방법 논문

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

DOI:

10.3791/56702

⸱

2018년 1월 22일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Neuroscience, Section for Ophtalmology and Vision, Karolinska Institutet, 2Clinical Sciences, Intervention and Technology, Division of Obstetrics and Gynecology, Karolinska Institutet

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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망막 색소 상피 세포 건조 연령 관련 황 반 변성의 고급 형태에 대 한 세포 보충 치료 될 수 있습니다. 이 프로토콜 지리적 위축의 눈이 큰 모델 및 질병의이 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식의 생성을 설명합니다.

초록

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지리적 위축 (GA), 건조 연령 관련 황 반 변성의 늦은 단계는 망막 안료 상피 (RPE) 계층, 중요 한 망막 구조 (예를 들면, 대뇌)의 후속 퇴보로 연결의 손실에 의해 특징은 발생 심한 시력 장애입니다. 마찬가지로, RPE 손실 및 시력 감소는에서 보인다 장기 따라 최대 intravitreal 항 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF) 치료를 받고 고급 젖은 연령 관련 황 반 변성 (AMD)과 환자의. 따라서, 한편으로, 그것은 근본적인 RPE 세포 대체 요법으로 사용할 수 있는 무제한 소스에서 효율적으로 파생. 다른 한편으로, 동작 및 질병 반하는의 모델에서 파생 된 셀의 통합 수술을 평가 하는 것이 중요 하다 고 이미징 방법으로 인 간에 적용 된 수로 닫습니다. 여기, 우리 제공 조지아의 전 임상 모델의 생성을 설명 하는 우리의 이전 간행물에 따라 상세한 프로토콜 흰둥이 토끼 눈을 사용 하 여 인간 배아 줄기 세포의 평가 파생 된 망막 색소 상피 세포 (hESC-RPE) 대에 임상 관련 설정입니다. 차별화 된 hESC RPE는 순진한 눈 또는 NaIO3눈에 이식-25 G transvitreal 동위 플 기술을 사용 하 여가 같은 망막 변성을 유도. 퇴 화와 이식 분야의 평가 복합 고해상도 비-침략 적 실시간 이미징에 의해 수행 됩니다.

서론

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이 프로토콜 subretinal 공간에 이식된 hESC RPE의 통합의 평가 허용 하는 지리적 위축 (GA)의 큰 눈이 전 임상 모델의 생성을 설명 합니다. 여기에 설명 된 방법은 hESC1, 외부 망막 손상 및 GA 같은 표현 형의 창조에서 RPE 세포의 풍부한, 순수, 고 기능 인구 생산을 보여 주는 3 최근 출판물에 사용 된 생리 소금 솔루션 (즉, BSS와 PBS) 또는 토끼 눈2,3NaIO3 의 subretinal 주입에 의해 유도. 우리 hESC RPE의 하위 망막 정지 이식 포토 리셉터 구조 용량2광범위 한 기능 monolayers 형태로 입증 되었습니다.

몇 가지 장점이 동반 질병의 조지아 모델의 생성에 대 한 토끼 눈의 사용. 첫째, 크기 토끼 눈의 70%는 성인 인간의 눈의 볼륨은, 일상적으로 사용 하는 작은 설치류 눈 (1000 셀 / µ L 대 50, 000 셀 / µ L)4 보다 훨씬 낮은 세포 밀도 사용 하 여 임상적으로 의미 있는 이식....

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프로토콜

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다음 프로토콜 카롤 린스 카 Instituet의 동물 보호 지침을 따릅니다. 뉴질랜드 백 변종 토끼 (자료 테이블)를 사용 하 여 모든 동물 실험 지역 동물 윤리 위원회 (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd)에 의해 승인 되었습니다 (허용: dnr 56/15). HESC (dnr 2011/745-31/3)의 사용 및 전송 hESC RPE (dnr 2013/813-31/2)의 조작 또한 스웨덴 입법 및 카롤 린스 카 Institutet 규정 이며 지역 인간의 윤리 위원회 (에 의해 승인 되었습니다. Regionala Etikprövningsnämnden 나 스톡홀름).

1. subretinal 주입 나트륨 요오드 산 염 (NaIO3) 눈 큰 동물 모델

  1. 동물 마 취 제 35 mg/kg의 혼합물으로 허벅지에 근육 관리와 30 G 주사기를 사용 하 여 식 염 수에 5 mg/kg xylazine anesthetize 그리고 0.75 %cyclopentolate 및 2.5 %phenylephrine 혼합 사용 안 하는 국 소 약으로 학생 같은데요. 적절 한 anesthetization 확인 동물 그것의 뒤 다리의 하드 핀치에 반응 하지 않는 경우.<....

