포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

요약

향상 된 프로토콜은 입자 사격 후 보 리 aleurone 세포에서 기자 구문에서 일시적인 유전자 발현의 측정에 대 한 제공 됩니다. 96 잘 접시 효소 분석 실험 연 삭 자동화 된 곡물의 조합을 절차에 대 한 높은 처리량을 제공 합니다.

초록

보 리 곡물의 aleurone 레이어 식물에서 호르몬 통제 유전자 발현에 대 한 중요 한 모델 시스템입니다. Aleurone 세포에서 유전자 발 아에 필요한 또는 스트레스 응답 연관 유전자 abscisic 산 (ABA)에 의해 활성화 되는 동안 초기 종묘 개발 지 베 렐 린 (GA)에 의해 활성화 됩니다. GA와 ABA 신호 메커니즘은 효소 분석 실험을 사용 하 여 측정 결과 과도 식으로 입자 사격을 통해 aleurone 세포로 리포터 유전자 구조를 도입 하 여 심문 수 있습니다. 향상 된 프로토콜을 부분적으로 자동화 하 고 간소화 곡물 균질 단계 및 효소 분석 실험 보고는 기존의 방법 보다 훨씬 더 많은 처리량을 허용. 균질 곡물 샘플 자동된 조직 균질 화기를 사용 하 여 밖으로 실행 되 고 거 스 (β-glucuronidase) 분석 실험 96 잘 접시 시스템을 사용 하 여 실시 됩니다. 프로토콜을 사용 하 여 대표 결과 phospholipase D 활동 ABA, 녹음 방송 요인 TaABF1 통해 HVA1 유전자 식의 활성화에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 것이 좋습니다.

서론

보 리 aleurone 레이어 식물¹호르몬 통제 유전자 발현의 학문을 위한 기초가 튼튼한 모델 시스템입니다. 특히, 스트레스 응답 연관 유전자 abscisic 산 (ABA)에 의해 활성화 되는 동안 발 아 또는 초기 종묘 개발에 필요한 유전자의 수 지 베 렐 린 (GA)에 의해 활성화 됩니다. GA와 ABA 신호 경로 고리로 연결 되었다는, 일부가 활성화 유전자의 표정을 ABA와 반대로¹저해로.

조지아/ABA 신호에 특정 배우의 역할 입자 사격, 기자 구문에 효과 허용 하는 과도 식으로 다음을 통해 이펙터 유전자 구조 도입 되었습니다 이해를 위한 중요 한 전략 다운스트림 유전자 식 결정 됩니다. 거 스 (β-glucuronidase) 등 Luciferase 리포터 유전자를 사용 하 여 특별히 이펙터 구조 받은 셀 내에서 유전자 발현의 과민 하 고 양적 측정을 수 있습니다. 예를 들어 녹음 방송 요인 TaABF1^5,6 인코딩 이펙터 구문의 도입 HVA1 같은 ABA 유발 유전자는 Amy32b ....

프로토콜

1. 준비 이펙터와 취재 원 유전자의 구성

1. 원하는 열려있는 독서 프레임에서 드라이브 식 제정 발기인 (예: 옥수수 유비퀴틴, UBI)를 사용 하는 이펙터 구조를 빌드하십시오. 예를 들어 드라이브 TaABF1⁵의 강한 제정 식 UBI::TaABF1 를 포함 하는 플라스 미드를 생성 합니다.
2. 거 스같은 열려있는 독서 프레임의 업스트림 배치 기자 구조 측정, 그 활동은 발기인을 포함 하는 빌드. 예를 들어 HVA1::GUS HVA1 발기인^2,5에서 측정을 포함 하는 플라스 미드를 생성 합니다.
3. 내부 제어 구조를 구축 (예: UBI::luciferase).
4. 실리 카 바인딩 열을 사용 하 여 프로토콜 ( 재료의 표참조), 각 필요한 유전자 구조에 대 한 높은-품질 플라스 미드를 준비. 자외선 분광학을 사용 하 여 참조 테이블의 재료, 신중 하 게 각 플라스 미드 준비의 농도 측정.

