형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

요약

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

초록

그들은 진 핵 세포 내의 막 융합 촉매 성 N-ethylmaleimide 중요 한 융해 단백질 (NSF) 첨부 파일 단백질 수용 체 (올 무) 단백질 막 밀매, 키 있습니다. 약 36 다른 회원 SNARE 단백질 가족에 의하여 이루어져 있다. 특정 세포내 수송 노선 함으로써 특이성에 기여 하는 3 또는 4 올 무 단백질의 특정 세트와 막 매매의 충실도 의해 촉매 된다. 그러나, SNARE 단백질의 정확한 기능을 공부 하 고는 기술적으로 도전적, SNAREs는 매우 풍부 하 고 기능적으로 중복 대부분 SNAREs 여러 있고 중복 기능 때문에. 이 프로토콜에서 라이브 셀에 올 무 복잡 한 대형의 시각화에 대 한 새로운 방법을 설명 합니다. 이 방법은 C 말기 형광 단백질을 융합 하는 작은 단백질을 표현에 근거 하 고 포스터 공명 에너지에 의해 그들의 상호 작용을 측정 전송 현미경 검사 법 (FLIM) 이미징 (무서 워) 고용 형광 일생. 형광 일생 히스토그램 multicomponent 감퇴 모델 피팅,으로 무서 워 FLIM 다른 소포에서 (semi-) 올 무 복잡 한 대형의 분수의 양적 평가 허용 합니다. 이 프로토콜 성공적으로 무 복잡 한 대형 플라즈마 멤브레인과 포유류 세포 라인에 기본 면역 세포, endosomal 구획을 시각화에 적용 되 고 올 무에 다른 세포 기능을 공부 하기 쉽게 확장 될 수 있습니다. 동물, 식물, 하 고 곰 팡이 세포입니다.

서론

막 매매 진 핵 세포, 어디 막 소포 기증자 세포 기관이에서 떨어져 새싹을 이동 하 고 대상 세포 기관이^1,2퓨즈의 중앙 특징 이다. 미토 콘 드리 아를 제외한 모든 막 융해 단계는 SNARE 단백질 가족^1,2의 구성원에 의해 촉매. 약 36 포유류 세포에서 회원과 약 20 효 모²SNARE 단백질 가족에 의하여 이루어져 있다. SNARE 단백질 하나 또는 두 개의 ~ 52 잔류물-긴, 기본적으로 구조화 되지 않은 지역, 올 무-모티브 라는 포함 되어 있습니다. 종종 SNARE 단백질은 C 터미널 막 횡단 나선^1,2막 곁에. SNAREs 중앙 잔류물은 아르기닌 (R)과 글루타민 (Q) SNAREs^1,2로 복잡 한 올 무에 기여에 따라 분류 될 수 있습니다. 막 융해 함께 4 올 무-모티브를 기여 하 고 기증자 및 수락자 막^1,2균등 동족 SNAREs 3 또는 4의 상호 작용에 의해 구동 됩니다. 무 복잡 한 R-올 무 주제 및 3 Q-올 무 모티브 (Qa, Qb, Qc 불리) 이루어져 있다. 올 무-모티브, 소위 트랜스형성의 N termini에 시작 하는 복잡 한 대형-올 무-복잡 한, C-테르미니, 꽉 α 나선형 코일 코일 뭉치 라는 cis형성 쪽으로 진행 하는 고-올 무-복잡 한. 심지어는 하나의 올 무 복잡 한 복잡 한 형성 함께 기증자 및 수락자 막 끌 고 막 퓨전³대 에너지 장벽을 극복.

