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방법 논문

청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

9.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56678

⸱

2018년 5월 24일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, 3Department of Laboratory Medicines, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region, Southern Medical University, 4Experiment Teaching Center, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University

이 논문에서

요약

이 프로토콜에는 출생 후 쥐 새끼에서 청각 brainstem 응답을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 외부 머리 세포의 기능 개발 조사, 고립 된 외부 머리 세포에 기록 하는 전체 셀 패치 클램프 실험 절차 단계별 설명 합니다.

초록

외부 머리 세포 포유류 달팽이 관의 감각 세포의 두 종류 중 하나입니다. 그들은 약한 진동의 저수준 사운드 신호를 증폭 하는 잠재적인 수용 체와 그들의 셀 길이 변경 합니다. 형태학 및 electrophysiological 속성 외부 머리 세포 (OHCs)의 이른 출생 후 년에 발전 한다. 외부 머리 세포의 성숙 청각 시스템의 발전에 기여할 수 있습니다. 그러나, OHCs 개발의 과정은 잘 공부 하지. 이 부분적으로 electrophysiological 접근 하 여 그들의 기능을 측정 하는 데 어려움입니다. 위의 문제를 해결 하는 간단한 방법을 개발, 목적 여기 우리가 출생 후 쥐에서 심하게 천연된 달팽이 관에서 OHCs의 기능을 공부 하는 단계별로 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법으로 순수 톤 자극에 인공 응답을 평가 하 고 식 수준 및 OHCs에 모터 단백질 prestin의 기능 검사 수 있습니다. 이 메서드는 또한 내부 세포 (IHCs) 조사를 사용할 수 있습니다.

서론

달팽이 관의 감각 세포의 두 가지 기능 포유류 청각을 위해 필수적입니다: mechanoelectric 변환 (메트로) 및 electromotility1,2. 메트로 채널 머리 번들, IHCs (IHCs) 및 막 잠재적인 변경으로 OHCs 변환 사운드 진동 뿐만 아니라 innervated 나선형 ganglion 신경의 전기 신호에 의해 OHCs 막 잠재력과 셀 길이 변경 하 고 낮은 수준의 소리의 진동 증폭. Electromotility 나이 활동 OHCs3의 측면 벽에 있는 모터 단백질 prestin에 의해 파생 됩니다.

많은 종의 설치류를 포함 하 여, 청각 기능 초기 산 후 신 기원4,5에 성숙 하지 않습니다. 사운드 신호에 대응에서 행동 잠재력 심리 발병6,7전에 청각 피 질에서 검출 될 수 있습니다. 형태학의 개발 및 달팽이 관의 기능 마우스, 햄스터, 쥐4,5,8에서 널리 공부 되었습니다 했다. Mechanotransduction 및 electromotility 세포의 또한 개발 초기 생명 시대5.

다른 산 후 나가에 쥐의 청각 감도 평가 하기 위해 청각 brainstem 응답 (ABR) 쥐 새끼에 기록 하는 방법을 개발 했습니다. 전체 셀 패치 클램프 electrophysiologically는 OHCs를 조사 하는 이상적인 기술입니다. 그러나, 전체 셀 씰링의 저속 절연된 OHCs의 electromotility의 조사 제한 된 신경 세포와 다른 상피 세포에서 수행 하는 패치 클램프와 비교.

여기는 산 후 쥐에서 심하게 천연된 달팽이 관에 형태학 상으로 electrophysiologically는 OHCs을 조사 하는 절차에 설명 합니다. 이 메서드는 내부 머리 전지 개발 및 기능을 조절 하는 분자 메커니즘 연구를 수정할 수 있습니다.

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프로토콜

동물 주제와 관련 된 모든 실험 프로토콜 남부 의과대학의 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 실험에 대 한 솔루션을 준비 합니다.

