이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

세포 외 산 성 pH 문화 체계의 설립

15.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56660

⸱

2017년 11월 19일

 , 
1Innovative Technology Laboratories, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd, 2Laboratory for Systems Biology and Medicine, RCAST, The University of Tokyo

이 논문에서

요약

산 성 종양 microenvironment 종양 진행에 중요 한 역할을 담당합니다. 암 세포 생체 외에서 에 산 성 세포 외 산도의 효과 평가 하기 위해 간단한 산 성 문화 시스템을 설립 했습니다.

초록

종양 microenvironment 영양 기아, 저 산소 증 등의 암 진행 및 암에 중요 한 역할을 한다. 그러나, 종양의 적극성 및 그것의 기본 메커니즘에 산 성 세포 외 산도의 역할은 하지 광범위 하 게 연구 되었습니다 hypoxic 또는 영양소 고갈 조건에 비해. 또한, 산 성 세포 외 종양 microenvironment을 모방 하는 잘 정의 된 문화 방법 하지 완전히 보고 되었습니다.

여기는 간단한 생체 외에서 문화 메서드 중 탄산염 및 젖 산 증가 또는 문화 매체에서 HCl 농도 감소 산 성 세포 외 산도 사용 하 여 유지 하기 위해 선물이. 중간 pH는 적어도 24 시간 동안 되었고 72 h PANC-1과 AsPC 1 췌장암 세포의 문화에 따라 점차적으로 감소. 이 연구에서는 3 가지 산 성 미디어 조건 매우 upregulated pH 반응 유전자 MSMO1, INSIG1, 및 IDI1 와 같은 산소 또는 영양 기아. 에 비해 이 유전자의 upregulation 산 성 pH의 표식으로 사용할 수 있습니다. 이 간단한 기술은 microenvironment 산 성 종양에서 종양 악성의 기본 메커니즘을 명료 하 게 도움이 됩니다. 따라서, 우리의 세포 외 산 성 pH 문화 시스템 셀룰러 산 성 pH 응답 암 세포 뿐만 아니라 1 차 셀, 신장 관 세포는 다른 산 성 장애, 당뇨병 ketoacidosis, 관계 등에서 발견을 통해 유산 증, 신장 관 산 성 증, 그리고 호흡 증.

서론

종양 microenvironment 종양 진행과 암 세포 물질 대사1,2,3에 중요 한 역할을 재생합니다. 암 세포는 저 산소 증, 영양 부족, 세포 외 산 성 pH (페) 등 조건에 자주 노출 됩니다. 그러나, 종양 진행에 pHe의 역할은 하지 명확히으로 광범위 하 게 산소 또는 양분 기아에서. 종양 조직에 페 산 성, 약 산도 6.84,5에 도달 될 수 있다. 산 성 pH에서 양성자 (H+)의 호 기성 및 혐 기성 glycolytic 배설 발생 하 고 확산 암에 의해 젖 산 세포5,6.

최근 연구 결과 밝혀 그 산 성 페 유도 히스톤 deacetylation, 지방산 산화 및 심한 산 성 환경7,8,,910에 적응에 대 한 산 성 리소좀의 exocytosis. 그러나, 어떤 세포 외 산성화를 통해 장치 암 동작 및 산 성 pH 종양 microenvironment 레 귤 레이 터 완전히 결정 되지 않은 키의 id 영향을 줍니다. 또한, 몇 가지 보고서 중 탄산염, 트리 스, 파이프와 HEPES 버퍼 또는 젖 산 및 HCl, 불분명 한 농도 사용 하 여 다양 한 산 성 pH 미디어 설명 하지만 중간도 포괄적인의 조정 안정성을 설명 하기 위해 몇 가지 보고서 여러 독특한 산 성 문화 미디어7,8,,910 의 비교

