효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여

요약

이 프로토콜 transcriptionally 규제 잠자는 미녀 시스템에 의해 인간 게놈에 관심사의 유전자의 안정적인 통합을 달성 하는 방법을 설명 합니다. 결함이 lentiviral 벡터, 인간의 세포, 생체 외에서 변환 및 불리고 세포에 분자 분석 결과의 통합의 준비 보고 됩니다.

초록

잠자는 미녀 (SB) transposon는 유전자 이동 및 기능 유전체학에 대 한 입증 된 효능 비 바이러스 성 통합 시스템입니다. SB transposon 기계를 최적화 하려면 transcriptionally 규제 활동적인 transposase (SB100X) 및 T2 기반 transposon 고용 됩니다. 일반적으로, transposase와 transposon 제공한 정도 플라스 미드 transfection 그리고 SB100X 식 제정 발기인에 의해 구동 됩니다. 여기, 우리는 여러 가지 물리적, 화학적 transfection 방법 SB100X 식 제어 통합 하 고 안정적으로 "잘라내기 및 붙여넣기" SB 통해 관심 (GOI)의 유전자에는 인간의 세포에 SB 구성 요소를 제공 하는 효율적인 방법 설명 메커니즘입니다. 활동적인 transposase의 식은 단단히 Tet에 시스템, 1992 년부터 유전자 발현 제어를 널리 의해 제어 됩니다. 관심사의 유전자는 T2 transposon의 거꾸로 반복 (IR)에 의해 측면 이다. 두 SB 부품 결함이 lentiviral 벡터 뚜렷이 HEK293T 세포에서 생산 하는 통합에 포장 됩니다. 인간 세포, 세포 선 또는 인간 직물에서 1 차 셀에 체 외에 바이러스 성 벡터와 정도 불리고 있습니다. 문화 매체에 doxycycline (dox, 항생물질 아날로그)의 추가, 시 transposase 식의 미세 조정 측정 되 고 긴-지속적인 통합 치료 세포의 게놈의 유전자의 결과. 이 방법은 효율적이 고 셀 라인 (예를 들어, HeLa 세포) 및 1 차 셀 (예를 들어, 인간의 기본 keratinocytes)에 적용 되 고 따라서 유전 공학 및 유전자 치료 이동에 대 한 유용한 도구를 나타냅니다.

서론

T2 기반 transposon에 결합 된 활동적인 SB100X transposase 전 임상 유전자 치료 응용 프로그램^1,2,3, 게놈 수정^4,5에 이미 사용 되 고 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 프로그래밍^6,7. 일반적으로, SB 구성 요소 정도 플라스 미드 transfection에 의해 제공 됩니다 및 강한 제정 발기인 드라이브는 transposase의 표현. 그러나, transfection의 향상 된 새로운 방법에도 불구 하 고 배달 두 구성 요소 시스템의 많은 응용 프로그램에 대 한 도전 남아 있습니다. 따라서, 새로운 배달 프로토콜의 개발 증가 관심이 있다. 플라스 미드⁸ 및 mRNA⁹transfection 방법, 외 바이러스 배달 adenoviral^10,

프로토콜

1입니다. 플라스 미드 고용

참고: 플라스 미드 pCCL-PGKrtTA2^S-m 2는 친절 하 게 교수 Zappavigna (모 데 나 대학 및 레지오 에밀리 아, 모 데 나, 이탈리아)에 의해 제공. PCMVSB100X 플라스 미드 활동적인 transposase의 코딩 시퀀스를 들고와 pT2/BH transposon 플라스 미드 친절 하 게 제공한 교수 Z. Ivics (폴 Ehrlich 연구소, 랑겐, 독일)와 교수 Z. Izvak (Max Delbruck 센터 분자 의학, 베를린, 독일)입니다.

1. 대장균 (대장균)에 모든 복제에 대 한 선택과 제한 효소 절차의 복제 전략 또는 복제할 파편의 PCR 증폭을 따릅니다.
   주: 표 1 이 프로토콜에 플라스 미드의 모든 요약 합니다. 대 한 설명 및 각 플라스 미드에 대 한 참조가 제공 됩니다.

2. 바이러스 성 벡터 생산

참고: 모든 바이러스 성 벡터는 기관 규칙 및 규정에 따라 BSL2 biosafety 견제 수준에서 생물 학적 후드에서 생산 됩니다.

