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방법 논문

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 Intramyocardial 주입 및 큰 전 임상 모델에서 셀 배달

11K 조회수

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DOI:

10.3791/56699

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2018년 1월 21일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Cardiovascular and Metabolic Research, School of Biological Sciences, University of Reading, 2Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 3Institute of Virology and Immunology (IVI), 4Departamento de Anatomía y Anatomía Comparada, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 5Unidad de Trasplante Hematopoyético y Terapia Celular, Departamento de Hematología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, IMIB, Universidad de Murcia

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

심장 재생 의학에 새로운 치료 전략 인 간에 있는 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 전에 큰 전 임상 동물 모델에서 광범위 하 고 상세한 연구를 요구 한다. 여기, 우리는 같은 소설 치료의 효능을 시험 하는 가설에 대 한 귀중 한 토끼, 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 기술을 보여줍니다.

초록

세포 및 유전자 치료는 흥분 하 고 심장 마비와의 설정에서 심장 재생을 위해 유망 전략 감소 방출 분수 (HFrEF). 전에 그들은 사용을 위해 고려 하 고 인간에서 구현 수, 광범위 한 임상 연구 필요 큰 동물 모델에서 안전, 효능, 심근에 전달 한 번 injectate (예를들면, 줄기 세포)의 운명을 평가 합니다. 작은 설치류 모델 제공 장점 (예를 들어, 비용 효율성, 유전자 조작에 대 한 순종); 그러나, 이러한 연구 결과 거의 진료소로 변환 이러한 모델의 한계를 감안할 때. 반대로, 토끼, 동물 모델을 큰 장점 (예, 인간 및 다른 큰 동물에 비해 비슷한 심장 전기 생리학), 있다 좋은 비용 효율적인 균형을 유지 하는 동안. 여기는 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 (IMI) 기술, 최소 침 습, 안전 하 고, 잘 용납 하 고 셀을 포함 하 여 injectates의 대상된 배달에 매우 효과적인 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 토끼 모델의 심근 내에서 여러 위치에 이 기술 구현 하기 위한 우리 또한 널리 임상 심장 초음파 시스템의 장점을 촬영 했습니다. 두기 후에 연습에서 여기에 설명 된 프로토콜, 기본 초음파 기술 연구원 실험, 가설의 목적에서 일상적인 사용을 위한이 다양 하 고 최소한 침략 적 기법의 성능에 유능한 될 것 이다는 토끼 모델에서 심장 재생 치료제의 기능. 역량을 달성 하 고, 일단 모든 절차 토끼 anaesthetizing 후 25 분 내에서 수행할 수 있습니다.

서론

세포 및 유전자 치료 흥미로운 고도 HFrEF에 부상된 심근 재생/수리에 대 한 전략을 개발. 몇 가지 연구는 지속적으로 intracoronary 또는 정 맥 경로1,2 이상의 IMI의 우수성을 증명 하고있다 셀 배달의 다른 노선의 효과 (예를 들어, 셀 유지 비율)을 비교 , 3 , 4 , 5. 따라서, 그것은 놀라운 부상된 심근의 줄기 세포 치료의 변환 모델에 대 한 연구의 큰 비율 IMI는 오픈 가슴 절차6,7에서에서 직접 보기 아래 수행을 통해 injectate 제공 . 그러나,이 접근 peri 절차 사망률 (자주 아래 보고)8의 위험을 운반 절차의 침략 적인 본질을 포함 한 몇 가지 제한이 있다. 또한, 직접 보기 아래 IMI는 심 실 구멍에 실수로 주입에 대 한 가능성을 제거 하지 않습니다. 임상 연습에서 오픈 가슴 수술 동안 IMI 치료 세포 배달, 예를 들어에 대 한 적절 한 방법이 될 수, 동안 관상동맥 우회 이식 수술 (관상); 그러나,이 방법은 않을 수 있습니다 셀 배달에 대 한 적절 한 비-허 혈 성 근원 (예를 들어, HFrEF 안트라사이클린 유발 심근 (AICM)을 보조)의 글로벌 심근에.

