경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 Intramyocardial 주입 및 큰 전 임상 모델에서 셀 배달

요약

심장 재생 의학에 새로운 치료 전략 인 간에 있는 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 전에 큰 전 임상 동물 모델에서 광범위 하 고 상세한 연구를 요구 한다. 여기, 우리는 같은 소설 치료의 효능을 시험 하는 가설에 대 한 귀중 한 토끼, 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 기술을 보여줍니다.

초록

세포 및 유전자 치료는 흥분 하 고 심장 마비와의 설정에서 심장 재생을 위해 유망 전략 감소 방출 분수 (HFrEF). 전에 그들은 사용을 위해 고려 하 고 인간에서 구현 수, 광범위 한 임상 연구 필요 큰 동물 모델에서 안전, 효능, 심근에 전달 한 번 injectate (예를들면, 줄기 세포)의 운명을 평가 합니다. 작은 설치류 모델 제공 장점 (예를 들어, 비용 효율성, 유전자 조작에 대 한 순종); 그러나, 이러한 연구 결과 거의 진료소로 변환 이러한 모델의 한계를 감안할 때. 반대로, 토끼, 동물 모델을 큰 장점 (예, 인간 및 다른 큰 동물에 비해 비슷한 심장 전기 생리학), 있다 좋은 비용 효율적인 균형을 유지 하는 동안. 여기는 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 (IMI) 기술, 최소 침 습, 안전 하 고, 잘 용납 하 고 셀을 포함 하 여 injectates의 대상된 배달에 매우 효과적인 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 토끼 모델의 심근 내에서 여러 위치에 이 기술 구현 하기 위한 우리 또한 널리 임상 심장 초음파 시스템의 장점을 촬영 했습니다. 두기 후에 연습에서 여기에 설명 된 프로토콜, 기본 초음파 기술 연구원 실험, 가설의 목적에서 일상적인 사용을 위한이 다양 하 고 최소한 침략 적 기법의 성능에 유능한 될 것 이다는 토끼 모델에서 심장 재생 치료제의 기능. 역량을 달성 하 고, 일단 모든 절차 토끼 anaesthetizing 후 25 분 내에서 수행할 수 있습니다.

서론

세포 및 유전자 치료 흥미로운 고도 HFrEF에 부상된 심근 재생/수리에 대 한 전략을 개발. 몇 가지 연구는 지속적으로 intracoronary 또는 정 맥 경로^1,2 이상의 IMI의 우수성을 증명 하고있다 셀 배달의 다른 노선의 효과 (예를 들어, 셀 유지 비율)을 비교 ^{, 3 , 4 , 5}. 따라서, 그것은 놀라운 부상된 심근의 줄기 세포 치료의 변환 모델에 대 한 연구의 큰 비율 IMI는 오픈 가슴 절차^{6,7에서에서 직접 보기 아래 수행을 통해 injectate 제공} . 그러나,이 접근 peri 절차 사망률 (자주 아래 보고)⁸의 위험을 운반 절차의 침략 적인 본질을 포함 한 몇 가지 제한이 있다. 또한, 직접 보기 아래 IMI는 심 실 구멍에 실수로 주입에 대 한 가능성을 제거 하지 않습니다. 임상 연습에서 오픈 가슴 수술 동안 IM....

프로토콜

여기에 설명 된 실험 대학 무르시아, 스페인의 윤리 연구 위원회에 의해 승인 했다 고 유럽 연합 지침 2010/63/유럽 위원회의에 따라 수행 했다. 설명 하는 단계는 작업의 계획의 일부를 전적으로이 종이 동반 비디오 촬영을 위해 수행 되지 표준 작동 프로토콜에서 수행 했다.

1. 셀과 포유류 표정 벡터의 준비

참고: 여기, 우리가 간략하게 설명 준비 및 셀 선 (인간 미 발달 신장 293 (HEK 293));의 transfection에 대 한 프로토콜 그러나, 적절 한 셀의 셀 유형에 대 한 특정 프로토콜 최적화 (예를 들어, 줄기 세포) 이어야 한다.

