방법 논문

유방암에서 HER2 유전자 증폭의이 질을 평가 하기 위해 높은 처리량 검열 플랫폼을 구축

DOI:

10.3791/56686

⸱

2017년 12월 5일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pathology, Fondazione IRCCS Ca' Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2School of Medicine, University of Milan, 3School of Biology, University of Pavia, 4Division of Breast Surgery, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 5Division of Medical Oncology, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 6Department of Biomedical, Surgical, and Dental Sciences, University of Milan

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HER2 양성 세포의 다른 유형의 배포 유방암의 하위 집합에서 관찰 될 수 있다 고 임상 딜레마를 생성 합니다. 여기, 정의 계량, HER2 내부 종양 유전자이 heterogeneously 처리 유방암의 큰 시리즈에 비교 하는 안정적이 고 비용 효율적인 프로토콜을 소개 합니다.

초록

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인간 표 피 성장 인자 수용 체 2 (HER2)에 대 한 표적으로 한 치료 HER2-양성 유방암 환자의 결과 근본적으로 변경. 그러나,의 경우 소수 주요 임상 과제 생성 HER2 양성 세포의 유형이 다른 분포를 표시 합니다. 날짜 하려면, 특성화 및 큰 동료에서 HER2 이기종 유전자 증폭의 정량화에 더 안정적이 고 표준화 된 프로토콜 제안 되었습니다. 여기, 우리는 동시에 여러 개의 유방암의 다른 지형 지역에 걸쳐 HER2 상태를 평가 하는 높은 처리량 방법 제시. 특히, 우리는 향상 된 조직 microarrays (TMAs) 종양의 대상된 매핑 통합을 구성 하는 실험실 절차를 설명 합니다. 모든 TMA 매개 변수는은 제자리에서 교 잡 (SISH)의 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 유 방 조직에 대 한 특별히 최적화 되었습니다 했습니다. (즉, ER, PR, Ki67, 그리고 HER2) 전조 및 예측 생체의 Immunohistochemical 분석 자동화 된 절차를 사용 하 여 수행 되어야 한다. 사용자 지정된 SISH 프로토콜은 다른 고정, 처리 및 저장 프로시저를 받았다 여러 조직에 걸쳐 높은-품질 분자 분석을 수 있도록 구현 되었습니다. 이 연구에서 우리는 증거--방침의 특정 DNA 시퀀스 heterogeneously 처리 되 고 여러 가지 지형 영역에 동시에 지역화 된 유방암 효율적이 고 비용 효율적인 방법을 사용 하 여 수를 제공 합니다.

서론

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HER2 proto-oncogene overexpressed 이며 모든 침략 적인 유 방 암1,2의 15-30%에서 증폭 이다. HER2 overexpression의 존재에 의해 유추 됩니다 > 얼룩 (3 +), 유전자 증폭 HER2/centromere 비율은 ≥2 또는 유전자 복사 번호는 ≥6 때 평가 될 수 있다 동안에 계산에 강한 막 immunohistochemical (IHC)와 10%의 셀 제자리 교 잡 (ISH)3에 의해 최소 20 셀.

내부 종양 유전자이 바이오 마커의 평가 및 치료 응답4잠재적으로 불리 한 기여자 되 고 유방암에서 널리 설명 되었습니다. 에 따르면 대학의 미국 병리학 자 (모자), HER2 이종 존재 HER2 에 증폭 하는 경우 > 5%와 < 종양 침투의 50% 세포5. 유감 스럽게도, 유방암에서 HER2 공간이 성분의 실제 발생률 남아 병리학 사이 논쟁의 주제, 몇몇 저자는 유지 그것은 대단히 드문 이벤트와 최대를 제안 하는 다른 경우의 40%는 HER2 이기종1,5,6,7,8,,910. 이 상태를 지탱 하는 생물 학적 메커니즘에도 불구 하 고는 하지 아직 완전히 명백 하 게, 내부 종양 HER2 이종의 전조 및 임상에 미치는 영향은 유 방 암 환자11에 대 한 중요 한.