  1. 마 취 준비 ( 재료의 표참조): 1.5 %pentobarbital 나트륨 ddH2오에에서 녹아
  2. 해 부 솔루션 준비 ( 재료의 표참조): 1 M NaOH와 ddH2O. 조절 pH 7.3 1 리터에 Leiboviz의 L-15 분말의 1 개의 부 대를 해산. 300-330 mOsm osmolarity osmometer를 사용 하기 전에 10 mM HEPES 사용 하 여 조정 합니다.
  3. 2 mg/mL 콜라 IV 해산 ( 재료의 표참조) 해 부 솔루션 단계 1.2 준비.
  4. ( 재료의 표참조) immunostaining 솔루션 준비: 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4 %paraformaldehyde 해산.
    주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호를 착용 하십시오.
  5. 0.3% 침투성 에이전트 PBS에 희석. 블로킹 버퍼 PBS에 10% 정상 염소 혈 청을 희석. 블로킹 버퍼에서 prestin 항 체 1: 200을 희석. 블로킹 버퍼에 Alexa488 활용 된 항 체 1:600 희석. Phalloidin Tetramethylrhodamine B isothiocyanate 1: 200 PBS에 희석.
  6. Extracellular 솔루션 준비 ( 재료의 표참조): (1.2 단계) 위에서 설명한 대로 Leiboviz의 L-15 매체를 준비.
  7. 세포내 솔루션 준비 ( 재료의 표참조).

2. ABR 기록

참고: ABR 녹음 이전 설명 하고있다9우리의 이전 연구 자세히.

  1. Sprague Dawley (SD) 쥐 (1-14 주 오래 된 강아지와 2 개월 된 성인, 남녀) 1.5% 나트륨 pentobarbital (새끼에 대 한 22 mg/kg과 30 mg/kg 성인, 복 (i.p.))의 단일 주사로 anesthetize.
  2. 동물의 신체를 고정 하는 폴 리 에틸렌 거품 형에 마 취 동물을 배치 합니다. 동물 소리 약하게 방에 방진 테이블에 놓습니다. 생리대와 37.5 ° C에서 동물의 체온을 유지.
  3. 70% (vol/vol) 에탄올과 머리 영역을 닦으십시오. 좋은 위를 사용 하 여에 게 1-2 m m 절 개를 ventrolateral 참조 전극 또는 지상에 외부 pinna. 쳇 바늘 전극 (기록 전극)는 두개골 꼭지점 (그림 1A)에 있습니다.
  4. 다양 한 주파수의 보정된 음색 파열 (1 ms 상승/하강, 3 ms 고원) 생성 함수 발생기를 사용 하 여 (2, 4, 8, 16, 24 및 32 kHz)와 강도 (dB 5 단계에서 10 dB SPL 85에서 감소). 주파수와 진폭을 수동으로 다 또는 컴퓨터를 사용 하 여. 동물의 머리 쪽으로 떨어져 10 cm에 있는 정전기 스피커를 통해 소리 자극을 제공 합니다.
  5. (100-1000 Hz)를 필터링 하 고 증폭 (256 회) 사운드 이끌려 잠재력에 Abr를 다기능 프로세서를 사용 하 여 평균. 온라인 및 오프 라인 분석을 위해 저장 된 ABR 추적 모니터링 됩니다. 그것은 하나의 동물에서 녹음 하는 ABR을 완료 하는 데 약 40 분 걸립니다.
    참고: 일반적으로, 3 ~ 7 봉우리 (파 나 파 7 세) 대기 시간은 15 ms 수 보다 적게 식별 (그림 1B). ABR 임계값 어느 파에 I와 II는 검출 될 수 있는 최소 소리 수준으로 정의 됩니다.
  6. 안락사 (0.3 mL 1.5% 나트륨 pentobarbital 복 주사)와 마 취에서 깨어 동물 전에.

3. 장기의 Corti (OC) 해 부

  1. 쥐 새끼 anesthetize 쥐 보다 6 일 이전에 대 한 (< P6), 100 mm 문화 접시에 있는 동물을 유지 하 고 10 분 동안 얼음 접시 커버. 쥐를 위해 > P6, 1.5% 나트륨 pentobarbital (22 mg/kg, i.p.)의 단일 주입으로 동물을 anesthetize. 마 취 후 쥐 새끼를 목을 벨.
  2. 70% (vol/vol) 에탄올을 분사 하 여 머리를 소독.
  3. 가 위; 화살 중간에 따라 두개골을 열으십시오 내가 폭로 뇌를 제거 합니다.
  4. 얼음 처럼 차가운 L-15 (그림 2A)의 3 mL 가득 35 mm 페 트리 접시로 내가 전송 합니다.
  5. 해 부 현미경 미세 집게를 사용 하 여 달팽이 관 (그림 2B)의 뼈 캡슐을 제거 하.
  6. OC를 풀 다 및 관련 흔 vascularis (SV)는 modiolus에서.
  7. 개최 하 여 집게와 SV의 기저 부분 구분 OC SV에서 완전히 기지에 정점 (그림 2C)에서 천천히 해제 합니다.
  8. 잘라 OC 균등 하 게 3 개의 조각으로 고급가 위 (그림 2D)를 사용 하 여.