의심의 여지가 그 허 혈 성 심장 질환 (IHD)는 HFrEF의 가장 일반적인 원인입니다 (~ 66%)9,10; 그러나, AICM를 포함 하 여 비-허 혈 성 심근 여전히 영향을 미치는 환자 HFrEF (33%)9 의 상당 비율을 차지 . 실제로, 임상 종양학의 최근 발전 귀착되 유럽, 암 환자12의 향상 된 생존에 대 한 전반적인 트렌드와 비슷한 숫자의 견적 미국 혼자11, 암 10 백만 이상의 생존자 ,13. 따라서, 환자 수가 증가 주어진와 같은 줄기 세포 이식 줄기 세포 전달의 효과적이 고 최소 침 습 루트의 시험 뿐 아니라 비-허 혈 성 심장 근육 병 증에 대 한 최대 중요성은 소설 치료의 혜택을 탐험, cardiotoxicity 보조 항 암 약물에 의해 영향을 받습니다.

노트, 가설 연구 부상된 심근을 자주으로 수리 재생성을 목표로 줄기 세포 치료를 사용 하 여 테스트 (예:마우스, 쥐) 작은 설치류의 사용을 포함. 이러한 모델 종종 일반적으로 일부 연결된 한계 (예를 들면, 반향)14있는 선형 배열 트랜스듀서를 장착 하는 심근 기능의 평가 위한 비싼 높은 주파수 초음파 시스템을 필요로 합니다. 그러나, 토끼, 대표 하는 대형 전 임상 모델을 다른 모델 HFrEF에서 줄기 세포 치료의 가설에 대 한 몇 가지 장점이 있다. 따라서, 쥐 및 쥐, 달리 토끼 유지 Ca+ 2 교통 시스템 및 인간과 기타 큰 동물 (예:개, 돼지)15,16,17의 유사한 세포 생리학 ,,1819. 또 다른 장점은, 심장 초음파 이미징 사용 하 여 상대적으로 저렴 한과 널리 임상 심장 초음파 시스템 상대적으로 높은 주파수 위상 배열 트랜스듀서, 예를 들면, 12mhz와 같은 대 한 그들의 순종은 그 신생아 및 소아 심장에서 자주 사용 됩니다. 이러한 시스템 첨단 기술, 우수한 echocardiographic 이미징 허용 하 고 그들은 고조파 이미징20의 우월의 활용. 또한,에 배달 심장 재생 요법 (예를 들어, 줄기 세포 치료)의 잠재력, 그들의 안전, 효능, cardiomyogenic 잠재력으로 평가 injectate의 운명의 한 번의 광범위 한 가설에 심근, 인간의 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 그리고 그들은 큰 전 임상 동물 모델, 토끼17,19의 사용을 필요로 하기 전에 필수입니다. 여기, 우리는 줄기 세포 이식에 기초를 둔 치료 비-허 혈 성 심근20 대를 겨냥 하는 임상 심장 초음파 시스템을 사용 하 여 경 피 적인 대비-심장 초음파 유도 IMI 통해 셀 배달에 대 한 최소 침 습 기술을 설명합니다 . 우리는 또한 토끼 심장에 injectate의 한 초음파 대비 에이전트와 제자리에서 추적으로 인도 잉크 (InI, 또한으로 알려진 중국 잉크)의 혜택을 설명합니다.

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프로토콜

여기에 설명 된 실험 대학 무르시아, 스페인의 윤리 연구 위원회에 의해 승인 했다 고 유럽 연합 지침 2010/63/유럽 위원회의에 따라 수행 했다. 설명 하는 단계는 작업의 계획의 일부를 전적으로이 종이 동반 비디오 촬영을 위해 수행 되지 표준 작동 프로토콜에서 수행 했다.

1. 셀과 포유류 표정 벡터의 준비

참고: 여기, 우리가 간략하게 설명 준비 및 셀 선 (인간 미 발달 신장 293 (HEK 293));의 transfection에 대 한 프로토콜 그러나, 적절 한 셀의 셀 유형에 대 한 특정 프로토콜 최적화 (예를 들어, 줄기 세포) 이어야 한다.

