청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

요약

이 프로토콜에는 출생 후 쥐 새끼에서 청각 brainstem 응답을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 외부 머리 세포의 기능 개발 조사, 고립 된 외부 머리 세포에 기록 하는 전체 셀 패치 클램프 실험 절차 단계별 설명 합니다.

초록

외부 머리 세포 포유류 달팽이 관의 감각 세포의 두 종류 중 하나입니다. 그들은 약한 진동의 저수준 사운드 신호를 증폭 하는 잠재적인 수용 체와 그들의 셀 길이 변경 합니다. 형태학 및 electrophysiological 속성 외부 머리 세포 (OHCs)의 이른 출생 후 년에 발전 한다. 외부 머리 세포의 성숙 청각 시스템의 발전에 기여할 수 있습니다. 그러나, OHCs 개발의 과정은 잘 공부 하지. 이 부분적으로 electrophysiological 접근 하 여 그들의 기능을 측정 하는 데 어려움입니다. 위의 문제를 해결 하는 간단한 방법을 개발, 목적 여기 우리가 출생 후 쥐에서 심하게 천연된 달팽이 관에서 OHCs의 기능을 공부 하는 단계별로 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법으로 순수 톤 자극에 인공 응답을 평가 하 고 식 수준 및 OHCs에 모터 단백질 prestin의 기능 검사 수 있습니다. 이 메서드는 또한 내부 세포 (IHCs) 조사를 사용할 수 있습니다.

서론

달팽이 관의 감각 세포의 두 가지 기능 포유류 청각을 위해 필수적입니다: mechanoelectric 변환 (메트로) 및 electromotility^1,2. 메트로 채널 머리 번들, IHCs (IHCs) 및 막 잠재적인 변경으로 OHCs 변환 사운드 진동 뿐만 아니라 innervated 나선형 ganglion 신경의 전기 신호에 의해 OHCs 막 잠재력과 셀 길이 변경 하 고 낮은 수준의 소리의 진동 증폭. Electromotility 나이 활동 OHCs³의 측면 벽에 있는 모터 단백질 prestin에 의해 파생 됩니다.

많은 종의 설치류를 포함 하 여, 청각 기능 초기 산 후 신 기원^4,5에 성숙 하지 않습니다. 사운드 신호에 대응에서 행동 잠재력 심리 발병^6,7전에 청각 피 질에서 검출 될 수 있습니다. 형태학의 개발 및 달팽이 관의 기능 마우스, 햄스터, 쥐^4,5,8에서 널리 공부 되었습니다 했다. Mechanotransduction 및 electromotility 세포의 또한 개발 초기 생명 시대⁵.

다른 산 후 나가에 쥐의 청각 감도 평가 하기 위해 청각 brainstem 응답 (ABR) 쥐 새끼에 기록 하는 방법을 개발 했습니다. 전체 셀 패치 클램프 electrophysiologically는 OHCs를 조사 하는 이상적인 기술입니다. 그러나, 전체 셀 씰링의 저속 절연된 OHCs의 electromotility의 조사 제한 된 신경 세포와 다른 상피 세포에서 수행 하는 패치 클램프와 비교.

여기는 산 후 쥐에서 심하게 천연된 달팽이 관에 형태학 상으로 electrophysiologically는 OHCs을 조사 하는 절차에 설명 합니다. 이 메서드는 내부 머리 전지 개발 및 기능을 조절 하는 분자 메커니즘 연구를 수정할 수 있습니다.

프로토콜

동물 주제와 관련 된 모든 실험 프로토콜 남부 의과대학의 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.

1. 실험에 대 한 솔루션을 준비 합니다.