4. 면역 형광 염색

  1. 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 유리 슬라이드에 OC (3.8 단계)의 세그먼트를 전송 하 고 적어도 4 h 4 ° c.에 대 한 4 %paraformaldehyde 100 µ L로 수정
    주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호를 착용 하십시오.
  2. 신선한 PBS의 100 µ L로 paraformaldehyde 여 조직을 씻어. 워시 3 시간 10 분 대 한 조직.
  3. 실 온에서 30 분 PBS에 0.3% 침투성 에이전트 조직 품 어.
  4. PBS에 침투성 에이전트를 삭제 하 고 세 번 PBS 가진 조직 씻어.
  5. 10% 정상 염소 혈 청 PBS에 실 온에서 1 h와 함께 차단 합니다.
  6. 하룻밤 실 온에서 또는 4 ° C에서 2 시간에 대 한 솔루션을 차단에 안티-prestin-C-말단 항 체 (1: 200)로 품 어.
  7. 5 분에 대 한 PBS 세 번 씻어.
  8. Alexa488 활용 된 이차 항 체 (1:600)와 함께 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 차단 솔루션에서 품 어.
  9. 어둠 속에서 5 분에 대 한 PBS 세 번 씻어.
  10. 어둠 속에서 실 온에서 10 분 동안 rhodamine-phalloidin (1: 200)으로 품 어.
  11. 어둠 속에서 5 분에 대 한 PBS 세 번 씻어.
  12. 장착 매체 (DAPI 포함) 유리 슬라이드에 탑재 합니다. Confocal 현미경 검사 법 405를 사용 하 여 이미지 nm, 488 nm, 그리고 594 nm 레이저. 0.1-0.5에서 레이저 전원 설정 mW 및 스캔 속도 0.5 프레임/s에서.

5. 패치 클램프 격리 OHCs의 기록

  1. 피펫은 끌어당기는 사람을 사용 하 고 마이크로-위조 패치를 pipettes 팁 직경 2-3 µ m. 다시 채우기 세포내 솔루션 펫. 일반적으로, 패치 피 펫의 초기 저항 2.5-3.5 m ω 목욕 솔루션에서 이었다.
  2. 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 (단계 3.8)에서 OC의 조각 35 mm 페 트리 접시에 전송 합니다. 소화 효소 소화 매체의 100 µ L와 조직 (콜라 4, 참조 테이블의 재료) 실 온에서 5 분.
  3. 효소 소화 매체 L-15의 100 µ L로 치환 조직에서 세포를 분리 하는 마이크로 메스를 사용 하 여 작은 조각으로 잘라.
  4. 부드러운 pipetting 후 만든 작은 플라스틱 챔버로 셀 전송 (직경 ~ 1.5 c m) 효소 무료 목욕 솔루션으로 가득 (~ 1.5 mL 재료의 표참조).
  5. 챔버는 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 배치 합니다. 건강 한 나타나는 독방 OHCs 찾아.
  6. 700B 앰프의 헤드 단계에 패치 피 펫을 로드 합니다. micromanipulator에 의해 패치 피 펫을 신중 하 게 이동 하 고 외부 머리 세포 (그림 3A)의 바닥의 주위에 위치.
  7. 전체 셀 패치 클램프 세포 체의 측면 벽을 씰링 하 여 OHC 세포 막 파열까지 가벼운 흡입을 적용 합니다. 개최 잠재적인 설정-70 mV. 셀 액세스 저항 10에서 17 m ω에 배열 했다와 막 저항 500 m ω, 100에서 배열 했다 그리고 성공적인 전체 셀 구성으로 간주 됩니다.
  8. Hyperpolarizing 및 depolarizing 전압 적용 컴퓨터 제어를 사용 하 여 (250 ms 기간 및 −140에서 +94에 이르기까지 13 mV 단계에 mV) 전체 셀 전류를 유도 하는 셀.
  9. 전체 셀 전류를 증폭, 700B 증폭기 (5 kHz의 코너 주파수) 필터링. 1440A 컨버터 및 오프 라인 분석에 대 한 저장소로 데이터를 변환 합니다.
  10. 패치 클램프 소프트웨어에 의해 제어 하는 두 개의 사인파 전압 자극 프로토콜을 사용 하 여 OHCs의 막 커패시턴스를 측정 합니다. 110-140에서 stimulate 전압 범위 설정 mV. 오프 라인 분석을 위해 데이터를 저장 합니다.

