Photoactivatable 길 항 제를 사용 하 여 T 세포 활성화의 공간 및 시간 제어

Summary

이 프로토콜 photoactivatable 펩 티 드-MHC T 세포 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 활성화를 사용 하 여 T 세포를 활성화 하는 영상 기반 방법을 설명 합니다.

Abstract

T 림프 톨 급속 하 고, 편광 신호에 종사 하는 TCR 활성화 다음 분 이내 발생. 이 면역 시 냅 스, T 세포 활성화를 조절 하 고 이펙터 응답을 대상으로 하는 진부한 셀 교차로의 형성을 유도 합니다. 이러한 프로세스를 효과적으로 공부 하기 빠르고, 편광 응답 캡처에 맞춤화 된 이미징 접근 필요 하다. 이 프로토콜 기반으로 photoactivatable 펩 티 드-주요 조직 적합성 복잡 한 (pMHC)는 자외선에 노출 될 때까지 비 물질로 이러한 시스템을 설명 합니다. Videomicroscopy 실험 동안 타겟 decaging이 시 약의 TCR 활성화의 정확한 spatiotemporal 제어 및 고해상도 이미징 총 내부 반사 (TIRF) 이후 세포 응답의 모니터링 수 있습니다. 이 방법은 또한 유전과 약리 섭 동 전략와 호환 됩니다. 면역학 시 냅 스의 기반이 되는 편광 cytoskeletal 구조의 형성에 TCR 신호를 연결 하는 잘 정의 된 분자 통로의 어셈블리에 대 한 수 있습니다.

Introduction

T 림프 톨 (T 세포) 항 원 펩 티 드의 세포 표면 MHC 컨텍스트에서 표시를 인식 하 여 세포 면역에 중심 역할을 재생 합니다. TCR에 의해 중재 되는 항 원 인식, naïve T 세포의 분화를 구동 하 고 이펙터 인구에 의해 cytolytic와 의사 소통 응답의 납품을 촉진. TCR 참여는 또한 세포질 구조에 극적인 변화를 유도 한다. 분 이내에, T 세포 면역학 시 냅 스 (IS)^1,2로 알려진 편광된 인터페이스를 형성 하는 항 원 제시 세포 (APC)의 측에 gloms. IS cytokines의, 또는 세포 독성 T 세포 (Ctl), 송출 파괴 용균성 단백질의 경우 방향 릴리스를 사용 하 여 T 세포 효과 기 응답을 potentiates.

PMHC에 의해 TCR 참여 활성화의 T 세포 (위도), 궁극적으로 시 냅 스 골격²의 강력한 리 모델링 추진에 대 한 링커를 포함 한 여러 다운스트림 어댑터 분자의 급속 한 인 산화를 유도 한다. 대뇌 피 질의 filamentous 말라 (F-말라) T 세포 APC 표면 확산을 다음 IS 주변 및 중앙에서 고갈에 F-말라 축적으로 특징 고리 모양의 구조를 확인 한다. F-말라 반지 형성 인터페이스의 중심 바로 아래 위치에 microtubule 조직 센터 (MTOC, T 세포에서는 centrosome 라고도)의 재교육에 밀접 하 게 결합 이다. 두 이벤트는 초기 항 원 인식의 분 이내 발생 하 고 후속 활성화 이벤트와 이펙터 응답 발생 건축 컨텍스트 설정.

공부 하 고는 형성, 다양 한 실험실 접근 송출 고정된 TCR ligands를 포함 하거나 지원 자체 ligands^3,4를 포함 하는 지질 bilayer 유리 표면에 의해 대체 됩니다 개발 했습니다. T 세포는 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRF) 또는 confocal 현미경 검사 법, 초기 T 세포 활성화 및 IS 형성의 고해상도 연구를 활성화 하 여 몇 군데 수 있습니다이 표면에 IS 같은 연락처를 형성 합니다.