세포 내에서 특정 전송 경로의 고유 무 단지 할당은 종종 기술적으로 도전 이다. SNAREs 명확 하 게 밀매 하는 막의 특이성에 기여, 비록 그들은 무차별, 기능 중복, 그리고 그들의 기능 중복^1,2. 이 때문에, 섭 동 실험 유전자 녹아웃, RNA 간섭, 차단 항 체, 또는 소개 지배적인 네거티브, 역할 수용 성 무 조각 SNAREs와 같은 대상으로 자주 할 초래 하지 다른 분명 고기 올가미^2,4보상. 또한, 그것 어렵다 업스트림 밀매 이벤트에서 특정 막 융해 단계 차별화 SNAREs 여러 전송 노선²에 포함 될 수 있기 때문에. Immunolabeling 또는 형광 기자 단백질, 유전자 융합을 사용 하 여 현미경 검사 법 방법으로 올가미의 현지화 연구 문제에서 고통 하:으로 그들은 종종 여러 인신매매 단계, 및 (ii) 중재 (i) SNAREs 여러 세포를 찾습니다 그들의 지역화는 자동으로 그들은 기능적으로 복잡 한 대형을 올 무에 종사 하는 의미 하지 않는다. 마지막으로, 작은 단지 immunoprecipitation 실험 대상으로 미끼 및 다른 올가미는 올가미 중 하나를 사용 하 여를 사용 하 여 확인할 수 있습니다 하지만이 특정 세포 또는 밀매 경로를이 단지의 지정을 허용 하지 않습니다. 따라서, 현재, organellar 해상도 올 무 단지 시각화 하 아니 대체 기술이입니다. 면역 형광 검사 무 상호 작용을 증명할 수만 존재 또는 공동 지역화의 부재만을 표시할 수 있습니다, immunoprecipitation만 보여줄 수 있는 하는 동안 전체 상호 작용 무 세포 인구는 세포를 할당 하지 어디이 상호 작용을 발생합니다.

이러한 한계를 극복 하기 위해 무 단지 organellar 해상도 라이브 셀 내에서 양적 시각화에 대 한 허용 소설 방법 최근 개발한 Verboogen 외. ⁵ 이 메서드는 괴기 하 게 이동한 형광 단백질 C 말기의 막 횡단 나선 융합 SNAREs의 쌍의 표현에 기반. 막 융해 및 cis의 형성 완료 후-복잡 한 올 무, 막 횡단 나선 C 테르미니에서 이러한 fluorophores는 즉시 서로 juxtaposed. fluorophores Förster 거리 내에서 잘 있습니다 (일반적으로 < 5 nm), 결과 무서 워에서 녹색 이동 기증자 fluorophore에서 레드 이동 수락자 fluorophore^5,6. 기증자 fluorophore 및 기증자 및 수락자 방출 (비율 무서 워)의 비율에서 측정 될 수 있다 수락자 fluorophore의 증가 된 방출의 냉각에 결과 무서 워. 그러나, 비율 두 개의 다른 분자 사이 무서 워는 도전, 기증자 및 수락자 SNAREs 다른 세포와 세포^7,8중의 형광 크로스 토크 및 다른 수준 때문에. 무서 워도 여기와 광자의 방출 사이 시간 이다 형광 일생에서 측정할 수 있습니다. 만약 기증자 fluorophore 여 그것의 에너지를 방출 수 있습니다 무서 워, 형광 일생의 명백한 단축에이 경쟁 과정 결과. 이 FLIM^7,8에 의해 측정 될 수 있다. 평생 무서 워 형광 일생은 fluorophore의 본질적인 속성 이며 그것의 농도를 구분 하지 않습니다으로 두 개의 다른 분자 사이 상호 작용을 측정 하기 위한 비율 마세요 보다 훨씬 더 강력한입니다. 또한, 무서 워 근사 양적, 무서 워의 효율성은 기증자와 수락자 fluorophores (기본적으로 단계 기능) 사이의 거리의 여섯 번째 힘에 반비례 하기 때문에입니다. 그러므로, 더블-구성 요소 감퇴 모델 FLIM에 의해 기록 된 형광 일생 히스토그램 피팅,으로 무서 워 FLIM 무 복잡 한 형성⁵에 종사 하는 작은 분자의 분수의 (semi-) 양적 예측에 대 한 허용 합니다.