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결과

ABR에서 마 취 쥐 새끼 산 후 제 7 일 보다 오래 된 (P7) 순수한 톤 버스트 (그림 1A)를 사용 하 여 elicited 될 수 있습니다. 그림 1B같이 ABR 파형 쥐 새끼만 3 ~ 4 가지 파도 작은 진폭 보여준에서 얻은. 일반적으로, 7 개의 봉우리까지 성인 동물 (그림 1B)의 ABR 파형에서 관찰 되었다.

다음 immunostaining 및 electrophysiological 측정, 쥐 귀 갓 측 뼈에서 해 부 했다. 우리는 SV를 modiolus (그림 2A-2 C) OC...

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토론

쥐 날 11 미만, 청각 피 질6,7소리 자극에 대 한 응답에서 행동 잠재력을 관찰 수 있었다. 따라서, 출생 후 하루 11 "청각 발병"10로 설명 되어 있습니다. 청각 기능 공부 하기 전에 청력 발병은 하지 잘 아직 개발. 성인 ABR 녹음에 대 한 유사한 방법을 사용 하 여, Abr P11 보다 젊은 쥐 새끼에서 순수한 톤 버스트 여 elicited 될 수 보여 줍니다 (그림 1). 그러나, 쥐 새끼에서 얻은 ABR 파형 성인 동물의 몇 가지 다른 기능을 보여주었다. ABR 응답은 상대적으로 높은 임계값과 진폭에 작은. 이 결과 개발 청각 시스템 사운드 신호를 낮은 감도 것을 의미 합니다. 중요 한 차이 쥐 새끼에서 기록 하는 ABR 파형에서 관찰 되었다. 일반적으로, 7 개의 봉우리까지 성인 ABR 파형

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 973 프로그램 (2014CB943002), 국립 자연 과학 재단의 중국 (11534013, 31500841)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마취
펜토바르비탈 나트륨시그마P37611.5% 수중
NameCompany카탈로그 번호Comments
Dissection solution
Leiboviz의 L-15 MediumLife Technologies41300-0391 팩 1 L 물
콜라겐 분해 효소 IV시그마C51382 mg/mL in L-15
HEPES시그마7365-45-910
mMNameCompany카탈로그 번호코멘트
Immunostaining solutions
PBSThermo Fisher Scientific10010023PBS
Triton X-100AmrescoZS-0694PBS
포름알데히158127
프레스틴 항체Santa CruzSC-22694dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibodyThermo Fisher ScientificA-11055dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanateSigmaP1951dil 1:200
DAPISolarbioC0060dil 1:20
Name 회사카탈로그 번호코멘트
Extracellular solution
Leiboviz의 L-15 MediumLife Technologies41300-0391L 물에 1팩
HEPESSigma7365-45-910mM
NameCompany카탈로그 번호코멘트
세포내 솔루션
CsCl시그마7647-17-8140 mM
MgCl2Sigma7791-18-62 mM
EGTA시그마67-42-510 밀리미터미터
HEPES시그마7365-45-910
mMNameCompany카탈로그 번호Comments
Equipment
OsmometerGonotecOSMOMAT 3000 basic
ForcepWPI14095핀셋 dumont
마이크로 피펫 풀러셔터 기기MODLE-P97
Micro ForgeNarishigenMF-830
미니 운영 체제셔터 기기MP-285
MultiClampAxon700B
저잡음 데이터 수집 시스템Axon1440A
ES1 발표자Tucker-Davis Technologies TDT 시스템, 3 Tucker-Davis Technologies
NameCompany카탈로그 번호Comments
Software
SigGenRP 소프트웨어Tucker-Davis Technologies
BioSigRP 소프트웨어Tucker-Davis Technologies
jClampScientific Solutions
NameCompany카탈로그 번호Comments
Animal
남부 의과 대학의SD 쥐
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 10000C 10% PBS 중 10% PH 7.3 파라드: 실험 동물 센터

참고문헌

  1. He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
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  7. De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
  8. He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
  9. Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826(2016).
  10. Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
  11. Møller, A. R. Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , Academic Press. Dallas. (2006).
  12. He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
  13. Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
  14. Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).

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