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결과

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BAF, IR-cSLO, 및 정상적인 흰둥이 토끼 망막의 SD-10 월의 대표 vivo에서 이미지 그림 2에 표시 됩니다. 빛의 반사 SD 10 월 악기에 의해 점령의 그들의 독특한 레벨 다른 망막 층 note

그림 1A , 그림 1B하위 망막 blebs 만들려면 설치 설명 된다: 쓰는 렌즈를 피하기 위하여 3 trocars (그림 1B) limbus까지 1-2 m m의 삽입을 허용 하도록 눈 뚜껑으로 뚜껑 견인 위치 터치, 그리고 30-45 ˚ limbus 병렬 각도에서. Trocars는 선택적 주입 정 빛, 및 공 막 엔 통해 주사 .......

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토론

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이 프로토콜에서 hESC RPE 통합에서 vivo에서 평가 대 한 조지아와 그것의 임상 사용의 눈이 큰 모델의 생성을 설명 합니다.

번역에 대 한 재생 치료의 조지아 및 관련된 질병에 대 한 클리닉7에, 그것은 개발 하 고 충실 하 게 이식 및 이미징에 대 한 임상 메서드를 캡처하는 방법을 최적화 하는 것이 중요. 매력적인이 측면에서 토끼가: 비교적 큰 눈 안 구내 수술 및 표준 이미징의 사용을 허용 하 고 저렴 하 고 쉽게 지 내게 다른 눈이 큰 동물에 비해입니다.

우리는 하위 망막 blebs 하위 망막 손상을 유발 하거나 이식 hESC RPE의 창조에 대 한 표준 transvitreal 25 게이지 동위 플 vitrectomy 기술의 사용을 설명 합니다. 그림 1B에 나와 있는 경우는 vitrectomy 절차 동안 .......

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공개 사항

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작가의 아무도 경쟁 관심사 또는 상반 되는 관심사를 있다.

감사의 글

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이 연구는 시각 장애, 안과 연구, 스웨덴 눈 재단, 임금 Gustav V 재단, ARMEC는 에드윈 요르단 재단 재단법인 크라운 공주 Margareta 카롤 린스 카 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다 Lindeberg 재단, 그리고 Cronqvist 재단입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
NutriStem hESC XF 분화 배지 – bFGF 및 – TGFbBiological Industries06-5100-01-1A
TrypLE Select 1xGibco, ThermoFisher Scientific Corp12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+Gibco, ThermoFisher Scientific Corp14190-094
Cell strainer 40 μ m 나일론VWR732-2757
바늘 30 G 0.5' ’; 0.3mm x 13mmBD Microlance304827
Acrodisc 25mm 주사기 필터AcrodiscPN4612
0.4% 트리판 블루ThermoFisher Scientific Corp152500610.2%
NaIO에서 사용 3Sigma-Aldrich CorpS4007
BSSAlcon Nordic A/S65079550
70% 에탄올Solveco AB1047
케타미놀, 100mg/mL인터벳, Boxmeer51151935mg/kg 케타민
Rompun 수의사, 20mg/mLBayer Animal Health225455mg/kg 자일라진
트리에스센스 사용, 40mg/mLAlcon Nordic A/S412915 2mg 유리체내
사이클로펜톨라트-페닐에프린, 0.75% + 2.5%APL321968각 눈에
ViscotearsLaboratoires Thé 597562
국소 식염수Apotea AB7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mLOmnidea77168100 mg/mL 펜토바르비탈
확장 튜브 사용(해머)MedOne Surgical Inc3223
25 G/38 G 폴리팁 망막하 캐뉼라MedOne Surgical Inc321925 G/38 G
일회용 평면 렌즈Volk
Barraquer Colibri 뚜껑 견인AgnTho's AB42-020-030
밸브가 없는 투관침Alcon Nordic A/S8065751448
발톱 집게 집게Bausch & Lomb Nordic ABET1811
Alcon Accurus 400VS 유리체 절제술 기계Alcon Nordic A/S8065740238
Accurus 25+ 게이지 유리체 절제술 TotalL Plus PakAlcon Nordic A/S8065751493
SD-OCT 장치하이델베르크 엔지니어링Spectralis HRA+OCT하이델베르크 아이 익스플로러 버전 1.9.10.0
사용 24웰 플레이트Sarstedt83.3922
Neubauer 혈구계VWR631-0925
뉴질랜드 알비노 토끼Lidkö pings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE 세포참조 번호 참조 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/mlDechra6605000.5 mL 부프레노르핀 피하 사용
1방울 사용#VWFD10기

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
  2. Bartuma, H., et al.

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태그

25hESC RPE

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