최근, 밝은 분야 분자 기술이, 발 틱 (CISH) 실버 틱 (SISH), 형광 분 (물고기)12에 비해 몇 가지 장점을 함께 FFPE 직물에서 HER2이 감지 하는 신뢰할 수 있는 방법으로 등장 했습니다. 유감 스럽게도, 단일 경우의 대량 분석 대형 코 호트 연구에서 허무 남아 있습니다. 여러 그룹 histochemistry, IHC와 ISH TMA 기술과 조합 수 암 생물학13,14,,1516의 연구에 귀중 한 전략을 나타내는 제안 했다. 이 널리 채택 된 방법으로 다른 환자에서 조직 샘플 분석할 수 있습니다 동시에, 조직 및 고용 하 고 그로 인하여 경우14의 큰 시리즈의 유니폼 분석을 육성 시 약을 최소화. 그러나, 아무 프로토콜 다른 처리 시 약, 고정 배, 및 고용, 같은 보존 방법으로 보관을 받았다 여러 조직 샘플 동시 처리량이 높은 분자 특성에 대 한 사용할 수 있습니다. 블록입니다.

유방암에서 HER2 공간이 성분의 전조와 임상 의미를 감안할 때, 우리 heterogeneously 처리 경우의 큰 시리즈에 그것을 평가 하는 통합된 분자 플랫폼을 개발 했다. 여기, 우리는 생성 하 고 SISH 통해 유방암의 높은 수율 TMAs에 HER2 증폭의 내 종양이 분석 실험실 전략 묘사. 다음 프로토콜은 측정 하는 종양에 대 한 개발 되었습니다 > 5 m m (> TNM 2017에 따르면 pT1b)17. 작은 병 변, 탈모 직렬 섹션에 분석을 수행 하는 것이 좋습니다. 우리의 절차 각각의 경우에 대 한 6 가지 영역 (범위 4-8)의 의미를 포괄 최대 30 유방암의 동시 IHC 및 SISH 분석 할 수 있습니다. 모두 180 조직 코어 직경, 코어, 그리고 그리드 가장자리 사이 2 밀리미터 사이 500 µ m에서에서 1 m m의 각 TMA 블록에 대해 생성 됩니다.

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프로토콜

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이 연구는 IRCCS Ca에서 제도적 검토 보드에 의해 승인 되었다 ' Granda 재단, 폴 병원, 밀라노, 이탈리아.

1입니다. 다양 한 환자와 조직 표본

  1. 모든 제공 되며 고 오신 (H & E) 및 원래 진단에서 IHC 슬라이드 포함 하 여 분석, 모든 경우의 보관 슬라이드를 검색 하 고, 있으면, 하나의 H & E의 일치 비 종양 약 유 방 조직 (예를 들어, 수술 여백) .
  2. 케이스 검토를 수행 합니다.
    참고:이 작업에 대 한 유 방 병 리에 경험을 가진 적어도 2 명의 병리학 진단 슬라이드 토론 고 해야 collegially 불일치를 해결 합니다. 사용 하 여 기존의 현미경 또는 telepathology 도구 (선호 multicentric 연구에서 후자). 경우, 모든 귀에 거슬리는 경우를 제외 합니다.
    1. 18유 방 종양의 세계 보건 기구 (WHO) 분류의 최신 버전에 따라 모든 경우의 조직학 재분류를 수행 합니다.
    2. 그 각각의 경우에 정상적인 조직을 보관 임상 샘플에 존재 하는 경우 구성 하나 이상의 종양 약 비 터미널 ductal lobular 단위를 확인 하십시오.
    3. 표시 유형이 다른 모든 종양 약 영역 식별 cytological, 건축, 또는 IHC 기능 (공동으로 수행 하는 병리학 자 고 누구는 TMAs를 건설할 것 이다 technician(s)) 밝은 분야 현미경을 사용 하 여.
  3. 유리 슬라이드에 표시와 함께 또는 디지털 슬라이드 소프트웨어 (그림 1A)에 적절 한 도구와 개별 지형 영역을 강조 표시 합니다.
  4. 선택한 슬라이드에 따라 달라 집니다, 보관 함에서 해당 FFPE 블록을 검색 합니다.
    참고: TMA를 최적화 하기 위해 건설, 조직 소모를 방지 하 고 보존 TMA 펀치 구조적 무결성, 경우 < 1 mm 두께 잔여 조직을 제외 해야 합니다.