  1. 높은 포도 당 Dulbecco HEK 293 세포는이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 1% 나트륨 pyruvate, 2mm 글루타민, 1% 페니실린/스, 보충 하 고 5%를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 incubated 수정의 유지 CO2 . 일단 셀 하위 confluent 1: 3의 비율로 분할.
  2. 분할 셀 미디어, 발음와 살 균 성 세척 한 번는 식 염 수 (PBS)을 버퍼링 시작 하 고 초과 PBS를 제거 한 다음 트립 신-Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (5 분, 37 ° C) x 0.5 2.5 mL와 함께 품 어.
    1. DMEM 미디어 (위에서 설명한 대로 보충)의 한 볼륨 추가 반응을, 중지 하 고 다음 천천히 그리고 부드럽게 위아래로 전자 피 펫으로 발음 하 여 세포를 분리.
  3. 다음, 적절 한 컨테이너 (예를 들어, 15-50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브)에 세포 현 탁 액을 전송. Centrifuge 스윙 양동이 (100 x g)에 상쾌한 삭제 하 고, 두 번 살 균 PBS 가진 펠 릿을 세척.
  4. 신선한 문화 플라스 크 또는 로컬 실험실 관행에 따라 큰 요리에 신선한 DMEM 미디어 및 적절 한 셀 밀도 (예를 들어, 75 cm2 플라스 크에 1 x 106 셀)에 씨앗에 펠 렛을 resuspend.
    1. 2 일 마다 신선한 미디어와 기존 미디어를 교체 합니다.
      참고: 표정 벡터 pIRES1hyg에서 파생 되었고 제조업체의 지침에 따라 앞에서 설명한21사용. p(EGFP) IRES1hyg로 BamHI + 노트를 BamHI로 pEGFP-n 1에서 삽입 + 노트 소화 pIRES1hyg21EGFP cDNA subcloning 의해 생성 된.
  5. transfection, 전에 1 일 0.5 x 12 또는 24 잘 조직 배양 배지에서 105 셀/c m2 의 조밀도에 씨 HEK 293 세포.
  6. Transfection 당일 별도 1.5 mL microcentrifuge 관 (1 관/잘)에서 DNA 지질 transfection 시 약 단지를 준비 합니다.
    1. 각 튜브에 감소 된 혈 청 매체의 250 µ L을 추가 하 여 시작 하 고 다음 4 µ g의 DNA를 추가 (부드럽게 혼합).
    2. 그 후, 각 관에 10 µ L 지질 transfection 시 약의 이전 준비 믹스 및 감소 된 혈 청 매체의 250 µ L에서 250 µ L을 추가 (다시 부드럽게 혼합).
    3. 마지막으로, transfections, DNA 지질 transfection 시 단지 4 h, HEK 293 세포를 배양 하 여 진행 DMEM 매체 보충 (단계 1.1), 위에서 설명한 대로 대체 하 고 또 다른 48 h. 안정적인 수행 약물 선택에 대 한 품 어 100 µ g/mL hygromycin B.와 transfectants
  7. 트립 신 (1.2 단계) 위에서 설명한 대로 HEK 293 세포를 분리 합니다. 씻은 후 멸 균 PBS에 셀, 마지막 셀 5 x 106/mL의 농도 달성 하기 위해 (예를 들어, 10 %v / v PBS에 InI), 적절 한 차량에 resuspend.

2입니다. 토끼의 준비

참고: 최적의 형태 및 동물의 심장의 기능을 평가 하는 IMI에 대 한 토끼와 변환기의 위치. 따라서, 그것은 실험 설계에 의해 정의 된 대로 완전 한 echocardiographic 시험20 IMI (아래 참조), 이전 및 이후의 시간 지점에서 수행 하는 것이 좋습니다. 이것은 특성을 평가 하는 기준 해 부와 기능적인 동물에서 심장의 주사를 받게 되며 또한 심장의 기능에 IMI의 효과 평가 하고자 합니다.