최근,이 무서 워 FLIM 방법은 Verboogen 그 외 여러분 에 의해 사용 되었다 하 무 복잡 한 형성 기본 수지상 세포에 면역 시스템⁵의 시각화. 그것은 그 병원 성 자극을 발생, 수지상 세포 경로 재정의 그들의 막 매매 특히 Qa-무 syntaxin 4와 R-무 소포 관련 막 단백질 (VAMP) 3의 증가 complexing 함께 표시 했다는 원형질 막입니다. 이 증가 올 무 복잡 한 형성 가능성이 인터 루 킨-6⁵등 염증 성 cytokines의 분 비에 대 일 분 비 능력을 충족 하기 위해 필요 합니다. 이 프로토콜 무 단지의 시각화 및 (semi-) 양적 측정에 대 한 무서 워 FLIM 데이터 수집에 필요한 실험 단계를 설명 합니다.그것은 전체 세포 형광 일생 히스토그램 무 상호 작용 양적 견적으로 명백한 형광 수명에 따른 모노-및 bi-지 수 감퇴 기능에 맞게 방법을 설명. 이 프로토콜에서 널리 HeLa 세포 라인 예를 들어, 사용 하지만 다른 진 핵 세포에서 올 무 단지 공부를 메서드를 쉽게 확장할 수 있습니다.

프로토콜

1입니다. 현미경 샘플의 준비

1. MCitrine (syntaxin 4-mCitrine; 기증자 fluorophore)를 융합 하는 Qa-무 syntaxin 4의 표현 및 R 무 VAMP3 mCherry (VAMP3-mCherry)를 융합
   참고: 다른 SNAREs 형광 단백질 그들의 C-터미널 막 횡단 나선 융합으로 사용할 수도 있습니다. MCitrine-mCherry, 대신 다른 기증자 수락자 쌍 spectrally 분리 fluorophores의 사용 (예를 들어, c f P-YFP) 될 수 있습니다.
   1. 헬러 세포를 성장 하 고 세 35 m m 직경 유리 하단 요리 현미경에 적합에 900000 HeLa 세포 분열.
      참고: 원칙적으로,이 프로토콜 수 다른 진 핵 세포 유형 및 현미경 요리에 맞게.
      1. 유지 하는 높은 포도 당 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM), 5%와 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 1% 항생제 antimycotic (포함 암포 B, 페니실린, 스) 37 ° C에서 보충의 10 mL와 T75 플라스 크에서 헬러 세포 배양 공동 셀 문화 인큐베이터에 ₂ .
      2. 일주일에 두 번 매체를 보충 하 고 일주일에 한 번 또는 세포에 도달 하면 85-90% 새로운 confluency T75 플라스 크 (500, 000 셀/플라스 크, 평균에) 셀 1시 10분 분할.
      3. 된 DMEM을 제거 하 고 세척 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 3 분의 8 mL로 두 번 헬러 monolayers.
      4. PBS를 제거 하 고 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)와 PBS의 2 개 mL를 추가 합니다.
      5. 셀 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO₂ 5 분 동안 품 어 하 고 그 후 가볍게 HeLa 세포는 플라스 크의 하단에서 별도로 플라스 크를 선동.
      6. 매체의 10 mL로 세포 밖으로 플러시, 15 mL 튜브에 정지를 전송 하 고 카운팅을 위한 10 µ L 약 수를 제거 합니다.
      7. 0.4 %trypan 푸른 얼룩과 1:1 약 수를 묽 게 하십시오 그리고 Bürker hemocytometer⁹셀.
         참고: 셀/mL의 수에 대 한 10000 여 두 개의 4 x 4 사각형과 여러 셀 수를 계산 합니다.
      8. 셀 계산, 15 mL 튜브에서 걸릴 900000 셀 3 유리 하단 요리 (1.1.1 단계 참조)를 통해 분한 후 transfection에 대 한 준비.
   2. Electroporation¹⁰ 셀 transfect ( 재료의 표참조) syntaxin 4 mCitrine 구문 (기증자만, 샘플 #1)와 함께 mCitrine 및 mCherry (VAMP3-mCherry (샘플 #2), 및 syntaxin 3 syntaxin 4 mCitrine 융합 샘플 #3).
      참고: 다른 셀 transfection 방법 사용된¹¹수도 있습니다. 샘플 # 3에서에서 탠덤 구조는 짧은 수명을 expectable (즉, 최대한 expectable 무서 워) 추정을 위한 긍정적인 컨트롤입니다.
2. 문화 셀 높은 포도 당 10 %FCS 1% 5% CO₂ 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 항생제 antimycotic와 함께 제공 된 DMEM에서에서 하룻밤.
3. DMEM 발음 하 고 세척 한 번 라이브 셀 이미징 매체와 셀 (140 m NaCl m, 2.5 m m KCl, 1.8 m CaCl₂m, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, pH = 7.4, mOsm = 300; 테이블의 자료를 참조) 2 분 이후 신선한 영상 셀 배치 중간입니다.