1. 마 취 준비 ( 재료의 표참조): 1.5 %pentobarbital 나트륨 ddH₂오에에서 녹아
2. 해 부 솔루션 준비 ( 재료의 표참조): 1 M NaOH와 ddH₂O. 조절 pH 7.3 1 리터에 Leiboviz의 L-15 분말의 1 개의 부 대를 해산. 300-330 mOsm osmolarity osmometer를 사용 하기 전에 10 mM HEPES 사용 하 여 조정 합니다.
3. 2 mg/mL 콜라 IV 해산 ( 재료의 표참조) 해 부 솔루션 단계 1.2 준비.
4. ( 재료의 표참조) immunostaining 솔루션 준비: 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4 %paraformaldehyde 해산.
   주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호를 착용 하십시오.
5. 0.3% 침투성 에이전트 PBS에 희석. 블로킹 버퍼 PBS에 10% 정상 염소 혈 청을 희석. 블로킹 버퍼에서 prestin 항 체 1: 200을 희석. 블로킹 버퍼에 Alexa488 활용 된 항 체 1:600 희석. Phalloidin Tetramethylrhodamine B isothiocyanate 1: 200 PBS에 희석.
6. Extracellular 솔루션 준비 ( 재료의 표참조): (1.2 단계) 위에서 설명한 대로 Leiboviz의 L-15 매체를 준비.
7. 세포내 솔루션 준비 ( 재료의 표참조).

2. ABR 기록

참고: ABR 녹음 이전 설명 하고있다⁹우리의 이전 연구 자세히.

1. Sprague Dawley (SD) 쥐 (1-14 주 오래 된 강아지와 2 개월 된 성인, 남녀) 1.5% 나트륨 pentobarbital (새끼에 대 한 22 mg/kg과 30 mg/kg 성인, 복 (i.p.))의 단일 주사로 anesthetize.
2. 동물의 신체를 고정 하는 폴 리 에틸렌 거품 형에 마 취 동물을 배치 합니다. 동물 소리 약하게 방에 방진 테이블에 놓습니다. 생리대와 37.5 ° C에서 동물의 체온을 유지.
3. 70% (vol/vol) 에탄올과 머리 영역을 닦으십시오. 좋은 위를 사용 하 여에 게 1-2 m m 절 개를 ventrolateral 참조 전극 또는 지상에 외부 pinna. 쳇 바늘 전극 (기록 전극)는 두개골 꼭지점 (그림 1A)에 있습니다.
4. 다양 한 주파수의 보정된 음색 파열 (1 ms 상승/하강, 3 ms 고원) 생성 함수 발생기를 사용 하 여 (2, 4, 8, 16, 24 및 32 kHz)와 강도 (dB 5 단계에서 10 dB SPL 85에서 감소). 주파수와 진폭을 수동으로 다 또는 컴퓨터를 사용 하 여. 동물의 머리 쪽으로 떨어져 10 cm에 있는 정전기 스피커를 통해 소리 자극을 제공 합니다.
5. (100-1000 Hz)를 필터링 하 고 증폭 (256 회) 사운드 이끌려 잠재력에 Abr를 다기능 프로세서를 사용 하 여 평균. 온라인 및 오프 라인 분석을 위해 저장 된 ABR 추적 모니터링 됩니다. 그것은 하나의 동물에서 녹음 하는 ABR을 완료 하는 데 약 40 분 걸립니다.
   참고: 일반적으로, 3 ~ 7 봉우리 (파 나 파 7 세) 대기 시간은 15 ms 수 보다 적게 식별 (그림 1B). ABR 임계값 어느 파에 I와 II는 검출 될 수 있는 최소 소리 수준으로 정의 됩니다.
6. 안락사 (0.3 mL 1.5% 나트륨 pentobarbital 복 주사)와 마 취에서 깨어 동물 전에.

3. 장기의 Corti (OC) 해 부

1. 쥐 새끼 anesthetize 쥐 보다 6 일 이전에 대 한 (< P6), 100 mm 문화 접시에 있는 동물을 유지 하 고 10 분 동안 얼음 접시 커버. 쥐를 위해 > P6, 1.5% 나트륨 pentobarbital (22 mg/kg, i.p.)의 단일 주입으로 동물을 anesthetize. 마 취 후 쥐 새끼를 목을 벨.
2. 70% (vol/vol) 에탄올을 분사 하 여 머리를 소독.
3. 가 위; 화살 중간에 따라 두개골을 열으십시오 내가 폭로 뇌를 제거 합니다.
4. 얼음 처럼 차가운 L-15 (그림 2A)의 3 mL 가득 35 mm 페 트리 접시로 내가 전송 합니다.
5. 해 부 현미경 미세 집게를 사용 하 여 달팽이 관 (그림 2B)의 뼈 캡슐을 제거 하.
6. OC를 풀 다 및 관련 흔 vascularis (SV)는 modiolus에서.
7. 개최 하 여 집게와 SV의 기저 부분 구분 OC SV에서 완전히 기지에 정점 (그림 2C)에서 천천히 해제 합니다.
8. 잘라 OC 균등 하 게 3 개의 조각으로 고급가 위 (그림 2D)를 사용 하 여.