  1. 심장 혈관 이미징에 대 한 멀게 패션에서 고 수의 내과 및 심장 초음파/유럽 협회의 미국 사회의 미국 대학 심장 초음파 위원회의 지침에 따라이 검사를 수행 22 , 23 , 24.
  2. 전체 echocardiographic 연구를 통해 동시 1-리드 심전도 (ECG) 추적을 가져옵니다.
  3. 마 취 제와 함께 토끼를 anesthetize 10 mg/kg, medetomidine 200 µ g/k g, 근육 (인스턴트 메신저) 주사와 함께.
  4. 마 취의 관리에 따라 10-20 분 후 마 취의 수준을 확인 합니다.
  5. 널리 가슴 머리를 제거 하는 머리 깎기를 사용 하 여 (예를 들어, 하위 xiphoid 지역 목 아래) (그림 1A).
  6. 오른쪽 forelimb (mediocubital 지역)의 두 뒷 다리 사지 (mediotibial 지역)의 내부 얼굴에 1-2 cm2 의 추가 영역을 면도 (그림 1B).
  7. 접착제 ECG 전극 동기적 과정 (그림 1C) 심장 박동을 모니터링 하는 사지의 면도 영역에 배치 합니다.
  8. (그림 1C) 테이블에 연결 된 외과 테이프를 사용 하 여 뻗은 팔 다리와 동물 열 담요에 부정사 decubitus 위치에 놓습니다.
    1. 귀는 근육이 수축 거꾸로 뒤는 머리/토끼, 그리고 있기 때문에이 절차를 통해 동물의 흉부의 정확한 위치를 유지 하는 데 도움이 그것의 앞 발 보다 낮은 위치에서 다는 것을 확인 하십시오.
  9. 동물 얼굴 마스크 전체 절차 (100%, 2-3 L/min)에 걸쳐 산소를 관리 하는 동안 자연스럽 게 호흡을 허용 합니다.

figure-protocol-1
그림 1입니다. IMI는 토끼의 준비. (A) 흉부;에서 헤어 클립 (B) 사지;에서 헤어 클립 (C) 전극을 연결 하 고 열 담요에 뻗은 다리는 토끼를 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3. 경 피 적인 대비 IMI 심장 초음파 기반 기술 토끼에