2. FLIM 데이터의 기록

1. 장소 시간-도메인 FLIM confocal 현미경 펄스 여기 소스와 기증자 fluorophore (즉, mCitrine) 및 시간 해결 데이터 수집에 대 한 아래 예제 # 2. 열띤 무대 37 ° C에서 세포를 유지.
   참고:이 프로토콜에서 사용 하는 confocal 현미경은 63 X 1.20 나 물 침수 목표를, 펄스 흰 빛 레이저를 장착 합니다 (80 MHz 펄스, < 100 ps 펄스 기간), 광자 승수 관 (PMT), 그리고는 Time-Correlated 단일 광자 계산 (TCSPC ) 시스템 (사용 하는 특정 설정에 대 한 재료의 표 참조). 다른 FLIM 현미경 사용 (예를 들어, Pmt, 백색 빛 펄스 레이저 대신 단일 파장 펄스 레이저 대신 단일 광자 눈사태 다이오드 (SPAD)) 될 수 있습니다.
2. MCitrine 및 mCherry 라는 올 무 단백질의 보이는 표현으로 셀을 선택 하 고 각 FLIM 측정 전에 두 fluorophores의 동시 여기 256 × 256 픽셀의 공초점 이미지를 기록 합니다. 약 2-fold는 회절 제한 현미경의 공간 해상도 보다 작은 픽셀 단계 (~ 200 nm) 사용 해야 합니다. 516 및 521-565 nm;에서 수집 방출에 자극 하는 mCitrine에 대 한 에 mCherry, 613-668 nm에서 610 nm 및 수집 방출에 자극.
   참고: 이미징 비행기 접시의 바닥에 너무 가까이 위치 하지 않습니다 (내 ~ 2 µ m 거리),이 형광 일생 히스토그램에 반영 피크 귀 착될 것 이다. 기증자 및 수락자 fluorophores의 동시 자극은 선호,이 샘플 운동의 잠재적인 문제를 해결할 수 있습니다. 하지만, 순차 여기 뿐만 아니라 사용할 수 있습니다.
3. 동일한 크기와 공간 해상도 confocal 이미지로 기록 되 고 FLIM 이미지로 FLIM 실행 를 클릭 하 여 이미지를 FLIM 단계 2.2에서 기록 하는 기록. 전체 셀 FLIM 분석, 또는 적어도 400 광자/픽셀 이미지 적어도 50000 광자를 기록 합니다. MCitrine 기증자 fluorophore 및 하지 mCherry 수락자 fluorophore만 자극 하 고 따라서 521-565 nm에서 516 및 수집 방출에 자극.
4. 여러 셀 및 다른 샘플 #1 (기증자에만) 및 샘플 #3 (mCitrine-mCherry 직렬 식 구조) 2.1-2.3 단계를 반복 합니다.
5. 악기 응답 함수 (IRF)을 기록 합니다. (예를 들어, 510-550 nm에서 기록 방출) 여기 파장에 방출 검출기의 단색을 조정 하 고에 다시 뿌리는 깨끗 한 유리 커버 슬립에서 FLIM 실행버튼을 클릭 하 여 함께 FLIM 이미지를 기록. 동일한 여기 파장을 사용 하 여 (516 nm) 레이저 출력 단계 2.1-2.4에서 셀 데이터 기록에 사용 되 고.
   참고: 여러 개의 봉우리는 IRF에서 볼 수 있습니다 또는 방출 monochromators 튜닝할 수 없는 경우는 IRF 또한 측정할 수 초고속 수명이 형광 염료의 솔루션으로 예를 들어 형광은 유기 염료를 포화에 수성의 냉각에 의해 요오드 화 칼륨의 솔루션입니다. 또한, 그것은 필요 하지 않습니다 엄격 하 게는 IRF 기록 하 때문에 형광 히스토그램의 감퇴 슬로프는 IRF deconvolution 없이 맞을 수 있다. 그러나,는 IRF 사용 광자 검출기의 타이밍 특성에 대 한 수정 수 있습니다 그리고 그로 인하여 평생 히스토그램의 맞는 더욱 정확해.