2. 설계 및 TMAs Kononen 기술에 기반을 구축합니다

  1. 만들기 각 케이스의 고유 영역의 레코드를 통합 새 스프레드시트 파일을 엽니다. 표 1에 exemplified 별도 열에 다음 데이터를 포함: 사례 ID, 블록 ID, 지역 ID, 조직 유형 (예, 정상 조직, 침략 적 구성 요소 histotype, 제자리에서 구성 요소 histotype), 지형 (예를 들면, 종양 코어, 침략 앞), 형태 (예를 들면, 핵 학년, 건축, mitoses, cytological 기능), 생체 상태 (즉, 에스트로겐 수용 체 (ER), 황 체 호르몬 수용 체 (홍보), Ki67, 그리고 HER2), 그리고 사용할 수 있는 모든 다른 IHC 기능.
    1. 문서를 저장 합니다.
  2. TMA 프로젝트를 만듭니다.
    1. 설치 하 고 TMA 디자이너 소프트웨어를 엽니다.
    2. TMA 받는 블럭과 정의: 파일 메뉴를 통해 액세스 > 새로 만들기 > 블록 또는 CTRL + B를 사용 하 여
    3. 첫 번째 필드 채우기 또는 Tab 키를 누르고 파라핀 블록의 치수 입력를 클릭: 폭 35 (mm), 높이 20 (mm). "여백" 값 (즉, 파라핀 지 m m에서에서 거리)으로 "2" 형 (그림 1B). 적절 한 버튼을 클릭 하 여 데이터를 저장 합니다. 받는 사람 블록의 새 서식 파일 지금 저장 고 새로운 조직 배열 서식 파일에서 사용할 준비가.
    4. 조직 배열 프로젝트 만들기: 파일 메뉴에 액세스 > 새로운 > 조직 배열 또는 CTRL + t.를 사용 하 여
    5. 조직 배열, 의견, 및 저자, 이름 입력 후 다음 클릭 합니다 "." "가져오기" 아이콘을 클릭 합니다 받는 사람 블록 이전에 만든 서식 파일을 선택 하 고 클릭 합니다 "."
    6. 라운드 단추를 클릭 하 여 자리 크기 1 mm를 선택 합니다. 인근 관광 명소의 2 개의 센터 사이 공간이 자리 간격으로 500 µ m를 선택 합니다. 231 되어야 계산기 아이콘 생성, 관광 명소의 총 수를 계산을 클릭 합니다. 클릭 "다음."
    7. 그것을 한 번 클릭 하 여 자리 번호 모드를 정의 합니다. 버튼을 클릭 "정의" 격자 및 하위 표를 만들려고 합니다. 중앙 선 (6 선) 삭제와 8과 15 열. 방향에 대 한 1 번 줄의 3 명소를 유지 합니다. 그림 2에 표시 최종 지도 183 명소의 총 수를 포괄 한다.
    8. 조직 유형 목록 정의: 파일 메뉴를 통해 액세스 > 새로운 > 조직 유형 또는 CTRL + l.를 사용 하 여 목록
    9. 이전에 정의 된 조직 설명을 삽입 합니다. 아래쪽 화살표를 누르거나 클릭 합니다 + 선 추가 버튼을.
    10. 프로젝트 정의: 파일 메뉴를 통해 액세스 > 새로 만들기 > 부스터 프로젝트 또는 CTRL + p.를 사용 하 여