4. 면역 형광 염색

1. 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 유리 슬라이드에 OC (3.8 단계)의 세그먼트를 전송 하 고 적어도 4 h 4 ° c.에 대 한 4 %paraformaldehyde 100 µ L로 수정
   주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호를 착용 하십시오.
2. 신선한 PBS의 100 µ L로 paraformaldehyde 여 조직을 씻어. 워시 3 시간 10 분 대 한 조직.
3. 실 온에서 30 분 PBS에 0.3% 침투성 에이전트 조직 품 어.
4. PBS에 침투성 에이전트를 삭제 하 고 세 번 PBS 가진 조직 씻어.
5. 10% 정상 염소 혈 청 PBS에 실 온에서 1 h와 함께 차단 합니다.
6. 하룻밤 실 온에서 또는 4 ° C에서 2 시간에 대 한 솔루션을 차단에 안티-prestin-C-말단 항 체 (1: 200)로 품 어.
7. 5 분에 대 한 PBS 세 번 씻어.
8. Alexa488 활용 된 이차 항 체 (1:600)와 함께 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 차단 솔루션에서 품 어.
9. 어둠 속에서 5 분에 대 한 PBS 세 번 씻어.
10. 어둠 속에서 실 온에서 10 분 동안 rhodamine-phalloidin (1: 200)으로 품 어.
11. 어둠 속에서 5 분에 대 한 PBS 세 번 씻어.
12. 장착 매체 (DAPI 포함) 유리 슬라이드에 탑재 합니다. Confocal 현미경 검사 법 405를 사용 하 여 이미지 nm, 488 nm, 그리고 594 nm 레이저. 0.1-0.5에서 레이저 전원 설정 mW 및 스캔 속도 0.5 프레임/s에서.

5. 패치 클램프 격리 OHCs의 기록

1. 피펫은 끌어당기는 사람을 사용 하 고 마이크로-위조 패치를 pipettes 팁 직경 2-3 µ m. 다시 채우기 세포내 솔루션 펫. 일반적으로, 패치 피 펫의 초기 저항 2.5-3.5 m ω 목욕 솔루션에서 이었다.
2. 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 (단계 3.8)에서 OC의 조각 35 mm 페 트리 접시에 전송 합니다. 소화 효소 소화 매체의 100 µ L와 조직 (콜라 4, 참조 테이블의 재료) 실 온에서 5 분.
3. 효소 소화 매체 L-15의 100 µ L로 치환 조직에서 세포를 분리 하는 마이크로 메스를 사용 하 여 작은 조각으로 잘라.
4. 부드러운 pipetting 후 만든 작은 플라스틱 챔버로 셀 전송 (직경 ~ 1.5 c m) 효소 무료 목욕 솔루션으로 가득 (~ 1.5 mL 재료의 표참조).
5. 챔버는 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 배치 합니다. 건강 한 나타나는 독방 OHCs 찾아.
6. 700B 앰프의 헤드 단계에 패치 피 펫을 로드 합니다. micromanipulator에 의해 패치 피 펫을 신중 하 게 이동 하 고 외부 머리 세포 (그림 3A)의 바닥의 주위에 위치.
7. 전체 셀 패치 클램프 세포 체의 측면 벽을 씰링 하 여 OHC 세포 막 파열까지 가벼운 흡입을 적용 합니다. 개최 잠재적인 설정-70 mV. 셀 액세스 저항 10에서 17 m ω에 배열 했다와 막 저항 500 m ω, 100에서 배열 했다 그리고 성공적인 전체 셀 구성으로 간주 됩니다.
8. Hyperpolarizing 및 depolarizing 전압 적용 컴퓨터 제어를 사용 하 여 (250 ms 기간 및 −140에서 +94에 이르기까지 13 mV 단계에 mV) 전체 셀 전류를 유도 하는 셀.
9. 전체 셀 전류를 증폭, 700B 증폭기 (5 kHz의 코너 주파수) 필터링. 1440A 컨버터 및 오프 라인 분석에 대 한 저장소로 데이터를 변환 합니다.
10. 패치 클램프 소프트웨어에 의해 제어 하는 두 개의 사인파 전압 자극 프로토콜을 사용 하 여 OHCs의 막 커패시턴스를 측정 합니다. 110-140에서 stimulate 전압 범위 설정 mV. 오프 라인 분석을 위해 데이터를 저장 합니다.