3입니다.FLIM 이미지 광자 녹음의 변환

1. 다운로드 및 설치 PT32ICS 변환 소프트웨어⁵.
   참고: 수명 데이터 또한 여러 현미경 공급 업체에서 소프트웨어를 포함 한 다른 소프트웨어에서 분석할 수 있습니다.
2. PT32ICS 소프트웨어를 구성 합니다.
   1. 크기 설정을 통해 256 × 256 픽셀 이미지 크기를 설정 | 크기.
   2. 설정을 통해 2 채널 설정 | 크기.
      참고: mCitrine 방출의 채널 독점적으로 현미경의 구성에 따라 달라 집니다. 잘못 된 채널 FLIM 이미지 없는 광자 (즉, 검은 이미지)와 결과적으로 빈 'LifetimeTable.txt' 발생 합니다-파일. 재판 및 오류에 의해 올바른 채널을 확인할 수 있습니다.
   3. ImageJ (xyz) 로 출력 을 설정 (또는 TRI2 (xyt)) FLIM 이미지 (3.4 단계) 생성.
3. 변환 누르고 하나 이상의 광자 추적 (.pt3 파일)를 로드 합니다. 여러 개의 광자 자취를 선택 하려면 Ctrl 키를 누른 상태를 유지 합니다.
   참고: 최신 64 비트.ptu 형식을 변환할 수 있습니다 또한.
4. PT32ICS 소프트웨어 pt3 파일 저장 되는 위치와 동일한 폴더에 다음 파일을 생성 하는 확인 하십시오:.pt3 광자 추적 이미지 cytometry 표준 형식 (.ics),.pt3 광자 추적 (.bmp) 당 하나의 비트맵 파일, 텍스트 파일 변환 당 당 하나의 광자 스택 (_Report.txt) 정보가 포함 된 광자 통계 (즉, 각.pt3 광자 추적, 시간 분해능의 검출기에에서 광자의 총 수), 변환 (_LifetimeTable.txt) 당 두 번째 텍스트 파일에 포함 된 총 형광 일생 히스토그램 탭-구분 된 형식 각.pt3 광자 추적에 대 한.
   참고:.ics 파일 FLIM 이미지, 예를 들어 TRI2 소프트웨어^12,13 또는 피지 ImageJ^14,15라이브러리 피팅 슬림 커브를 생성 하려면 피팅 단일 픽셀에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 파일 또한 사용할 수 있습니다 Phasor 분석¹⁶, 예를 들어 Spechron에서 피지에 대 한 시간 문이 벡터 플러그인. 비트맵 파일 없음 수명 정보를 포함합니다. 두 번째 텍스트 파일 4 단계에서 전체 셀 FLIM 분석에 사용 됩니다.

4. 전체 셀 FLIM 분석용 형광 일생 히스토그램의 피팅

참고:이 단계 (deconvoluted 피팅은 IRF의) 필요 소프트웨어를 deconvoluted 피팅 가능 합니다. IRF deconvolution 없이 형광 히스토그램의 피팅 하는 것은 뿐만 아니라 다른 소프트웨어와 함께 할 수 있습니다.