    11. 조직 배열, 의견, 및 저자, 이름 입력 후 다음 클릭 합니다 "." 스프레드시트 파일, 조직 형식의 목록 및 이전에 적절 한 아이콘을 클릭 하 여 만든 조직 배열 모델을 가져옵니다.
    12. "모두 선택"을 클릭 하 고 각 조직 유형;에 대 한 관광 명소의 수 정의 설정을 적용 하려면 "검색" 버튼 클릭 합니다. 샘플링 되 고이 프로젝트에 있는 받는 사람 블록 전송 되는 코어의 총 수를 나열 하는 테이블에 표시 됩니다. 프로젝트를 저장 하 고 프로그램을 닫습니다.
  3. 수락자 블럭과 (그림 1B)를 준비 합니다.
    1. 65 ° c.에 elasticized 파라핀 정화 금속 금형 채우기
    2. 금속 금형 내부 하룻밤 실 온에서 냉각 파라핀 블록을 둡니다.
    3. 금속 금형에서 파라핀 블록을 추출 합니다. 균열 발생, 블록을 취소 하 고 단계 2.3.1-2.3.3를 반복 합니다.
  4. TMA는 자동 또는 반자동 arrayer19를 사용 하 여 구성 합니다.
    1. 선택한 모든 FFPE 블록과 주석으로 해당 H & E 섹션을 검색 합니다.
    2. 켜고는 arrayer arrayer 회전 목마에 수락자 블럭과 삽입.
    3. Arrayer 제어 역 소프트웨어를 열고, "새로운 조직 배열"에 클릭 하 고 이전에 만든 프로젝트 (그림 1C)를 로드.
    4. "계속"을 클릭 하 고 메뉴에서 기증자 블럭과의 위치를 선택 합니다.
    5. 각 받는 사람 블록에 시작 하는 위치 정의: 화살표 키를 사용 하 여 레이저 빛을 이동 하 고 받는 사람 블록의 파라핀에 왼쪽 가장자리 정렬.
    6. "다음"을 클릭 하 고 세로 맞춤에 대 한 반복 합니다.
    7. "다음" 자동으로 받는 (수락자) 블록의 이전에 정의 된 좌표에 구멍을 만들기를 클릭 합니다.
    8. 빈 펀치.
    9. 샘플링에 대 한 기증자 블록 놓고 관심의 이전 주석된 영역에서 조직 핵심을 제거 합니다.
    10. 받는 사람 (수락자) 블록에 구멍에 기증자 조직 코어를 삽입 합니다.
    11. arrayer에서 기증자 블록을 제거 합니다.
    12. TMA를 완료 될 때까지 2.4.5-2.4.11 단계를 반복 합니다.
  5. 살 균 빈 슬라이드에 새로 생성 된 TMA 블록의 조직 쪽을 넣고 5 분 동안 45 ° C에서 실험실 오븐에 넣어.
  6. 부드럽게 5 슬라이드에 블록을 누르십시오 s 조직 코어를 평평 하 게. 총 2 회) (한 번 반복 합니다.
  7. 오븐에서 슬라이드와 TMA 블록을 제거 하 고 뒤집고, 부드럽게 슬라이드에서 블록을 분리.
  8. 65 ° c.에 elasticized 파라핀의 얇은 층으로 TMA 조직 표면
  9. TMA 블록을 2 h에 대 한 실 온에 둡니다.
  10. 24 h 4 ° C에서 TMA 블록을 전송 합니다.
    참고: TMA 블록 저장할 수 있습니다 4 ° C에 피로까지.