키 레 귤 레이 터 및 extracellular 산성화의 맥락에서 암 세포의 대사 변화를 명료 하 우리 산 성 페를 유지 하기 위해 간단한 생체 외에서 문화 모델을 설립 하 고 암 세포11페의 역할을 조사 했다. 우리 37 ° C에서 5%에서 6.8의 pHe와 산 성 문화 매체를 유지 하는이 메서드를 사용 하 여 CO2, 문화 매체에서 감소 중 탄산염 농도 사용 하 여. pH 7.4 정상적으로 사용 하 고 매체를 제어. 중간 pH는 적어도 24 시간 동안 되었고 PANC-1과 AsPC 1 췌장암 세포의 문화 중 72 h에 의해 점차적으로 감소. 향상 된 분해 가속 양성자 뿐만 아니라 젖 산7,,89의 배설, 때문에 우리 또한 감소 하는 것 보다 젖 산을 추가 하 여 유도 하는 젖 산 증을 흉내 낸 문화 메서드를 설립 합니다 중 탄산염 농도입니다. 또한, 매체에서 HCl을 이용한 산 성 페 산 성 pH 배양 세포 응답 하지 않은 중 탄산염의 감소 된 농도 때문 가능성을 제외 수 있습니다. 또한, 다양 한 미디어를 사용 하 여 다른 중 탄산염 농도와 7.4을 6.4의 ph, 우리 세포 응답에 페 효과의 정도 평가할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1입니다. 산 성 문화 매체의 준비

  1. 제어 (pH 7.4)의 준비 및 낮은 pH (pH 6.8) 문화 매체
    1. 4.75 g을 물 500 mL에 L-글루타민 없이 DMEM 분말의 분해.
    2. 압력 꽉 병에서 0.33 M NaHCO3 솔루션을 준비 합니다.
      주의: 그것은 이후 NaHCO3 CO2 가스가 열 하 고 열 분해 방출 압력 꽉 병을 사용 하는 것이 중요.
    3. 압력솥 매체 고 솔루션입니다. 이러한 버퍼를 25 ° c에 냉각을 허용합니다
    4. 200 mM L-글루타민, 페니실린 스의 5 mL의 5 mL을 추가 및 태아의 소 혈 청 중 탄산염 없이 DMEM의 500 mL 50 mL.
    5. 제어 (pH 7.4) 매체에 대 한 중 탄산염 없이 DMEM의 100 mL 당 0.33 M NaHCO3 솔루션의 2.4 mL를 추가 합니다. 낮은 pH (pH 6.8) 매체에 대 한 중 탄산염 없이 DMEM의 100 mL 당 0.33 M NaHCO3 솔루션의 0.6 mL를 추가 합니다.
    6. 5% 미만 37 ° C에 외피의 24 h 후 중간 pH를 확인 CO2.
      참고: NaHCO3 솔루션의 금액 인큐베이터와 공기 압력의 CO2 내용에 따라 다를 수 있습니다 중간 pH에 따라 조정 될 필요가 있다. 이상적으로, 처음으로 그것은 DMEM 추가 하려면 NaHCO3 솔루션의 적절 한 금액을 결정 하기 위해 다양 한 중 탄산염 농도와 중간 pH를 측정 하는 더 나은.
      1. CO2 배양 기에서 문화 접시를 제거한 후 바로 문화 매체를 수집 하 고 pH 미터를 사용 하 여 pH를 측정. 필요한 경우 물 목욕을 사용 하 여 37 ° C에 중간 온도 유지. 측정 하지 중간 산도 세 번 독립적으로.
        참고: NaHCO3 솔루션 4 ° C에서 저장 되어야 하 고 각 미디어를 신선 하 게 준비 한다. 이 연구에 사용 될 수 있는 상용 제품 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.
  2. 젖 산 유도 또는 HCl을 이용한 산 성 문화 매체 준비
    1. 제어 매체 (단계 1.1.5에서에서 준비) 100 mL를 74 µ L 젖 산 솔루션의 또는 1 M HCl의 125 µ L를 추가 합니다.
    2. 5% 미만 37 ° C에 외피의 24 h 후 중간 pH를 확인 CO2.
      참고: 젖 산 또는 HCl 솔루션의 금액 또한 필요가 CO2 콘텐츠 인큐베이터와 공기 압력에 따라 다를 수 있습니다 중간 pH에 따라 조정할 수 있다. 이상적으로, 그것은 직렬 젖 또는 매체의 원하는 pH를 조정 하기 위해 적절 한 크기를 결정 HCl 농도 중간 pH를 측정 하기 위해 좋습니다.