1. 피팅과 deconvolution (자료 테이블)의 데이터 분석 소프트웨어 프로그램을 열고 파일을 통해 각 광자 추적 (_LifetimeTable.txt)에 대 한 히스토그램을 포함 하는 텍스트 파일을 가져올 | 가져오기 | ASCII를 단일.
2. IRF ( 복사 및 붙여넣기를 사용 하는) 테이블의 두 번째 열에는 테이블을 다시 구성 합니다. A. 첫 번째 열에 시간 값 옆 B 두 번째 열에는 IRF 배치
3. Ctrl + A를 눌러 플롯을 선택 하 여 모든 열을 선택 하 여 기록 된 광자 추적의 품질을 결정 | 다중 패널 | 9 패널. 높은 반사 피크 (그림 4 층)와 광자 추적을 분석 하지 않습니다.
4. Ctrl 키 를 사용 하 여 B 열에서 IRF 뿐만 아니라 장착 품질 제어 평생 히스토그램을 포함 하는 모든 열 키 및 분석을 통해 비선형 피팅 로드 선택 | 피팅 | 비선형 곡선 적합 | 대화 상자를 열고.
5. 분석 소프트웨어를이 기능을 추가 하 여 deconvoluted 적합된 함수 ( 보충 파일 1에서 사용 가능)를 로드 ( 카테고리를 통해 | 사용자 정의 | 함수 | 추가). 맞는 함수 파일 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'를 선택 합니다. 이 함수 맞는 모노 지 수 감퇴 기능 형광 일생 히스토그램 IRF (즉, B는 테이블에서 열 두 번째)와 deconvoluted (공식 1):
   (식 1)
   와 t 는 시간, τ 는 명백한 형광 수명, A 는 진폭 및 y₀ 오프셋.
   참고: 다른 옵션은 양방향 지 수 맞추기 기능 (식 2) 평생 히스토그램에 맞게:
   (식 2)
   기증자 유일한 조건에 느린 구성 요소 (τ₁)의 일생을 고정 하 여 (단계 1.1.2: 샘플 #1)와 빠른 컴포넌트 (τ₂) 탠덤 구조 (샘플 #3)를,의이 추정의 분수의 수 SNARE 단백질 느린 (A₁) 및 (A₂; 참조 토론; 빠른 부품의 진폭에서 복잡 한 (F) 방정식 3):
   (식 3)
   Deconvoluted 이중 지 수 피팅 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf'에 대 한 맞춤된 기능 파일은 추가 파일 2에서 사용할 수 있습니다.
6. 선택 장착 곡선 | 데이터 형식 X 으로 입력된 데이터와 동일.
   참고:이 귀 착될 것 이다 적절 한 x-축 장착된 곡선의 스케일링.
7. 맞는눌러 곡선에 맞게.
   참고:이 맞는 변환 하 고 형광 수명, 오프셋, 진폭 포함 된 테이블 배열의 '보고서 시트'를 생성 합니다. 그것은 또한 장착 되어 커브와 맞는 오차 데이터 시트를 생성 합니다.

결과

올 무 무서 워 FLIM에 의해 상호 작용을 측정 하기 위한 시험의 근거는 그림 1에 표시 됩니다. C-테르미니 동족 SNARE 단백질의 막 횡단 나선의 괴기 하 게 이동한 형광 성 단백질 (예를 들어, mCitrine 및 mCherry)의 쌍에 융합 된다. Cis의 형성-서로 juxtaposed 즉시 되 고 이러한 형광 단백질에서 막 융합 결과 복잡 한 올 무, 무서 워. 그림 2 는 붙일 레이블 SNARE 단백질을 표현 하는 HeLa 세포의 대표적인 confocal 이미지. Syntaxin 4 mCitrine 구문 (기증자만; 아니 무서 워)와 syntaxin 3 두 mCitrine 융합 세포의 제어 조건 뿐만 아니라는 셀 표현 syntaxin 4 mCitrine (기증자 fluorophore) VAMP3-mCherry (수락자 fluorophore) 표시 그리고 mCherry (최대한 expectable 무서 워)에. 그림 3 은 동반 형광 수명 및 모노 지 수 감퇴 기능 (그림 3A-B)와 bi 지 수 감퇴 기능 (각 픽셀의 평생 히스토그램을 피팅 하 여 생성 된 FLIM 이미지 그림 3C - D). 그림 4A 우리의 설치 현미경 커버 글라스의 다시 산란에 의해 측정의 IRF 보여줍니다. 그림 4B-전자, 전체 셀 맞춤 동반 함께 FLIM 분석의 대표적인 형광 수명 히스토그램 모노 지 수 감퇴 기능에 대 한 곡선이 표시 됩니다. 그림 4 층 저명한 반사 피크 결과 현미경 커버 유리의 표면에 너무 가까이 몇 군데 실험의 형광 수명 히스토그램을 표시 됩니다. 그림 4G 대표 bi 지 수 감퇴 기능에 맞게 평생 히스토그램을 보여 줍니다.