3. 조직화 학적인 및 Immunohistochemical 분석

  1. TMA 섹션을 잘라.
    1. 파라핀 진정 10 분-10 ° C 표면에 파라핀 사이드와 TMA 수락자 블럭과 내려 놓습니다.
    2. 초순에 채워 부양 목욕 고 열 38 ° c.에 설정
    3. 새로운 블레이드를 회전 톰에 놓고 왁 스 블록 블레이드 얼굴과 수직 평면에 정렬 있도록 톰 척에 블록을 삽입 합니다.
    4. 블레이드와 블록을 신중 하 게 접근 하 고 되도록 위치 정확한; 몇 얇은 섹션을 잘라 필요한 경우 조정 합니다.
    5. 3 µ m 두께 섹션을 잘라.
    6. 핀셋을 사용 하 여 섹션을 선택 하 고 목욕 물 표면에 떠.
    7. 일반 및 IHC/분 유리 슬라이드에 물 탕 밖으로 섹션을 선택 하십시오.
    8. 슬라이드를 선반에 놓고 하룻밤 45 ° c 오븐에서 그들을 저장 합니다.
      참고: 일단 준비, TMA 섹션 24 시간 이내 스테인드 해야 합니다.
  2. 조직화 학적인 얼룩 (H & E) 수행 된 autostainer를 사용 하 여.
    1. Autostainer 선반에 슬라이드를 삽입 하 고 10 분 동안 60 ° C에 그들을 배치.
    2. Autostainer와 TMA와 선반 바깥쪽에 직면 하는 표준 H & E 클립으로 로드 스테이션 중 하나에 슬라이드 삽입의 부하 서랍을 엽니다.
    3. 일단 서랍, 시스템에서 자동으로 클립을 인식 닫히고 다음 프로토콜 시작 됩니다: 오븐 역에서 37 ° C (6 분), 크 실 렌 (2 분), 크 실 렌 (2 분), 에탄올 100% (2 분), 에탄올 100% (2 분), 에탄올 95% (2 분), 에탄올 95% (2 분) 증 류 물 (4 분), Carazzi의 되며 (9 분), 저압 흐르는 물 (2 분), 오신 1% (1 분), 저압 흐르는 물 (2 분), 에탄올 95% (20 s), 에탄올 95% (20 s), 에탄올 95% (20 s), 에탄올 95% (20 s), 에탄올 100% (15 s), 에탄올 100% (15 s) 크 실 렌 (30 s), 크 실 렌 (30 s).
    4. 서랍에서 선반을 언로 드 하 고 탑재와 커버 슬립 슬라이드.
      1. 마운트는 피 펫의 한 방울을 수집 하 고 커버 슬라이드의 외부 가장자리에 그것을 넣어.
      2. 슬라이드에 커버 슬립의 젖은 측면을 놓고 산 30 분 동안 건조 하자.
  3. IHC ER, PR, Ki67, HER2 얼룩 수행 자동화 된 immunostainer를 사용 하 여.
    참고: 얼룩 실행을 시작 하기 전에 시스템, 시작 및 확인 소모품 시 약 병 (자료 테이블) 하 고 컨테이너를 낭비.
    1. 10 분 동안 60 ° C에서 분석 TMA 슬라이드를 놓습니다.
    2. Immunostainer 계측기 및 소프트웨어를 시작 합니다.
    3. 홈 보기에서 프로토콜 클릭 한 다음 만들기/편집 프로토콜을 클릭 합니다.
    4. 표준 한 덩어리를 선택 (3, 3'-diaminobenzidine) 기본 서식 파일을 수정 하려면 IHC 절차.
    5. 상자 목록에서 "Deparaffinization" 플래그와 매체 온도 72 ° c.에 설정
    6. Cc1 unmasking 솔루션 플래그, 95 ° C, 및 36 분 보육 시간에 매체 온도 설정 합니다.