  1. 청소 하 고 소독 액체를 기반 솔루션으로 흉부의 피부.
    1. 전체 절차를 통해 무 균 기술을 사용 하 여 현재 모범 사례에 따라.
    2. 가능 하다 면, 그리고 합리적으로 가능한 경우, 포함 하 되이 제한 되지 않음, 가운, 장갑, 외과 상처 커튼, 살 균 초음파로는 테이블에 대 한 자료를 드레싱 살 균 살 균 소재를 사용 하 여 완전히 멸 균 절차 수행 트랜스듀서 커버 및 살 균 초음파 젤. 이 최소 수신 IMI, 동물 병원 균 도입의 위험을 줄일 것 이다 이며 임상 설정 (예를 들어, 심장 찔린 동안)에 표준 연습.
      참고: 그것은 항상 로컬 기관에 적용 가능한 동물 연구의 지역 및 국가 규정 및 국가 연습 진행을 권장.
  2. 가슴 및 변환기, 그리고 실험의 목 변환기 코드 초음파 전송 젤을 적용, 종종 해부학을 시각화 하 고 있는 IMI에 대 한 계획에 도움이 되는 동물의 심장의 빠른 창 스캔 합니다.
  3. 4회-6번째 있는 공간, 2-3 cm는 부각의 각으로 오른쪽 parasternal 라인에서 변환기를 수동으로 배치 ~ 흉 벽 (그림 2A)의 오른쪽에 관하여 90 °.
  4. 있는 공간으로 그것의 anteroposterior 및 젖꼭지 근육의 수준에서 수정 된 짧은 축 보기를 최적화 하기 위해 dorsoventral 각도 변환기의 위치를 조정 합니다. 오른쪽 심 실 (RV), 좌 심 실 (LV), interventricular 심장 (IVS), 후부 벽 (비밀 번호), 뿐만 아니라 anterolateral (알) 및 (그림 2B) posteromedial (오후) 젖꼭지 근육이이 보기에서 확인 합니다.
    1. (예를 들어, 버튼, 다이얼) 시스템에 적절 한 컨트롤을 사용 하 여 깊이 크게 증가 하 여 넓은 시야를가지고.
    2. 이 보기, 뿐만 아니라 endocardial 및 epicardial 등고선의 적절 한 차별화에 대칭 이미지를 얻기에 특히 주의 하 고, 필요한 경우 이미지 최적화 컨트롤 (예를 들어, 이득)을 통해 조정.
  5. 일단 최적의 echocardiographic 보기 (그림 2B)을 얻을 두 번째 연산자 IMI (아래 참조)를 수행 하는 동안, 절차의 나머지 부분에 걸쳐이 위치를 유지 합니다.
    1. 변환기를 들고, 하는 동안 은폐 해야 항상 직면 하 고 있을 앞으로, 이후 단계 (그림 2A, C)에 바늘의 정렬 되므로 변환기 방향 표시 하지 마십시오.
  6. 24 G 바늘 1 mL 주사기에 연결, 왼쪽된 hemithorax의 피부 근처 바늘 변환기에 관하여 대칭 미러링 위치에 놓습니다. 그런 다음, 수동으로 정렬 바늘의 각도 변환기 방향 마크와 함께 ~ 90 ° (그림 2C), 천천히 바늘을 통해 피부와 흉 강에 진출.
    참고:이 위치 및 방향에서 경 피 적인 바늘 삽입을 용이 하 게 초음파 빔 (2D 그림, E)의 비행기에서 바늘의 시각화 되므로 실시간으로 모니터링 하 고, 필요한 경우의 조정 (그림 2 G, H) 심근의 대상 지역 기준으로 바늘의 위치입니다.
  7. 대상 위치에서 팁을 천천히 제공 하는 injectate (최대 사출 사이트 당 0.25 mL) 10-30 s (그림 2E), 치료를 천천히 그리고 부드럽게 주입 심근의 범위를 증가 하는 동안 바늘을 제거 하는 동안 내.
    1. InI를 사용 하 여 10% (v/v)에 희석 PBS 표준화 기술, 그리고 현장에 추적에 대 한 확인 심근 내의 모든 4 개의 IMI 사이트의 성공적인 대상으로 역량, 또한 취득 하는 동안 심한 병 리와 histopathology (참조 대표 결과)입니다. 역량 달성 되 면 원하는 경우 InI 적당 한 상업적인 초음파 대비 에이전트에 의해 대체 수 있습니다.
      참고: 10% (v/v) InI에에서 희석 PBS 또는 셀 없이 과거 hyperechogenicity (즉, 에코 밝은 모양)에서 심근 결과에 주입 (그림 2E, F)의 대상 사이트에서의 배달. 과도 감속 또는 조 숙한 심 실 수축 (예를 들면, 절연 couplets, 세 쌍둥이)와 관련 된 심장 박동의 가속은 epicardium와 바늘의 첫 접촉에서 자주 관찰 된다 뿐만 아니라 동안 또는 IMI 직후. 그러나, 아니 생명을 위협 하는 부정맥, 개발 하 고 심각한 부작용은 거의 IMI 사출 사이트 당 injectate의 최대 0.25 mL (1.25 x 106 셀)를 사용 하 여 관찰 ( 대표 결과 토론을 참조).
  8. (3 심 실 왼쪽에 무료 벽 (LVFW)와 IVS에서) 4 개의 대상 IMI 사이트의 각각에 0.25 mL의 주입을 완료 하는 데 필요한 바늘의 부각의 각의 미묘한 변화를 수행 합니다.
  9. 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI 절차를 완료 한 후 (예를 들어, 직렬 ECG 추적 및 24 시간 Holter 심전도 통해), 심장 리듬을 평가 하 고 검사 직렬 창 echocardiographic의 부재를 확인 하 합병증, 동물 완전히 가벼운 주기 룸에 마 취 및 다음 전송에서 복구 될 때까지.
    1. 여기, 우리는 24 h에 대 한 심장 리듬에 InI와 IMI의 효과 모니터링 하는 데 24 시간 Holter ECG 사용 합니다. 이 위해, 우리 정상 표현 형 (일반 그룹)와 6 토끼의 그룹 및 독 소 루비 (cardiotoxic 안트라사이클린 약물, 암;의 처리에 일반적으로 사용의 정 맥 행정을 받은 6 토끼의 그룹 비교 DOX 그룹) 2 mg/kg의 복용량에 / 8 주, 주 다음 두 동료 InI와 IMI를 받았다.

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그림 2 . 토끼에서 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입. (A)의 각도에서 오른쪽 hemithorax에 변환기의 배치 ~ 90 °. (B) 토끼에 젖꼭지 근육의 수준에서 심장의 parasternal 짧은 축 보기 (PSSX)의 대표 이미지. (C)의 각도에서 바늘의 맞춤 ~ 변환기 방향 표시를 기준으로 90 °. (D) 심장 (참고 바늘 초음파 광속의 평면에 쉽게 시각 이다)의 PSSX 뷰에서 대상 사이트에서 바늘의 위치입니다. (E 와 F) 인도 잉크 (화살촉 강조 과거 hyperechogenicity)와 intramyocardial 주입 시 대상 사이트에서 hyperechogenicity의 데모. (G) LV 챔버에 바늘의 실수로 위치 (화살촉 바늘 샤프트 강조). (H) Repositioning LV 무료 벽에 바늘의 (화살촉 바늘 샤프트 강조). RV를 = 우 심; 라스베가스 = 왼쪽된 심 실; IVS = interventricular 심장; 비밀 번호 = 후부 벽; 알 = anterolateral 젖꼭지 근육; 오후 = posteromedial 젖꼭지 근육. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. 게시물 IMI 분석