그림 1: 무서 워 여 무 단지 시각화에 대 한 근거의 계획. (블루; 신경 올가미 (단백질 데이터베이스 3HD7¹⁷) 소포 관련 막 단백질 (VAMP) 2의 (A) 구조 모델 R), syntaxin 1 (빨강; Qa-SNARE), 및 SNAP25 (그린, 둘 다 Qb와 Qc 무 모티브를 포함). Syntaxin-1의 막 횡단 나선의 C-말단은 mCitrine (기증자 fluorophore; 단백질 데이터베이스 3DQ1¹⁸)에 활용 된. VAMP2의 막 횡단 나선의 C-말단 mCherry (수락자 fluorophore; 단백질 데이터베이스 2H5Q¹⁹)에 활용 됩니다. (B) 올 무 계획 막 퓨전 무서 워 결과 중재. Cis의 형성에 의해 막 융해 후-복잡 한 올 무는 올가미는 즉시 서로 인 무서 워 juxtaposed. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 형광 단백질을 융합 하는 SNARE 단백질의 표정. 첫 번째 열: 기증자 fluorophore, 516에 흥분된 nm. 두 번째 열: 수락자 fluorophore, 610에 흥분된 nm. (A) 기증자만 조건. Syntaxin 4-mCitrine (기증자 fluorophore; 병합에서 녹색) 표현 HeLa 세포의 대표적인 confocal 이미지. 수락자 채널 (두 번째 열) 형광 크로스 토크를 보여줍니다. (B) 부정적인 컨트롤 (무서 워). 두 syntaxin 4-mCitrine VAMP3-mCherry (수락자 fluorophore; 병합에서 마젠타색)와 표현 HeLa 세포의 대표적인 confocal 이미지. (C) 긍정적인 컨트롤 (최대한 expectable 마세요). Syntaxin 3-mCitrine-mCherry 연동 표현 HeLa 세포의 대표적인 confocal 이미지 생성 합니다. 참고는 mCitrine와 mCherry의 형광 신호 오버랩, mCherry에 비해 lysosomal 저하 mCitrine의 낮은 저항 때문에 가능성이 완전히 하지 않습니다 (토론 섹션 참조). BF: 밝은 필드. 스케일 바, 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 무 복잡 한 대형의 FLIM 이미지. (A) 그림 2에 표시 된 셀의 대표적인 형광 수명 이미지. 이미지는 이미지 cytometry 표준 (.ics) PT32ICS 소프트웨어를 사용 하 여 먼저 변환 TCSPC 시스템 (.pt3)에 의해 기록 된 광자 추적에 의해 생성 했다. 단일 픽셀 이미지 다음 15-100% 강도, 7 픽셀 원형 binning 및 monoexponential 맞춤 알고리즘 (Marquardt)에서 임계 처리와 TRI2 소프트웨어^12,13 를 사용 하 여 생성 된 형광 일생 장착. 평균 명백한 형광등 수명을 나타냅니다. (B) FLIM 이미지 형광 일생 이미지 (A에 표시 된 패널) ( 그림 2참조) mCitrine 기증자 fluorophore의 형광 강렬과 복잡 했다. 회선은 피지 ImageJ 맞춤 매크로 사용 하 여 수행 ( 재료의 표참조). (C) 형광 수명 및 syntaxin 4-mCitrine와 VAMP3-mCherry을 표현 하는 패널 A-B에서에서 하지만 지금은 bi 지 수 감퇴 곡선으로 피팅 HeLa 세포의 FLIM 이미지 (수명 제어 조건;에 고정 볼 단계 4.4 프로토콜)입니다. 픽셀 색상 표시 VAMP3와 syntaxin 4 단지에서의 예상된 분수 F (식 3). (D) 동일 패널 B, 하지만 양방향-지 수에 대 한 적합. 회선은 피지 ImageJ 맞춤 매크로 사용 하 여 수행 ( 재료의 표참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 전체 셀 FLIM 분석. (A) 설정의 악기 응답 함수 (IRF). IRF (물을 포함 하는 깨끗 한 유리 현미경 접시를 사용 하 여) 유리-물 인터페이스에 다시 뿌리를 사용 하 여 측정 했다.(EB-) 전체 그림 2 및 그림 3에 표시 된 셀에 대 한 평생 히스토그램 셀. 이미지에 모든 광자 풀링된 했다. 커브는 IRF와 deconvoluted 되었고 모노 지 수 감퇴 기능 (방정식 1)를 장착. 이 셀에 대 한 형광 수명 2.82의 가져온 ns (셀만 syntaxin 4-mCitrine; 기증자만 패널 B 표현), 2.09 ns (공동 syntaxin 4-VAMP3-mCherry와 mCitrine을 표현 하는 셀, 패널 C), 그리고 2.08 ns (셀 syntaxin 3-표현 mCitrine-mCherry 연동 구성; 최대한 expectable 무서 워 제어; 패널 D)입니다. 상 하지만 지금은 y 축 로그 스케일링과 같은 그래프를 보여줍니다. 패널 전자 표시 패널 B.의 감퇴 곡선의 오버레이 (F) 예 형광 일생 히스토그램의 현미경 커버 슬립의 표면에 너무 가까이 기록 했다. 이 결과 큰 반사 피크 (노란색 음영된 지역으로 묘사). (G) 패널 C, 지금 수명 함께 bi 지 수 감퇴 곡선으로 피팅 하지만 동일 (프로토콜의 단계 4.4 참조) 제어 조건에 고정. 빠른(₁)및 구성 요소(₂)느린 진폭 되었고 14.42 0.01, 각각, SNAREs 0.99 (식 3)의 복잡 한 F 의 예상 보다 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 1입니다. 함수 파일 FLIM_convoluted_IRF 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 2입니다. 함수 파일 FLIM_convoluted_IRF_biexp 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 프로토콜은 syntaxin 4와 라이브 HeLa 세포에서 VAMP3 사이 상호 작용 올 무의 시각화에 대 한 무서 워 FLIM의 사용을 보여줍니다. Syntaxin 4 주로 플라즈마 멤브레인에 찾는 그것 exocytosis^1,2,20,21을 중재 하는 Qa 무 단백질 이다. VAMP3는 주로 endosomal 구획을 재활용에 설명 하 고 원형질 막^1,2,20대 뿐만 아니라 다른 endosomes를 밀매 중재 연구-무. 그러나, 무서 워 FLIM 분석 결과 다른 SNARE 단백질 공부 쉽게 적용할 수 있습니다. 유일한 조건은 이러한 SNAREs C 터미널 막 횡단 나선까지^1,2로 대부분 SNARE 단백질에 대 한 경우입니다. 또한, 여기에 설명 된 프로토콜 무 단지 모든 진 핵 세포 유형에서는, 식물, 효 모 등의 시각화에 대 한 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리 무서 워의 기증자 fluorophore의 형광 수명 단축을 사용. 상호 보완적인 접근 수락자 fluorophore의 수명 시험 될 수 있는, 민감하게 방출 뚜렷한 상승 단계 때문에 명확한 증거를 제공 하는 공명 에너지 전달 발생 합니다.