    7. 1 차적인 항 체 상자 플래그, 응급실 인라인 디스펜서 (악기 소프트웨어 시 약 회전 목마에 디스펜서를 인식할 것 이다)의 ID를 삽입 하 고 부 화 시간 16 분 설정.
    8. 플래그 Counterstaining 상자, 선택 되며, 그리고 설정 부 화 시간 12 분.
    9. "다른 이름으로 저장" 버튼을 클릭 하 고 프로토콜 이름을.
    10. 다음과 같은 1 차적인 항 체 외피 시간을 사용 하 여 나머지 항 체에 대 한 단계 3.3.3-3.3.9 반복: 홍보 16 분, Ki67 16 분, HER2 12 분 사용 중 희석된 준비--사용 (RTU) 항 체.
    11. 홈 보기에서 레이블 만들기 버튼을 클릭 합니다.
    12. 프로토콜 단추를 클릭 하 고 분석 하는 TMA의 각 ER, PR, Ki67, 그리고 HER2 프로토콜 추가.
    13. /Print 닫기 버튼을 클릭 합니다.
    14. 레이블 서식 파일 나타납니다 레이블에 대 한 TMA Id를 입력 합니다.
    15. 인쇄 버튼 레이블을 인쇄 하 고 다음 TMA 슬라이드에 적용을 클릭 합니다.
    16. 악기 아이콘을 클릭 하 고 "준비"로 악기 시작 모드를 설정 합니다.
    17. 시 약 회전 목마를 포함 하는 후드, 검출 시스템, 열고 1 차 항 체는 다음 후드를 닫습니다.
    18. 로드 하 여 열, TMA 슬라이드 서랍 같은 버튼을 클릭 하 여 닫고 슬라이드 서랍에 전면 버튼을 클릭 합니다.
    19. 악기 시작 모드를 "실행"으로 설정 하 고 지침을 따릅니다.
    20. TMA 악기 슬라이드 제어에 완료 슬라이드 단추와 린스 개방 모든 서랍을 누르면 슬라이드 실행된, 언로드의 끝에 그들에 따뜻한 비눗물 모든 나머지 시 약을 제거 하.
    21. 저압 차가운 실행 물 아래 슬라이드를 세척, TMA 슬라이드를 탈수 하 고 유리 coverslip 각 슬라이드에 적용.
  4. ER, PR, HER2 IHC 분석 수행는 미국 협회의 임상 종양학 (ASCO) 다음 지침, 모자 /와 Ki67 유방암 워킹 그룹 (표 2)에서 국제 Ki67의 권고에 따라.
    참고:이 분석 수행 되어야 합니다 별도로 개별 조직 관광 명소에서 유 방 병리학에서 경험 병리학 자에 의해.
    1. 종양 세포 핵의 ≥ 1% immunoreactive20,21,,2223있다면 긍정적으로 응급실 식을 평가 합니다.
    2. 종양 세포 핵의 ≥ 1% immunoreactive20,21,,2223있다면 긍정적으로 홍보 식을 평가 합니다.
    3. HER2 식을로 평가: a) 점수 3 + 원주 막 얼룩을 완전 하 고 강렬한, b) 점수 2 + 원주 막 얼룩은 불완전 한 약한/온건 하 고 침략 적인 종양 세포의 또는 완전 한 > 10% 이내 및 원주 막 얼룩은 강렬 하 고 침략 적인 종양 세포, c ≤ 10% 이내) 점수 1 + 불완전 막 얼룩이 희미 한/거의 지각할 수 있는 고 침략 적인 종양 세포, d의 > 10% 이내) 부정적인 얼룩이 지는 존재 하는 경우 또는 막 얼룩은 불완전 하 고 희미 한/거의 지각할 수 있는 그리고 ≤ 내 침략 적인 종양의 103,24세포.
    4. 임의로 적어도 1000 종양 약 세포에서 핵 얼룩과 셀의 비율 선택 10 고 전력 분야 (확대, 400 X) Ki67 인덱스 평가25.