2. 수확 및 세포 치료

  1. 37 ° C 미만 5% CO2 를 수행 하기 전에 적어도 1 주 실험에서 세포 배양을 시작 합니다.
    참고:이 연구에 사용 된 셀 라인 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.
  2. 70-90 %confluency 도달할 때 세포를 통과. Confluent 될 셀을 허용 하지 않습니다. 매체 매일 재배 중 2-3 일 마다 변경 합니다.
  3. 5 mL PBS를 추가 하 여 셀을 씻어. PBS를 발음 하 고 파견 효소 1 mL 트립 신 등을 추가 합니다.
  4. 셀은 분리를 시작 때까지 37 ° C에서 품 어.
  5. 분리 된 세포 배양의 5 mL을 추가 하 고 효소 비활성화. 15 mL 튜브와 300 x g. Aspirate는 상쾌한에 3 분 동안 원심 분리기에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 다시 문화 매체와 셀을 일시 중단.
  6. Hemocytometer 고 Trypan 파랑을 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.
  7. 씨 5.0 x 105 셀/잘 매체의 10 mL에 10 cm 접시의. 37 ° C에서 5%에서 24 h에 대 한 셀을 품 어 CO2.
  8. 문화 매체를 발음, 5 mL PBS 가진 세포를 세척 하 고 제 1에서 준비 산 성 문화 매체의 10 mL를 추가. 37 ° C에서 5%에서 24 h에 대 한 셀을 품 어 CO2.

3. RNA 격리

  1. 문화 매체를 발음 하 고 5 mL PBS로 세포를 씻어. RNA 추출 시 약을 추가 하 여 셀을 방해 ( 테이블의 자료를 참조).
  2. 짧게 접시를 긁어, 다음 한 피 펫으로 RNA 추출 시 약을 제거 하 고 1.5 mL 튜브에 lysate RNA 추출 시 약/셀 입금. 5 분 동안 실 온에 둡니다.
  3. 250 µ L 클로 프롬을 추가 하 고 5 분 동안 실 온에서 약 15 미 허가 및 ≥8, 5 분 동안 000 x g에서 원심 분리기 튜브를 적극적으로 악수.
  4. 수성 단계는 피 펫을 사용 하 여 조심 스럽게 제거. 수성 단계 중 일부를 남겨두고. 또 다른 1.5 mL 튜브에 배치 합니다.
  5. 수성 단계에 550 µ L 소 프로 파 놀을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 4 ° c.에 20 분 동안 5 분 원심 분리기 (≥20, 000 x g) 최대 속도에 대 한 실 온에 두고
  6. 소 프로 파 놀을 부 어와 DEPC에 1 mL 75% 에탄올 처리 물 추가. 부드럽게 혼합. 5 분 동안 8000 x g에서 원심.
  7. 에탄올과 펠 릿 건조 하자 플라스틱.
  8. 약 15-25 µ L (에 따라 수율) DEPC의 RNA 펠 릿에 물 치료를 추가 합니다. 철저 하 게 혼합.
  9. 260에 OD를 측정 하 여 절연된 RNA의 농도 측정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.