하지만이 방법을 완벽 하 게 조립된 IS의 뛰어난 시각화에 대 한 허용, 신호 다음 TCR:pMHC 결 찰의 많은 초 이내에, TCR 활성화를 정확 하 게 다음 사건의 순서를 결정 하는 노력을 복잡 하 게 발생 . 이 문제를 우회 하는 photoactivation 방식 개발 되었습니다, TCR 활성화^5,,67의 spatiotemporal 제어를 달성 하기 위해 사용 되는 photoactivatable pMHC. 이 시스템에서 T 세포는 비 물질로 TCR까지 자외선 (UV)을 조사 하는 photoactivatable pMHC를 포함 하는 유리 표면에 부착 됩니다. UV 방사선의 T 세포 아래 표면 미크론 크기의 지역 T 세포에 의해 인식 될 수 있는 물질로 영역을 만드는 photocage를 제거 합니다. 이후 신호 이벤트와 cytoskeletal 개장 다음 유전자 인코딩된 형광 기자를 사용 하 여 모니터링 됩니다. 항 원 펩 티 드, 엄 시 토 크롬 c_88-103 (MCC)와 ovalbumin_257-264 (OVA), 선물 된다 II MHC-E^k 클래스와 클래스의 맥락에서 나 MHC H2-K^b, 각각의 2 개의 photoactivatable 버전 되었습니다 (그림 1)를 개발 했다. 그러면 두 CD4의 분석⁺ T 세포 (표현 5 C. 고객 센터-난-E^k 에 대 한 특정 C7, 2B4, 또는 모양과 TCRs)와 CD8⁺ T 세포 OVA-H2-K^b (OT1 TCR 표현)에 대 한 특정.

지난 10 년간, TCR photoactivation 및 이미징 접근은 이용 되어 신호 단계 초기 TCR의 정확한 활동을 설정 하 고 또한 편광된 cytoskeletal 개장^5, 를 경 세 하는 분자 경로 식별 하 ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10}. 예를 들어 분석 결과 그 centrosome 결정에서 쓸모 있었다 송출 쪽으로 재교육 가운데는 IS에 지질 두 번째 메신저 diacylglycerol의 지역화 된 그라데이션에 의해 중재입니다. 이 방법론의 T 세포 기능 고해상도 이미징 분석을 요구 하는 응용 프로그램에 대 한 가치가 있을 나갈 것입니다 예상 된다.