4. SISH HER2 분석

  1. TMA 섹션 (반복 단계 3.1)을 잘라.
  2. HER2 위한 SISH는 자동된 immunostainer를 사용 하 여 수행 합니다.
    1. 10 분 동안 60 ° C에서 분석 TMA 슬라이드를 놓습니다.
    2. Immunostainer 계측기 및 소프트웨어를 시작 합니다.
    3. 홈 보기에서 프로토콜 클릭 한 다음 만들기/편집 프로토콜을 클릭 합니다.
    4. 기본 서식 파일을 수정 하려면 "U 듀얼 틱 CKT" 절차를 선택 합니다.
    5. "건조" 상자 목록에서 플래그 하 고 20 분 동안 63 ° C에 온도 설정 합니다.
    6. 플래그 상자 목록, 다음 "셀 컨디셔닝 CC2", "셀"을 조절 하 고 4 분에 86 ° C 및 부 화 시 온도 설정 합니다.
    7. 플래그 CC2 가벼운 (주기 1), 표준 (2 주기), 및 확장 (주기 3) 8 분, 12 분, 8 분, 각각.
    8. 상자 목록에서 "틱-효소 3" 플래그를 16 분 보육 시간을 설정.
    9. HER2DNP 및 CHR17DIG 프로브를 선택 하 고 6 h에 보육 시간을 설정.
    10. 8 분 동안 76 ° C에 세척을 설정 합니다.
    11. 32 분 SISH multimer (SIL 틱 DNP HRP) 부 화 시간을 설정 합니다.
    12. 4 분은 chromogen (SIL 틱 DNP CHRC) 부 화 시간을 설정 합니다.
    13. 24 분 빨간 multimer (빨간 분 발굴 AP) 부 화 시간을 설정 합니다.
    14. 8 분에 빨간 chromogen (빨간 분 발굴 FR) 부 화 시간을 설정 합니다.
    15. 상자 목록에서 플래그 "Counterstaining" "되며 II"를 선택 하 고 8 분 보육 시간을 설정.
    16. 상자 목록에 "-Counterstaining" 플래그 "청소법 시 약"을 선택 하 고 4 분에 보육 시간을 설정.
    17. 3.3.11-3.3.15에서 단계를 반복 (선택 수정 U 듀얼 틱 CKT 프로토콜).
    18. 오픈 후드 시 약 회전 목마를 포함 하는 세척 및 분 검출 시스템 다음 후드를 닫습니다.
    19. 3.3.18-3.3.21에서 단계를 반복 합니다.
  3. HER2SISH 분석 수행: HER2/CEP17이 경우 ≥2.0은 평균 HER2 복사 번호 ≥4.0 신호 셀 당 HER2 유전자 증폭으로 긍정적인 평가 및 부정적인 HER2/CEP17이 경우 < 2.0 HER2 평균 복사 번호 < 4.0 신호/셀3,24.
    참고: IHC와 마찬가지로,이 분석에서에서 수행 되어야 합니다 별도로 개별 조직 명소 경험 유 방 병리학에서과 병리학 자에 의해.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전반적으로, 444 침략 적인 유 방 암 15 TMAs 분 분석 최적화에 반영 되었습니다. 샘플링 2,664 명소 중 2,651 (99.5%) 이전에 선택한 분야의 대표 되었고 따라서 후속 분석에 대 한 순종으로 간주. 내 종양이 종양의 독특한 지형 지역에 HER2 양성 클론의 유형이 다른 배포판에 특정 초점 IHC 및 SIH, 결정 되었다. 표 3 은 다른 histotypes에서 ER, PR, Ki67, HER2 상태에 초점을 맞추고 분석, 경우의 생물 학적 특성 묘사 한다. 특히,의 경우 18%에서 HER2 양성 셀을 표시 하려면 발견 > 종양 세포의 10% 따라서 HER2 양성 평가 대 한 특성을 일치 하 고. 흥미롭게도,이 값은 보고 된 발병 률 범위의 HER2 양성 유방암의 더 낮은 끝에 더 가까이. 다른 한편으로, HER2 상태는 HER2-양성, HER2 음성 유방암 (그림 3

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리가 heterogeneously 처리 유방암의 높은 수율 TMAs HER2 유전자와 그 해당 centromere SISH 분석을 수행 하는 실험실 전략 세부. 이 방법은 비용 효율적 이며 유 방 암 검색 양식 병 리 기록 보관소의 큰 동료에서 HER2 유전자 증폭이 연구에 대 한 대부분 실험실에서 실시 될 수 있습니다.

때문에 HER2의 임상 중요성 유방암과 그것의 다른 유형의 식에 의해 생성 된 과제에서 테스트, 우리는 평가 하기 위해 내부-및 남북-tumor HER2 유전자이 높은 처리량 테스트 프로토콜을 개발 했다. 분석된 분야 특정 cytological, 건축, IHC 특징 기준 미리 침략과 침략 적 구성 요소를 포함합니다.