  1. 토끼에서 심장 조직 샘플의 histopathological 분석을 수행 합니다.
    1. 10% 포름알데히드, 다음과 같이 에탄올 농도 증가 함께 탈수 뒤에 조직 24 h에 대 한 수정:
      • 1 x 70% (60 분)
      • 1 x 95 %ethanol/5% 메탄올 (60 분)
      • 1 x 100% (60 분)
      • 1 x 100% (90 분)
      • 1 x 100% (120 분)
      참고: 위의 모든 외피는 실 온 (RT)에서 실시 됩니다. 100% 크 실 렌 (1 시간, RT), 두 번 대체 다음, 그리고 마지막으로 두 단계 (60 분, 58 ° C)25에 파라핀에 포함.
    2. 톰25와 4-5 µ m 조직 섹션을 수행 합니다. 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다.
    3. Masson의 trichrome 방법25,,2627와 hematoxylin에 오신 얼룩이 수행 합니다.
  2. 조직 섹션에서 이식된 마음에서 immunohistochemistry EGFP(+) HEK 293 세포 (예를 들어, avidin 비타민 b 복합체 복합물 (ABC) 메서드를 사용 하 여), 간단히 검색을 수행.
    1. 드 왁 스 100% 크 실 렌 (10 분, RT)에서 4-5 µ m 두꺼운 심장 섹션. 감소 하는 에탄올 농도 솔루션 (100% (2 분)에 2 배, 2 x 95% (2 분), 70% (2 분)에 1 x; 50% (2 분)에 1 x; 1 x 30% (2 분), 1 x ddH2O (2 분)) 실시간으로 세척 하 여 조직 리하이드레이션
    2. (준비가 30% H2O2, 고 추가 메탄올의 재고 솔루션의 5 mL와 함께 최대 50 mL의 총 볼륨) 메탄올 (에서 희석 3% H2O2 의 100 µ L로 섹션을 취재 하 여 내 인 성 과산화 효소 억제를 수행 품 어 30 분, RT), 그리고 다음 Tris 버퍼 염 분 (TBS, pH 7.6)와 침수로 세척.
    3. 0.1%의 100 µ L로 섹션을 취재 하 여 효소 처리를 통해 항 원 unmasking 수행 (0.01 g 10 mL TBS에에서 희석 나 준비) 나 (12 분, RT를 품 어), TBS (5 분, RT) 다음 씻어.
    4. 차단 하는 솔루션 (TBS에서 10%에서 정상 염소 혈 청)에서 품 어 (30 분, RT), 슬라이드 당 100 µ L를 사용 하 여 및 TBS (5 분, RT)로 씻어.
    5. (1 시간, 30 ° C), 1 차적인 항 체 (TBS에서 1: 500)으로 닭 반 녹색 형광 단백질 (GFP)와 incubate 그리고 TBS (5 분, RT)로 씻어.
    6. (1 시간, 30 ° C), 이차 항 체 biotinylated 염소-안티-닭고기 IgG (TBS에서 1: 250)와 incubate 고 TBS (5 분, RT)와 다음 씻어.
    7. Avidin 비타민 b 복합체 복합물 (20 분, 30 ° C)와 함께 incubate 및 다음 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (한 덩어리) (RT, 5-10 분)를 사용 하 여 레이블.
    8. 마지막으로 세척 되며 오신 방법25를 사용 하 여 counterstain 섹션에 RT, 에탄올 농도 (1 x 30% (2 분), 50% (2 분)에 1 x, 70% (2 분)에 1 x; 2 x 95% (2 분), 100% (2 분)에 2 배) 증가 하 여 탈수 하 고 커버 슬라이드를 탑재. 긍정적인, 부정적인 isotype 컨트롤 뿐만 아니라이 포함 됩니다.
      참고: 위에서 설명한 간단한 프로토콜은 아닙니다 일반 immunohistochemistry; 관심의 조직에 대 한 최적화는 필요 합니다.