결과

여기에 설명 된 기술은 보 리 곡물의 aleurone 세포로 어떤 테스트 유전자 구조를 소개 사용할 수 있습니다. 테스트 유전자 발현의 수준 다음 있을 수 있습니다 (그림 2)를 편리 하 게 측정. 높은 처리량 프로토콜 크게 여기에 설명 된 연 삭 씨앗과 효소 분석 실험 단계의 효율성을 증가 합니다. 이 방법은 HVA1⁷ABA 유도 유전자 표현의 활성화 녹음 방송 요인 TaABF1^5,6 의 능력을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 여기에 제시 하는 대표적인 결과 HVA1::GUS 기자 구문 UBI::TaABF1 이펙터 구조 (그림 3A)와 aleurone 세포에 도입 되었.......

토론

이펙터 유전자의 도입 구성 입자 사격을 통해, 해 부 결과 호르몬 조절 유전자와 조지아/ABA 신호에 특정 배우의 역할에 대 한 귀중 한 전략은 과도 식 기자 구문 뒤 식입니다.
그러나, 보 리 aleurone 셀^2,3,,45,6 에서 같은 실험 수행에 대 한 기존 프로토콜은 매우 노동 집약 이다. 각 그룹의 폭격 겨우 곡물 손 박격포와 유 봉, 무 균 이어야 하며 결과 추출 거 스와 luciferase 활동에 대 한 개별적으로 분석 됩니다. 현재 프로토콜은 따라서 같은 실험에 포함 될 수 있으며 합리적으로 각 치료에 대 한 포함 될 수 있는 생물 복제의 수를 제한 하는 별도 처리의 수를 제한 합니다. 이러한 제한은 어려워질 더 포괄적.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
GeneElute HP 플라스미드 Maxiprep 키트	Sigma	NA0310-1KT
UV-vis 분광 광도계	Nanodrop	ND-1000
히말라야 보리 곡물		/	다양한 껍질 없는 보리(4°C에서 어둠 속에 보관; C)
숙신산 나트륨	Sigma	S2378	흡수 용액 용 시약
염화칼슘 (이수화물)	Fisher	C79-500	흡수
용액	수용 용액 가정용		20 mM 숙신산 나트륨, 20 mM 염화칼슘, pH 5.0. 사용하기 전에 오토클레이브로 살균하십시오.
클로람페니콜	시그마	C0378	70% 에탄올에 10mg/mL 원액을 준비합니다.
질석	Fisher	NC0430369	질석 플레이트에 사용됩니다.
여과지 서클 (90mm)	Whatman	1001 090	질석 및 포격 전 곡물 준비에 사용
질석 플레이트	집에서 만든	/	유리 페트리 접시에 질석 50mL를 추가합니다. 질석 위에 90mm 종이 원을 놓습니다. 오토 클레이 브.
집게(뾰족한)	Fisher	13-812-42	보리 곡물에서 종피를 제거하는 데 사용됩니다.
겸자(초미세점)	Fisher	12-000-122	보리알에서 종피를 제거하는 데 사용됩니다.
금 마이크로캐리어(1.6 μ m)	BioRad	1652264
macrocarriers	BioRad	1652335
염화칼슘(이수화물)	Fisher	C79-500	2.5 M 원액을 준비하고 -20°C에서 1 mL 분취액을 보관합니다.
spermidine	Sigma	S0266	100mM 원료 용액을 준비하고 500μ를 저장합니다. L 분취량은 -20° C (2 개월 이내 사용).
Rupture Discs (1550 psi)		BioRad
정지 스크린	BioRad	1652336
macrocarrier 홀더	BioRad	1652322
Biolistic 입자 전달 시스템	BioRad	PDS-1000/He
인산나트륨 일염기성 일수화물	Sigma	S9638	1M 인산나트륨 pH 7.2
인산나트륨 이염기성	시그마	S9763	1M 인산나트륨 pH 7.2