이 프로토콜에서 신중 하 게 관리 해야 하는 몇 가지 중요 한 단계 있다. 한 필수 단계는 관심의 영역의 선택 이다. 우리은 다양 한 접근 방...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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Surgipath ParaplastLeica Biosystems, Wetzlar, 독일, EU39601006조직 포매 매체, 56 ° C 융점
Eosin Y  1% 수용액Bio Optica, 밀라노, 이탈리아, EU510002Eosin 황색, 수용성
Carazzi' s hematoxylinBio Optica, Milan, Italy, EU506012 Alum hematoxylin preolified using potassium iodate
Diamond qualityLaboindustria, Arzergrande, Italy, EU3353326x76 mm microscope slides
Leica CV MountLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU14046430011slides의 부틸메타크릴레이트 폴리머를 기반으로 단량체가 없는 마운팅 매체
애질런트 테크놀로지스(Dako),  미국 캘리포니아주 산타클라라K8020사용하기 위한 FFPE 접착용 코팅 현미경 슬라이드
N750-BMKU-FS슬라이드 염색 시스템
CONFIRM 항에스트로겐 수용체(ER)(SP1) 토끼 단클론 1차 항체Ventana 의료 시스템, 미국 애리조나주 투손790-43241차 항체, 즉시 사용 가능
CONFIRM 항-프로게스테론 수용체(PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-2223일차 항체, 즉시 사용 가능한
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-42861차 항체, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-44931차 항체, 즉시 사용 가능한
ultraView Universal DAB Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-500마우스 IgG, 마우스 IgM 및 토끼 1차 항체 검출을 위한 간접, 비오틴 프리 시스템
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe CocktailVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4422INFORM HER2 Dual ISH assay - 유방암 환자의 HER2 유전자 상태를 결정하기 위한 이중 색상 현장 혼성화 FDA 승인 자동화 분석 
ultraView Silver ISH DNP Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA800-098
ultraView Red ISH DIG Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA800-505
ISH Protease 3Ventana medical system, Tucson, AZ, USA780-4149ISH 공정에서 관심 대상 DNA 염기서열을 둘러싸고 있는 단백질을 제거하는 데 사용됩니다.
Ventana medical system, Tucson, AZ, USA760-2021Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II CounterstainingVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-2208Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing 시약Ventana medical system, Tucson, AZ, USA760-2037유리 슬라이드의 헤마톡실린 염색 단면을 블루링하기 위한 완충 탄산 리튬 수용액
HybReadyVentana 의료 시스템, Tucson, AZ, USA780-4409ISH 분석을 위한 포름아미드 기반 완충액
EZ Prep (10x)Ventana 의료 시스템, Tucson, AZ, USA950-102IHC 및 ISH 반응 중 조직 샘플에서 파라핀 제거 및 1:10 희석을 위한 농축 용액.
SSC Buffer (10X)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-110염화나트륨 구연산염 완충액 용액은 엄격한 세척 및 염색 단계 사이의 슬라이드를 헹구고 현장 혼성화 반응을 위한 안정적인 수성 환경을 제공하는 데 사용됩니다. 1:5을 묽게 한다.
ULTRA LCSVentana 의료 시스템, Tucson, AZ, USA650-210IHC 및 ISH 반응에서 증발을 방지하기 위해 수성 시약과 공기 사이의 장벽으로 사용되는 사전 희석(즉시 사용 가능) 커버슬립 용액
반응 완충액(10x)Ventana 의료 시스템, Tucson, AZ, USA950-300Tris 기반 완충 용액(pH 7.6 ± 0.2)으로 IHC 및 ISH 중 염색 단계 사이에 슬라이드를 헹굽니다. 1:10을 희석한다.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-223IHC 및 ISH 중 조직 샘플 처리의 전처리 단계. 바로 사용할 수 있습니다.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-224
ultraView Silver Wash IIVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-003IHC와 ISH 염색 단계 사이의 슬라이드를 헹구기 위한 즉시 사용 가능한 솔루션
MicrotomeLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EURM 2255자동 회전식 마이크로톰
멀티스테너Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EUST 5020자동 염색 및 커버 슬립을 위한 워크스테이션
Minicore 1Alphelys, Plaisir, France, EU00-MICO-1TMA Designer 2 임베디드 소프트웨어를 사용한 TMA 구축을 위한 반자동 어레이어
Aperio ScanScope CS2Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EUK080254이미지 캡처 장치 - 디지털 병리학 스캐너
Tissue-Tek III Uni-CassetteSakura Finetek Europe B.V4135카세트
Tissue-Tek Paraform Standard Base MoldSakura Finetek Europe B.V7055스테인리스 스틸 모재 금형
xylene FLEX IHC microscope IHC BenchMark ULTRA Ventana 의료 시스템, 미국 애리조나주 투산에

참고문헌

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