1. 높은 포도 당 Dulbecco HEK 293 세포는이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 1% 나트륨 pyruvate, 2mm 글루타민, 1% 페니실린/스, 보충 하 고 5%를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 incubated 수정의 유지 CO₂ . 일단 셀 하위 confluent 1: 3의 비율로 분할.
2. 분할 셀 미디어, 발음와 살 균 성 세척 한 번는 식 염 수 (PBS)을 버퍼링 시작 하 고 초과 PBS를 제거 한 다음 트립 신....

결과

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI InI:

위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 고 바늘의 팁의 최적의 위치는 심장 초음파와 시작 하는 주입에 의해 확인 되었다, 일단 과거 hyperechogenicity InI의 전달 중 관찰 되었다 (PBS에 10 %v / v) (그림 2E) 대상 지역 (그림 2F) IMI 뿐만 조금 후에. IMI 안락사 후 바로 심장 제거 때 InI의 심장 (그림 3A)의 외부 검사 시 쉽게 볼 수 있었다. 또한, 심장 조직 섹션, 예를 들어, 짧은 축 부분 (그림 3B), 젖.......

토론

기본 목표는의 사용을 활용 하는 동안 토끼 (대형 크기의 전 임상 동물 모델)^17,18, 심근으로 줄기 세포의 배달을 위해 사용 될 수 있는 최소 침 습 기술을 개발 하는 상대적으로 저렴 한 이미징 시스템을 쉽게 사용할 수 많은 임상 연구 센터. 여기, 우리 임상 심장 초음파 시스템을 사용 하 여, 표시 하 고 InI, 추적 기능 제자리에 와 echogenic 속성, 심장 초음파-가이드 성공적인 경 피 적인 대비 널리 사용 가능한 에이전트에 의해 주 었 IMI는 매우 효과적 심장 토끼의 대상 지역에 injectate을 제공 합니다. 우리가 알다시피, 이것은 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI와 셀 배달 토끼^18,19등 큰 동물 모델에서의 첫 번째 설명 이다. InI 사용 이전 연구에서 조직

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HD11 XE 초음파 시스템	Philips	10670267	심장 초음파 시스템.
S12-4	Philips	B01YgG	4-12 MHz 위상 배열 트랜스듀서
초음파 전송 젤 (Aquasone)	Parket laboratories Inc	N 01-08
Vasovet 24G	Braun	REF 381212	over-the-needle 카테터
Omnifix-F 1 ml 주사기	Braun	9161406V
Imalgene (케타민)	Merial	RN 9767	수의학 처방이 필요합니다
Domtor (Medetomidine)	Esteve	CN 570686.3	수의학 처방전이 필요합니다
가열 패드
Faber-Castel TG1	Faber-Castel	16 33 99	인도 (중국) 잉크
Holter Syneflash	Ela 의료	SF0003044S	24 시간 Holter ECG 시스템.
전극 블루 센서®	Ambu (NUMED)	VLC-00-S	홀터 ECG 전극.
Microtome	Leica Biosystems	RM2155
현미경	Olimpus	CO11
ABC Vector Elite	Vector Laboratories	PK-6200	Avidin 비오틴 복합체 키트.
닭 항 GFP 항체	Invitrogen	A10262	1 차 항체.
비오틴화 염소-항-닭 IgG 항체	Vector Laboratories	BA-9010	2차 항체.
3,30-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 (DAB)	DAKO (Agilent)	S3000
형광 현미경	Carl Zeiss MicroImaging	Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG	Elamedical	Syneflash SF0003044S
Dulbecco' s 변형 이글 배지(DMEM)	Fisher Scientific	11965084
10% 송아지 태아 혈청(FCS)	Fisher Scientific	11573397
0.05% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	Fisher Scientific	25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)	Fisher Scientific	11668019
환원 혈청 배지(Opti-MEM)	Fisher Scientific
하이그로마이신 B	칼바이오켐(MERCK)	400051
크실렌(조직학)	피셔 사이언티픽	X3S-4
과산화수소 용액(H2O2)	시그마	H1009
프로나제	피셔 사이언티픽	53-702-250KU

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