BirA 키트
비오틴화 NPE-MCC I-EK	Anaspec		Custom NPE-MCC(H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH)는 Anaspec
Biotinylated &alpha에서 구입할 수 있습니다. H2-Kk 항체	BD Biosciences	553591
Biotinylated NPE-OVA H2-Kb	Anaspec		Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH)는 Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db	Anaspec		맞춤형 합성 단백질(KAVYDFATL)은 Anaspec
Biotinylated ICAM1에서			단백질 접힘에 대해서는 프로토콜의 참조를 참조하십시오. 비오틴화의 경우 BirA 키트
휴대용 UV 램프	UVP	UVGL-25	램프는 샘플에서 < 1cm 떨어져 있습니다.  365광의 30초는 검출 가능한 디케이징에 충분하며 정량적 디케이징에는 20분이 소요됩니다.
올림푸스 IX-81 OMAC TIRF 시스템.	Olympus		이미징 시스템에 대한 추가 정보는 그림 6
Mosaic 디지털 다이어프램	Andor
Slidebook 소프트웨어	Intelligent Imaging Innovations

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