1. Dulbecco....

결과

여기, 제시 된 절차를 사용 하 여 레 귤 레이트 된 SB 부품을 운반 하는 3 개의 IDLV 벡터 (SB100X, rtTA2^S-m 2와 t 2-GFP transposon) 포장 하 고 효율적으로 제공 하 고 밀접 하 게 인간의 세포에서 SB 시스템을 조절 하는 데 사용 했다. 그림 1A 는 생체 외에서 변환 HeLa 세포 ( 표 2에 보고 된) 두 IDLV 벡터의 좋은 복용량 조합으로 SB transposase의 transcriptional 규칙을 평가 하기 위해 수행을 위한 계획을 보여 줍니다. SB100X의 transcriptional 규칙 qRT-PCR (그림 1B)에 의해 측정 되었고 오프 상태에 관하여 상대 양 (RQ) 값으로 플롯 (IDLVTKSB 혼자 RQ = 1). 불리고 HeLa 세.......

토론

여기, 우리는 안정적으로 GOI 잠자는 미녀여 대상 세포의 게놈으로 통합 하는 광범위 하 게 액세스할 수 있는 방법론을 설명-이항 중재. SB 시스템 게놈 편집에 대 한 nonviral 방법을 제공 하기 위해 개발 되었습니다, 하지만 통합 기계 (transposase 및 T2 transposon)의 효율적인 제공은 필수입니다. 따라서, SB 시스템을 사용 하 여 거의 transfectable 1 차 셀에,에 SB 구성 요소의 바이러스 배달 최근 몇 년 동안^10,,1215추구 되었다. 그러나,까지 고용 하는 바이러스 성 벡터의 아무도 지금 통제는 transposon의 rehopping의 위험에 발생할 수 있는 transposase의 구성 식의 문제를 해결.