4입니다. cDNA 합성

  1. PCR 반응 관에는 다음 구성 요소를 결합: 최대 5 µ g 총 RNA, 1 µ L 올리고 dT (50 µ M) 또는 무작위 뇌관 믹스 (60 µ M), 1 µ L 10 mM dNTP와 14 µ L의 총 볼륨 nuclease 무료 물.
  2. 짧게 원심 작은 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 구성 요소와 혼합 (5 ~ s). 65 ° c.에 5 분에 대 한 샘플 RNA/뇌관 변성 짧게 스핀 (5 ~ s) 원심 작은 벤치탑 사용 하 고 적어도 1 분 동안 얼음에 신속 하 게 샘플을 넣어.
  3. 다음 구성 요소 추가: 역방향 전송 버퍼 x 4 µ L 5, 1 µ L 역전사 (200 U / µ L), 1 µ L RNase 억제제 (40 U / µ L).
    참고: 상용 키트의 예제 자료의 테이블에 에서 표시 됩니다.
  4. 캡 튜브, 혼합, 그리고 다음 간단히 작은 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 내용을 원심 (5 ~ s). 10 분 동안 50-55 ° C에서 결합된 반응 혼합물을 품 어.
  5. 10 분 동안 80 ° C에서 배양 하 여 반응을 비활성화.

5. 실시간 PCR를 사용 하 여 산 성 반응 유전자 발현의 측정

  1. 384 잘 반응 판에 다음 구성 요소를 결합: 1 µ L 템플릿 cDNA, 0.75 µ L 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0.3 µ L 50 µ M 앞으로 뇌관, 0.3 µ L 50 µ M 반전 뇌관, 1 µ L Taq 중 합 효소, Taq 중 합 효소 버퍼, 2.5 µ L 20 mM dNTP, 16.65 µ L 물 2.5 µ L 10.
    참고: 상용 키트의 예는 테이블의 자료에 표시 됩니다. 뇌관의 목록 표 1에 표시 됩니다. 96-잘 반응 접시는 또한이 단계에서 사용할 수 있습니다. 다른 조사 (예를 들어, Taqman 프로브)도 사용할 수 있습니다.
  2. 실험 및 실시간 PCR 시스템에 다음 PCR 프로그램 설정: 2 분, 1 개 주기; 50 ° C 95 ° C 10 분, 1 개 주기; 95 ° C 15 s와 1 분, 40 사이클; 60 ° C 95 ° C 15에 대 한 s, 1 개 주기; 15 60 ° C s, 1 개 주기; 95 ° C 15에 대 한 s, 1 주기.
  3. 정량 Pcr 장비에서 접시를 놓습니다. 프로그램을 시작 합니다.
    참고: 전화 응답 유전자 MSMO1의 Upregulation, INSIG1및 IDI1 는 단백질 수준에 의해 측정할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

적절 한 중 탄산염 농도 결정 하려면 우리 0-8 m m NaHCO3 (문화 매체에서 최종 농도)의 범위에서 DMEM을 준비 하 고 ph 6.4-7.4 (그림 1)에서 이르는 문화 미디어를 준비 하는 데 성공 했다. 우리는 extracellular pH pH 6.8 단단한 종양4,5에 도달 하면 주장 이전 보고서에 따르면 8 m m NaHCO3 (pH 7.4) 제어 매체, 그리고 산 성 ph 2 mM NaHCO3 (pH 6.8) 매체로 DMEM을 준비. 산 성 매체의 pH 24 시간 동안 되었고 점차 약 pH 6.6 문화 중 72 h PANC-1 및 AsPC-1 셀 (그림 2)로 감소. 다음, 젖 산 또...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

여기, 우리는 간단한 산 성 pH 문화 시스템 및 그것의 평가 과정을 설명. 중간 산성화, 즉, 감소 된 중 탄산염 농도, 젖 산 추가, 및 HCl 또한의 세 가지 방법의 조합을 사용 pH-응답 메커니즘을 철저 하 게 조사 하 고 다른 종양 세포 응답을 비교 하 산소 또는 양분 기아 같은 microenvironmental 조건.