Protocol

1입니다. 물질로 유리 표면 준비

1. Biotinylated 폴 리-L-리 신 (바이오-PLL)와 코트 8 잘 연 발 coverglass 희석 증류수, 이온을 제거 된 물 (ddH₂O) 1: 500. 실 온 (RT)에서 30 분 동안 품 어.
2. H₂o. 세척
3. 실시간에서 2 시간 건조
4. 블록 바이오-PLL 실시간에서 30 분 동안 차단 버퍼 (HEPES 버퍼링 염 분 [10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl], 2 %BSA)와 표면 코팅
   1. 폴 리-L-리 신 hydrobromide 10mm NaPO₄, pH 8.5의 1 ml에서의 5 mg을 디졸브.
   2. (에서 DMSO에 100mg/mL 주식) NHS-비오 틴의 125 μmol (0.55 밀리 그램)를 추가 하 고 반응의 pH를 확인. PH 8.5이 하 있는 경우에, pH 8.5와 9.5 사이 그것을 인상 4 N NaOH의 2 μ를 추가 합니다.
   3. 30 분 동안 소용돌이입니다.
   4. 20 mM Tris pH 8.0에에서 녹아 100mm 글리신의 50 μ와 반응을 끄다.
   5. 10 분에 대 한 전체 전력에서 회전 시키십시오 그리고 새로운 튜브에는 상쾌한 전송.
      참고: 바이오-PLL 품질은 일반적으로에 비해 이전 준비 직렬 2 배 희석 96-잘 ELISA 접시에 재료의 코팅 및 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 가진 외피 streptavidin 결합 후 biotin 콘텐츠 측정.
5. 블로킹 버퍼를 제거 합니다. 웰 스 건조를 허용 하지 않습니다. Streptavidin (블로킹 버퍼에서 100 µ g/mL)를 추가 합니다. 1 h 4 ° c.에 품 어
6. HBS에 씻어. 와 반전 챔버 슬라이드 웰 스 4-5 번, 우물에서 HBS를 제거. 웰 스 건조를 허용 하지 않습니다.
7. 표면에 biotinylated pMHC ligands 및 접착 분자를 추가 합니다.
   참고: MCC 및 OVA 수 직교-nitrobenzyl를 추가 하 여 photocaged 기반 키 lysines의 ε 아미노 그룹을 보호 그룹 (예: nitrophenylethyl (NPE) 또는 nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) (고객 센터, OVA에서 k 7에에서 K12). Photocaged 고객 센터 및 OVA 상업용 공급 업체에서 얻을 수 있습니다. 수성 버퍼에서 재구성, 후 bacterially 표현된-E^k 와 h 2 K^b 설립된 접근^11,12를 사용 하 여 refolded 있습니다 그들은.
8. Photoactivatable 고객 센터 또는 OVA 펩타이드의 유효성 검사
   1. 휴대용 UV 램프와 UV 해 여 NVOC 보호 펩 티 드 decage ( 재료의 표참조) 실시간에서 20 분
   2. 펄스 1.0 x 10⁵ APCs nonstimulatory 펩 티 드 (부정적인 컨트롤, 예를 들면 Hb)의 1 개의 µ M를 1 시간에 대 한 조사 photoactivatable 펩 티 드, 펩 티 드 photoactivatable 그리고 주 작동 근 펩 티 드 (긍정적인 통제, 예를 들어, 고객 센터) unirradiated 37 ° c.에서 하룻밤
   3. 5 c.를 표현 하는 T 세포를 자극 하 C7/2B4/앤 TCR, CH12 또는 CH27 B 세포를 사용 합니다. OT1 T 세포를 자극, RMA s 또는 EL4 thymoma 셀을 사용 합니다.
   4. T 세포에의 동등한 수와 함께 펄스 APCs를 혼합 96-200의 최종 볼륨 하단 플레이트 라운드 잘 µ L. 12-24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
   5. 각 우물에서는 supernatants 복구와 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 색도계 검출 ELISA에 의해 일리노이-2를 분석 합니다.
      참고: 모든 펩 티 드 MHC 복합물으로 refolding 전에 분무 질량 분석에 의해 배우면 자격의 확인이 좋습니다.
9. 폴딩 및 빛에 노출을 최소화 하기 위하여 MHC의 정화를 수행 합니다. 예를 들어 포장 알루미늄 호 일에 반응을 접는 고 오프 UV 램프와 젤 여과 크로마토그래피를 실시.
   참고: 그것은 그 photoactivatable 고객 센터-난-E^k 를 발견 되었으며 OVA-H2-K^b 불완전 한 기능 고른다면으로 인해 높은 밀도에서 UV 독립 T 세포 활성화를 유도 합니다. 따라서, photoactivatable pMHC nonstimulatory pMHC (예: -E^k 헤모글로빈_64-76 펩 티 드 (Hb) 포함)의 10-30 x 초과로 동원 정지 단계 희석은. 이 신호 대 잡음 비 후속 이미징 실험의 향상.
10. Photoactivate CD4⁺ T 총칭 biotinylated Hb-난-E^k (3 µ g/mL), biotinylated photoactivatable 고객 센터-난-E^k (0.1 µ g/mL), 및 biotinylated 클래스에 대 한 항 체의 혼합물을 사용 하는 세포, MHC H2-K^k I (0.5 µ g / mL). 안티-H2-K^k 항 체 장려 5 c. C7/2B4/와 T 세포 H2-K^k, 정품 인증을 진행 하지 않고 유리 표면에 확산을 표현.
11. CD8에 대 한⁺ T 세포, biotinylated h 2 D^b 펩 티 드 KAVYDFATL 베어링의 혼합 사용 (1 µ g/mL), biotinylated photoactivatable OVA-H2-K^b (0.1 µ g/mL), 및 접착 분자 ICAM-1의 세포 외 도메인 (2 µ g/mL 곤충 세포 문화¹³생산). ICAM-1 T 세포 표면에서 LFA1 integrin 참여 하 여 가까운 접촉 형성을 장려 한다.
12. RT에 1 시간 또는 2 시간 이상 4 ° c.에 외피 다음 블로킹 버퍼에 모든 단백질 혼합물을 적용
    참고: 수 µ m² 당 8000 ~ 이런이 종류의 표면에 분자 밀도 이전 결정된⁶되었습니다. Photoactivatable pMHC ~1/30 대표는^일 biotinylated 단백질 표면에, 그것의 밀도의 µ m², decaging 이전 당 ~ 267 분자를 될 것입니다.
13. 1.6 단계에서 세척 하 고 사용 하 여 준비까지 HBS에 두고.
14. 200000 CD4 추가⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 각 우물에 적절 한 TCR을 표현 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 준수 하는 셀. 일단 세포는에 연결 하 고 표면에 확산, 그들은 photoactivation 및 이미징에 대 한 준비가 되었습니다.
    참고: 효과 기 T 세포 형광 이미징 프로브와 Retroviral 변환 세부 elswhere^6,7에 설명 되어 있습니다. 칼슘 신호 수 있습니다 또한 공부 될 칼슘 민감한 염료 Fluo-4⁶로드 untransduced T 세포를 사용 하 여. 비율 염료 Fura-2 decaging photoactivatable pMHC의 유도 또한 UV 범위에서 여기 필요 하기 때문에 권장 하지 않습니다.