Transcriptionally transp.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
둘베코' s 변형 된 독수리' L-글루타민이 없는 4.5g/L 포도당이 있는 배지	Lonza	BE12-614F	세포 배양 배지.
HyClone Fetal Bovine Serum (미국),	렌티바이러스 입자 생산을 위해 세포 배양HEK293T 사용된	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03
페니실린 10.000 UI/ml 스트렙토마이신 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	세포 배양 배지용 시약.
세포 배양 배지용	L-글루타민 200mM	Lonza	BE17-605E
염화나트륨(NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	HBS 2X 준비용 시약.
HEPES 버퍼, HBS	2X 준비용	Lonza	BE17-737E
인산수소이나트륨 이수화물 (Na2HPO4· 2H2O), 99.5%	HBS 2X 준비용	Merck	106580
염산 - ACS 시약 37%(HCl)	Sigma-Aldrich	320331	HBS 2X 준비용 시약.
주사용 멸균수:	HBS 2X 준비를 위한	Fresenius Kabi	-
0.45 & 마이크로; m PESS 필터	Whatman	10462100	바이러스 상층액에서 세포 파편을 제거하는 데 사용되는 필터.
Polyallomer Beckman 튜브	Beckman Coulter	326823	Tubes는 초원심분리를 통해 IDLV 벡터를 농축합니다.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	세포 세척 및 렌티바이러스 입자 재현탁액용 버퍼.
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A2153	(옵션) 렌티바이러스 입자 재현탁액용 완충액.
HIV-1 Gag p24 면역 캡처 키트	Perkin Elmer	NEK50001KT	IDLV 입자 적정을 위한 키트.
Polybrene	Sigma-Aldrich 107689		시약으로 형질 도입 효율을 향상시킵니다.
HBSS 중 트립신(10X) 2.5%(Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	제외) HeLa 세포 분리 시약(원액, 희석 예정).
에틸렌 디아민 테트라 아세트산 디 소듐 염 (EDTA)	100938B	트립신 작업 용액 준비를위한	AnalaR BDH
0.5% 트립신-EDTA, 페놀 레드 없음(10X)	GIBCO	15400-054	각질 세포를 분리하기 위한 시약(원액, 희석).
기증자 소 혈청, 뉴질랜드 원산지	GIBCO	16030-074	스위스 마우스 3T3-J2 세포 배양용 혈청(피더층).
햄' s F12 배지	GIBCO	21765	각질 세포용 배지.
HeLa 세포 배양 배지용	소 태아 혈청	Lonza	DE14-801F
태아 소 혈청, 자격, 호주 원산지	GIBCO	10099-141	인간 1차 각질 세포 배양 배지용 혈청.
소 췌장에서 추출한 인슐린	각질 세포 성장을 위한	Sigma-Aldrich	I5500
아데닌	VWR	1152-25	각질 세포 성장을위한 시약.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	각질 세포 성장을위한 시약.
Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	각질 세포 성장을 위한 시약.
각질 세포 성장을위한	Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516
각질 세포 성장을 위한	인간 EGF	Austral 생물학	GF-010-9
마우스 단클론 APC-conjugated Anti-Feeder 항체	Miltenyi Biotech	130-096-099	피더 층을 라벨링합니다.
RNeasy Plus 미니 키트	Qiagen	74134	RNA 정제 키트.
SuperScript III 역전사효소	Life Technologies	18080051	역전사효소 키트.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	정량 PCR용	Sigma-Aldrich	D7295
UltraPure DNase/RNase-Free 증류수	(임의)	-	반정량 PCR 및 qRT-PCR용 시약.
GoTaq G2 핫 스타트 중합효소	Promega	M740B	Taq 중합효소.
분자 생물학을 위한 아가로스,	가로스 젤 전기 이동법을 위한	시그마-알드리치	A9539
UltraPure TBE Buffer,	Invitrogen	15581028	시약, ddH2O에서 희석(1X)할 수 있습니다.
티듐 브로마이드	Sigma-Aldrich	E1510	아가로스 젤 전기영동용 시약.
HeLa 세포 및 각질세포에서 트랜스포사제 발현을 유도하는	Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891
TaqMan Universal PCR Master	Mix Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix.
15mL 고선명도 폴리프로필렌 원심분리기 튜브, 원뿔형 바닥, 돔 씰 나사 캡 포함,	세포 채취 및 벡터 희석 준비를 위한	팔콘 코닝	352096
20mm 그리드의 150mm TC 처리된 세포 배양 접시, 멸균	팔콘 코닝	353025	바이러스 생산을 위한 세포 배양 접시.
6웰 투명 평면 바닥 TC 처리된 멀티웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑 포함, 개별 포장,	HeLa 및 인간 1차 각질 세포 형질주입을 위한	팔콘 코닝	353046
Safe-Lock microcentrifuge tube, 용량 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes. 희석 준비용.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	희석 준비용 Tube.
플랫 캡이 있는 0.2ml PCR 튜브, RNase, DNase, DNA 및 PCR 억제제 없음	(임의)	-	반정량 PCR용 튜브.
MicroAmp Fast Optical 96-well 반응 플레이트(바코드 포함), 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	qRT-PCR용 96-well.
5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브, 캡 없음	BD Falcon	352052	튜브 유세포 분석 수집용.
일회용 혈청학 피펫, 폴리스티렌, 개별 포장, 멸균(다양한 부피)(	모든)	-	멸균 조직 배양 응용 분야를 위한 피펫.
필터 팁, 멸균 및 RNase, DNase, DNA 및 발열원 없음(다양한 부피)(	모든)	-	멸균 조직 colture 및 분자 생물학 응용 분야를 위한 필터 팁.
pH 측정기	(모든)	-	HBS 2X pH 측정용 장비.
PCR Thermal cycler	(any)	-	반정량 PCR용 장비.
아가로스 젤 전기영동 장비	(모든)	-	반정량 PCR의 아가로스 젤 전기영동을 위한 장비.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD-		유세포 분석기.
7900HT 고속 Real-Time PCR 시스템	qRT-PCR용	Biosystem	7900HT
세포 배양 응용 분야에서 효율적인 시료 처리를 위한 탁상용 원심분리기, 마이크로플레이트 버킷을 사용한 냉장.	(어떤)	-	세포 배양 처리 및 spinoculation을 위한 원심분리기.
렌티바이러스 입자 생산을 위한	Beckman Coulter-Ultracentrifuge		가 장착된 Optima L-90K 초원심분리기
세포 배양 및 분자 생물학 실험실용 장비(예: BSL2 재료, 세포 배양 인큐베이터, 냉장고 및 냉동고와 관련된 작업을 위해 설계된 Class II 층류 후드(+4 ° C, -20 ° C, -80 ° C), 마이크로피펫 및 피펫 에이드).
보호용 실험실 코트, 장갑, 안면 보호구는 특히 렌티바이러스 입자 생산 및 형질도입을 위한 연구소 규칙 및 규정에 따라 사용됩니다.