1M 인산나트륨 pH 7.2	가정용	시약/	인산나트륨 일염기성 일수화물 6.9g과 인산나트륨 이염기성 7.1g을 결합합니다. 100mL에 물을 넣으십시오. NaOH를 첨가하여 pH 7.2를 얻습니다.
디티오트리에톨 (DTT)	시그마	43819	1 M의 물에 녹여 -20°C;에서 1 mL의 분취액에 보관합니다.
leupeptin	Sigma	L2884	10mg/mL까지 물에 녹입니다. -20°C에 저장하십시오. C.
글리세롤	시그마	G5516	물에 50% 용액을 준비합니다.
분쇄 버퍼	홈 메이	드/	1 M 소듐 포스페이트 pH 7.2, 500 10 mL 결합; 1M DTT의 L, 100 μ L 10mg/mL 류펩틴 및 40mL의 50% 글리세롤. 100mL에 물을 넣으십시오.
스테인리스 스틸 비드 (5 mm)	Qiagen	69989
2.0 mL 튜브	Eppendorf	22363352	이 특정 튜브 모델은 균질화기와 함께 사용하는 것이 좋습니다.
비드 균질화기 (TissueLyser)	Qiagen	85210
12mm x 75mm 유리 시험관	Fisher
luciferin	Goldbio	LUCK-100	25mM 원액을 준비하고 -20°C에서 1mL 분취액을 보관합니다.
ATP	시그마	A7699	100 mM 재고 용액을 준비하고 250 μm를 저장하고; L 분취량은 -20°  C입니다.
트리스 베이스	시그마	T1503	1M 트리스 설페이트 pH 7.7용 시약.
황산	시그마	258105	1M 트리스 황산염 pH 7.7 용 시약.
1M 트리스 설페이트 pH 7.7	홈 메이	드/	12.1g 트리스 염기를 물 100mL에 용해시킵니다. 황산으로 pH를 7.7로 조정합니다.
염화마그네슘		Sigma M9397	2m까지 물에 용해시킵니다.
Luciferase 분석 버퍼 (LAB)	집에서 만든	/	1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 &mu 3 mL 결합; L 2M 염화마그네슘, 1M DTT 1mL 및 200μ; 0.5M EDTA의 L. 50 에 물을 추가하십시오. 밀리리터.
Luciferase Assay Mixture	집에서 만든	/	LAB 15mL, 800 &mu 결합; 25 mM 루시페린의 L, 200 μ L 100mM ATP 및 물 4mL. 이것은 충분한 분석 혼합물을 만듭니다(20  mL)를 사용하여 100개의 루시퍼라제 분석을 수행할 수 있습니다.
광도계 (Sirius)	Berthold	/
4-methylumbelliferyl-β -D-glucuronide (MUG)	Goldbio	MUG1	DMSO에서 100mM까지 용해
아지드화나트륨	시그마	S8032	물에 2% 원액을 준비하고 -20°C에서 1mL 분취액을 보관합니다.
96 웰 플레이트 (표준)	Fisher	12565501
GUS 분석 버퍼	집에서 만든	/	MUG 2.5 mL, 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 &mu 5 mL 결합; L 0.5 M EDTA, 1 mL 1 M DTT, 100 μ L의 10mg/ml 류펩틴, 20mL의 메탄올 및 1mL의 2% 아지드화나트륨. 100mL에 물을 넣으십시오.
TempPlate 밀봉 필름	USA Scientific	2921-1000
96웰 플레이트(검정색)	Costar	3916
탄산나트륨	Sigma	S7795	물에 200mM 용액을 준비합니다.
4-methylumbelliferone	시그마	M1381	100 &mu를 준비하십시오; 물에 M 용액. -20°C에서 1mL 부분 표본을 동결합니다.  C입니다.
마이크로플레이트 형광 리더	Bio-Tek	FLX-800

/ / 1652331 용 시약.