2. 이미지 수집

1. 거꾸로 TIRF 현미경 이미지 수집을 위한 UV 호환 150 X 객관적 렌즈와 복을 사용 합니다. UV 100 W 수은 램프 (HBO)에 연결 된 디지털 다이어 프 램 시스템을 사용 하 여 사용자 정의 영역을 비추는. UV 400 nm 긴 패스 미러를 사용 하 여 샘플에이 램프에서 빛을 직접.
2. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 지역화 된 photoactivation 및 시간 경과 수집에 대 한. 대부분 실험에서 모두는 녹색 및 빨강 채널에서 488를 사용 하 여 프로브를 모니터링 및 561 nm 여기 레이저, 각각. 레이저 빛은 또한 UV 범위 (decaging 사용)에서 전송 듀얼 대역 통과 dichroic 거울을 사용 하 여 샘플에 지시 된다. 현미경 구성에 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 와 그림 6 을 참조 하십시오.
3. T 세포를 포함 하는 챔버 슬라이드를 장착, TIRF 또는 epifluorescence 조명, 필요에 따라 얻기 위해 설정을 조정 합니다. 라이브 모드로 형광 probe(s)을 표현 하는 셀의 필드를 선택 합니다. 소프트웨어 제어를 사용 하 여 개별 셀 아래 photoactivation 미크론 단위 영역을 설정 합니다.
4. 시간 경과 수집을 시작 합니다. 일반적으로, 5의 간격 80 timepoints 인수는 각 시간 포인트 사이 s. 이것은 순차적 488에 대 한 더 충분 한 시간 및 듀얼 컬러 실험의 경우 563 nm 노출.
5. 10 timepoints, photoactivate 디지털 다이어 프 램을 열어서 선택된 영역 1-1.5 s 셔터 후
6. 시간 경과 후 셀의 새 필드를 선택 하 고 과정을 반복.

3. 데이터 분석

참고: 고정된 ligands의 지역화 된 photoactivation 신호 응답 cytoskeletal 개장 이벤트의 정량 분석을 위해 사용 될 수 있는 잘 정의 된, 고정 된 물질로 영역을 만듭니다. 프로토콜은 일반적으로 조사 지역 내에서 형광 강도 측정 하거나 위치 끝점으로 거리 측정을 위한 조사 영역을 사용 하 여 포함 하는 분석 (예. 분극에 centrosome의 평가 조사 지역)입니다. 두 분석 프로토콜은 아래 설명 되어 있습니다. 강도 및 거리 측정, 다음 추가 처리 및 분석에 대 한 출력 수 있는 다양 한 대화형 이미지 분석 프로그램을 사용할 수 있습니다.

1. 형광 강도
   1. 셀 (FI_b) 밖에 배경 영역의 형광 강도 (FI)를 결정 합니다. 이 배경 보정을 위해 사용 됩니다.
      1. 셀 외부 미크론 크기의 사각형 영역을 그릴 하 고 마스크. 형광 강도 확인 하려면 분석 클릭 | 통계를 마스크. 형광 강도 의미 를 선택 하 고 값을 내보냅니다.
         참고: 절차 세부 정보 (예: 3.1.1.1) Slidebook 소프트웨어를 참조 하십시오 ( 재료의 표참조). 다른 소프트웨어 패키지를 사용 하 여이 프로토콜의 구현 (예., 피지) 약간 다를 수 것입니다.
   2. 각 시간 지점에 대 한 photoactivated 지역 내에서 인터넷을 결정 합니다.
      1. 마스크 는 photoactivated 영역을 강조 표시를 선택 합니다. 형광 강도 확인 하려면 분석 클릭 | 통계를 마스크. 형광 강도 의미 를 선택 하 고 값을 내보냅니다.
   3. 배경을 FI 지역 내에서 측정된 된 FI 값에서 뺍니다. 그런 다음 평균으로 나누어 수정된 FI 측정 표준화, 배경 수정 photoactivation 전에 처음 9 프레임의 FI. Δ/F = ((FI-FI_b)/mean(FI_1-9)-FI_b)).
      참고: 그래프 δ/F 시간의 기능으로.
2. 거리
   1. X 및 y 좌표는 photoactivated 지역의 중심의.
      1. X 및 y를 확인 하려면 photoactivated 지역의 중심의 좌표 마스크 는 photoactivated 영역을 강조 표시를 선택. Photoactivation의 지역 강조 되 면 선택 분석 | 통계를 마스크 | 지역 센터 내보낼 값.
   2. X 및 y 결정 각 시간 지점에 대 한 관심의 형광 프로브에 대 한 좌표. 이것은 수동 또는 자동 입자 추적을 통해 일반적으로 달성 된다.
      1. X 및 y를 확인 관심, 형광 프로브의 좌표 수동 입자 추적 을 선택 하 고 시간이 지남에 따라 관심의 형광 프로브에 클릭. 일단 모든 시간 포인트 추적 된 선택 분석 | 통계를 마스크 | 지역 센터 내보낼 값.
   3. 관심사의 형광 단백질 및 방정식을 사용 하 여 각 시간 지점에 photoactivated 지역의 중심 사이의 거리를 계산: 거리 = √ ((₂x x-₁)²+ (y₂y-₁)²), x₂ 와 y는₂ 에 관심과 x₁ 과 y₁ 의 형광 단백질의 좌표는 photoactivated 지역의 중심의 좌표.
   4. 시간의 기능으로 거리 그래프입니다.