이 방법의 키 문화 매체에서 중 탄산염, 젖 산, 그리고 HCl의 적절 한 농도 결정 하는. 처음으로이 방법을 수행할 때 다양 한 중 탄산염 농도와 중간 pH 측정 NaHCO3 매체에서의 적절 한 크기를 결정 중요 하다. 이 과정 동안, 그것은 37 ° C에 외피의 24 h 후 중간 pH를 측정 하는 데 필요한 아래 5% CO2, CO2 의 중간 온도 평형 상태로 크게 영향을 미칠 중간 pH. 중 탄산염의 압력가 마로 소독은 자주 권장, 중 탄산염 쉽게 플랫 하 게 된다. 셀 밀도...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자 아야 노 콘도 쿄와 Hakko 기린 (주)의 직원

감사의 글

우리 시스템 생물학 및 의학, RCAST, 도쿄의 대학에 대 한 게놈 과학의 부 및 연구실의 회원을 감사합니다. 우리는 특히 박사 H. 油, 박사 토니 고다마, (LSBM, RCAST, 도쿄의 대학), 감사 박사 K. 富, 박사 토니 요시다, 및 박사 대답
유용한 토론 및 지원에 대 한 Kunisato (쿄와 Hakko 기린 (주)). 이 작품 일부에 의해 지원 되었다 특정에 대 한 젊은 과학자 (A) (26710005, 방법), 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (26116711 16 H 01567, 방법), 그리고 도전에 대 한 특정
교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 일본, 다케다 과학 재단 (러브), 암 연구 (러브), 고바야시 재단 및 암 연구에 대 한 프로젝트의 예비 연구 (16 K 14605, 방법) 및 치료 진화 (P-만들기) 그리고 의료 연구 및 개발, 아메드 (러브) 일본 기관에서 혁신적인 암 제어에 대 한 실질적인 연구.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Reagents
Dulbecco의 변형된 독수리 배지" 닛수이" 2Nissui05919
소 태아 혈청Thermo Fisher10438
NaHCO3Wako191-01305
L-글루타민 용액Thermo Fisher25030-081
페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액(안정화)Nacalai09367-34
0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA 용액, 페놀 레드 함유Nacalai32778-05
0.5%-Trypan 블루 염색 용액Nacalai29853-34
젖산 용액Sigma-Aldrich252476
염산 용액Sigma-AldrichH9892
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN74134
SuperScript IV First-Strand Synthesis SystemThermo Fisher18091
Power SYBR Green PCR 마스터 믹스 어플라이드 바이오시스템즈 4368702 
NameCompany카탈로그 번호Comments
Cell lines
PANC-1ATCCCRL-1469
AsPC-1ATCCCRL-1682
KMS-6JCRB 세포 은행
TIGJCRB 세포 은행
MRC9ATCCCCL-212
HUVECATCCCRL-1730
NameCompany카탈로그 번호Comments
Equipment
NanoDrop One Microvolume UV-Vis 분광광도계(Wi-Fi 포함)Thermo FisherND-ONE-W
QuantStudio 5 Real-Time PCR SystemThermo FisherCRL-1682
JCRB0432

참고문헌

  1. Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
  2. Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
  3. Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
  4. Gerweck, L. E., Seetharaman, K. Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer. Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).
  5. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
  6. Gatenby, R. A., Gillies, R. J. Why do cancers have high aerobic glycolysis? Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).
  7. McBrian, M. A., et al. Histone acetylation regulates intracellular pH. Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).
  8. Damaghi, M., et al. Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane. Nat Commun. 6, 8752(2015).
  9. Corbet, C., et al. Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation. Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).
  10. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS genetics. 4 (12), e1000293(2008).
  11. Kondo, A., et al. Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression. Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

세포 외 pH 유지종양 미세환경 산증pH 응답성 유전자 발현젖산 유발 산증HCl 매개 산증중탄산염 감소법췌장암 세포 배양RNA 추출 프로토콜실시간 PCR 분석
세포 외 산 성 pH 문화 체계의 설립
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.