결과

ABR에서 마 취 쥐 새끼 산 후 제 7 일 보다 오래 된 (P7) 순수한 톤 버스트 (그림 1A)를 사용 하 여 elicited 될 수 있습니다. 그림 1B같이 ABR 파형 쥐 새끼만 3 ~ 4 가지 파도 작은 진폭 보여준에서 얻은. 일반적으로, 7 개의 봉우리까지 성인 동물 (그림 1B)의 ABR 파형에서 관찰 되었다.

다음 immunostaining 및 electrophysiological 측정, 쥐 귀 갓 측 뼈에서 해 부 했다. 우리는 SV를 modiolus (그림 2A-2 C) OC...

토론

쥐 날 11 미만, 청각 피 질^6,7소리 자극에 대 한 응답에서 행동 잠재력을 관찰 수 있었다. 따라서, 출생 후 하루 11 "청각 발병"¹⁰로 설명 되어 있습니다. 청각 기능 공부 하기 전에 청력 발병은 하지 잘 아직 개발. 성인 ABR 녹음에 대 한 유사한 방법을 사용 하 여, Abr P11 보다 젊은 쥐 새끼에서 순수한 톤 버스트 여 elicited 될 수 보여 줍니다 (그림 1). 그러나, 쥐 새끼에서 얻은 ABR 파형 성인 동물의 몇 가지 다른 기능을 보여주었다. ABR 응답은 상대적으로 높은 임계값과 진폭에 작은. 이 결과 개발 청각 시스템 사운드 신호를 낮은 감도 것을 의미 합니다. 중요 한 차이 쥐 새끼에서 기록 하는 ABR 파형에서 관찰 되었다. 일반적으로, 7 개의 봉우리까지 성인 ABR 파형

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마취
펜토바르비탈 나트륨	시그마	P3761	1.5% 수중
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Dissection solution
Leiboviz의 L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1 팩 1 L 물
콜라겐 분해 효소 IV	시그마	C5138	2 mg/mL in L-15
HEPES	시그마	7365-45-9	10
mMName	Company	카탈로그 번호	코멘트
Immunostaining solutions
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	PBS
Triton X-100	Amresco	ZS-0694	PBS
포름알데히		158127
프레스틴 항체	Santa Cruz	SC-22694	dil 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11055	dil 1:600
Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma	P1951	dil 1:200
DAPI	Solarbio	C0060	dil 1:20
Name	회사	카탈로그 번호	코멘트
Extracellular solution
Leiboviz의 L-15 Medium	Life Technologies	41300-039	1L 물에 1팩
HEPES	Sigma	7365-45-9	10mM
Name	Company	카탈로그 번호	코멘트
세포내 솔루션
CsCl	시그마	7647-17-8	140 mM
MgCl2	Sigma	7791-18-6	2 mM
EGTA	시그마	67-42-5	10 밀리미터미터
HEPES	시그마	7365-45-9	10
mMName	Company	카탈로그 번호	Comments
Equipment
Osmometer	Gonotec	OSMOMAT 3000 basic
Forcep	WPI	14095	핀셋 dumont
마이크로 피펫 풀러	셔터 기기	MODLE-P97
Micro Forge	Narishigen	MF-830
미니 운영 체제	셔터 기기	MP-285
MultiClamp	Axon	700B
저잡음 데이터 수집 시스템	Axon	1440A
ES1 발표자	Tucker-Davis Technologies TDT 시스템, 3 Tucker-Davis Technologies
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Software
SigGenRP 소프트웨어	Tucker-Davis Technologies
BioSigRP 소프트웨어	Tucker-Davis Technologies
jClamp	Scientific Solutions
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Animal
남부 의과 대학의			SD 쥐