Results

Photoactivation 및 이미징 접근 관찰과 급속 하 고, 편광 신호 응답의 손쉬운 정량화 할 수 있습니다. 복제의 기능을 설명 하기 위해 여기 TCR 유도 DAG 축적과 centrosome 재교육 사이 spatiotemporal 상관 관계를 조사 하는 실험 이다. 5 C. C7 T 셀 폭발 했다 2 명의 형광 기자 불리고 retrovirally: 단백질 키 니 아 제 C θ에서에서 탠덤 C1 도메인 포함 된 DAG 바이오 센서는 centrosome 모니터링 GFP (C1-GFP) RFP tubulin에 연결. T 세포 다음 photoactivatable 고객 센터-난-E^k를 포함 하는 연 발된 coverglass에 붙어 있었다. C1-GFP는 TIRF 현미경 및 RFP tubulin epifluorescence 모드에서 사용 하 여 몇 군데. 그림 2에서 같이, T 셀 아래 표면의 지역화 ...

Discussion

최근 몇 년 동안, 라이트는 세포질 과정의 spatiotemporally 제어 활성화를 위한 훌륭한 도구로 떠오르고 있다. 다양 한 방법론 개발 되었습니다, 각각 관련 장점과 단점. 고정, extracellular ligands의 decaging에, 기반으로, 여기에 설명 된 시스템은 급속 한, subcellular, 편광 신호 응답의 분석에 대 한 이상적으로 적합 합니다. 이 방법은 위에서 설명한 T 세포에는 대형 검사에 적용 되었습니다. 또한, 다른 수용 체에 대 한 갇힌된 ligands가 설계 되었습니다, 우리 수용 체 전화를 자연 살해 세포와 응답에 녹음 방송 요인 NF-κB의 핵 전 좌에 억제 신호를 평가 하기 위해 동일한 전략을 적용할 수 있도록 ^14,15신호.

이 프로토콜에서 물질로 ligands 그들은 이미징 실험의 기간에 대 한 자극의 고정, 편광 소스로 유지...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek 챔버 커버 글라스	Thermofischer Scientific	155361
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636	Biotinylated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-Biotin	Thermofischer Scientific	20217	Biotinylated Poly-L-Lysine
Streptavidin	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: BirA 비오틴-단백질 리가제 표준 반응 키트	Avidity	BirA500	은 단백질을 비오틴화하는 데 사용될 것입니다
오틴화된 Hb I-EK			단백질 접힘에 대해서는 참고 문헌 6을 참조하십시오. 비오틴화의 경우, BirA 키트
비오틴화 NPE-MCC I-EK	Anaspec		Custom NPE-MCC(H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH)는 Anaspec
Biotinylated &alpha에서 구입할 수 있습니다. H2-Kk 항체	BD Biosciences	553591
Biotinylated NPE-OVA H2-Kb	Anaspec		Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH)는 Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db	Anaspec		맞춤형 합성 단백질(KAVYDFATL)은 Anaspec
Biotinylated ICAM1에서			단백질 접힘에 대해서는 프로토콜의 참조를 참조하십시오. 비오틴화의 경우 BirA 키트
휴대용 UV 램프	UVP	UVGL-25	램프는 샘플에서 < 1cm 떨어져 있습니다.  365광의 30초는 검출 가능한 디케이징에 충분하며 정량적 디케이징에는 20분이 소요됩니다.
올림푸스 IX-81 OMAC TIRF 시스템.	Olympus		이미징 시스템에 대한 추가 정보는 그림 6
Mosaic 디지털 다이어프램	Andor
Slidebook 소프트웨어	Intelligent Imaging Innovations