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결과

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI InI:

위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 고 바늘의 팁의 최적의 위치는 심장 초음파와 시작 하는 주입에 의해 확인 되었다, 일단 과거 hyperechogenicity InI의 전달 중 관찰 되었다 (PBS에 10 %v / v) (그림 2E) 대상 지역 (그림 2F) IMI 뿐만 조금 후에. IMI 안락사 후 바로 심장 제거 때 InI의 심장 (그림 3A)의 외부 검사 시 쉽게 볼 수 있었다. 또한, 심장 조직 섹션, 예를 들어, 짧은 축 부분 (그림 3B), 젖...

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토론

기본 목표는의 사용을 활용 하는 동안 토끼 (대형 크기의 전 임상 동물 모델)17,18, 심근으로 줄기 세포의 배달을 위해 사용 될 수 있는 최소 침 습 기술을 개발 하는 상대적으로 저렴 한 이미징 시스템을 쉽게 사용할 수 많은 임상 연구 센터. 여기, 우리 임상 심장 초음파 시스템을 사용 하 여, 표시 하 고 InI, 추적 기능 제자리에 와 echogenic 속성, 심장 초음파-가이드 성공적인 경 피 적인 대비 널리 사용 가능한 에이전트에 의해 주 었 IMI는 매우 효과적 심장 토끼의 대상 지역에 injectate을 제공 합니다. 우리가 알다시피, 이것은 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI와 셀 배달 토끼18,19등 큰 동물 모델에서의 첫 번째 설명 이다. InI 사용 이전 연구에서 조직

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 EGFP(+) HEK 293 세포를 제공 하기 위한 데이터와 카를로스 부에 노의 수집 하는 동안 제공 하는 우수한 지원 쉴라 Monfort, 브렌다 마르티네스, 카를로스 Micó, 알베르토 Muñoz와 마누엘 몰리 나 감사. 이 작품은 부분적으로 지원 되었다: Fundación Séneca, Agencia 데 많은 y 과학, Región 드 무르시아, 스페인 (JT) (번호 부여: 11935/파이/09); 레드 드 Terapia Celular, ISCIII-서브 성배입니다. Redes, VI PN 데 나 + D + 2008-2011 (no를 부여 합니다. RD12/0019/0001) (JMM), 공동 구조의 유럽 연합 (페더) (JMM); 자금 융자 그리고, 독서 대학, 영국 (AG, GB) (중앙 자금). Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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HD11 XE 초음파 시스템Philips10670267심장 초음파 시스템.
S12-4PhilipsB01YgG4-12 MHz 위상 배열 트랜스듀서
초음파 전송 젤 (Aquasone)Parket laboratories IncN 01-08
Vasovet 24GBraunREF 381212  over-the-needle 카테터
Omnifix-F 1 ml 주사기Braun9161406V
Imalgene (케타민)MerialRN 9767수의학 처방이 필요합니다
Domtor (Medetomidine)EsteveCN 570686.3수의학 처방전이 필요합니다
가열 패드
Faber-Castel TG1Faber-Castel16 33 99인도 (중국) 잉크
Holter SyneflashEla 의료SF0003044S24 시간 Holter ECG 시스템.
전극 블루 센서®Ambu (NUMED)VLC-00-S홀터 ECG 전극.
MicrotomeLeica BiosystemsRM2155
현미경OlimpusCO11
ABC Vector EliteVector LaboratoriesPK-6200Avidin 비오틴 복합체 키트.
닭 항 GFP 항체InvitrogenA102621 차 항체.
비오틴화 염소-항-닭 IgG 항체Vector LaboratoriesBA-90102차 항체.
3,30-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 (DAB)DAKO (Agilent)S3000
형광 현미경Carl Zeiss
MicroImaging		Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECGElamedicalSyneflash SF0003044S
Dulbecco' s 변형 이글 배지(DMEM) Fisher Scientific11965084
10% 송아지 태아 혈청(FCS)Fisher Scientific11573397
0.05% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)Fisher Scientific25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)Fisher Scientific11668019
환원 혈청 배지(Opti-MEM)Fisher Scientific
하이그로마이신 B칼바이오켐(MERCK)400051
크실렌(조직학)피셔 사이언티픽X3S-4
과산화수소 용액(H2O2)시그마H1009
프로나제피셔 사이언티픽53-702-250KU
31985070

참고문헌

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