현재, 무서 워 FLIM 기법 수 없습니다 lysosomal 구획에서 올 무 단지 시각화 하. Syntaxin 3-mCitrine-mCherry 직렬 식 구문에 대 한 mCherry 형광 종종 찾을 수 있습니다 더 축적 가능성에 해당 하는 lysosomal 구획, 반면 mCitrine 신호는 세포에 더 풍부한 juxtanuclear 지역에서 주변⁵. 같은 작은 단백질이 형광 단백질을 융합 했다 공동 표현된⁵mCitrine에 비해 mCherry의 비슷한 juxtanuclear 축적 관찰 되었다. 매우 낮은 pH를 특징으로하는 리소좀 (< 4) 분해 효소의 높은 활동. MCherry의 juxtanuclear 축적 가능성이 mCitrine fluorophore에 비해 lysosomal 저하 mCherry fluorophore의 높은 저항에 의해 발생 합니다. 그것은 하지 때문의 mCitrine, pH 냉각 juxtanuclear mCherry의 축적 또한 셀⁵의 고정 시 발생. 따라서, 무서 워 FLIM 기술 underestimates 양의 juxtanuclear (lysosomal) 지역에서 무서 워 하 고 이것은 리소좀의 루멘 내에서 가혹한 조건을 살아 나는 다른 형광 기자 단백질을 필요로.

무서 워-FLIM 원칙적에서를 (semi-) 양적 예측 복잡 한⁵SNAREs의 분수의를 얻을 수 있습니다. 우리는이 프로토콜에서 설명,이 필요 합니다 더블-지 수 감퇴 기능 (식 2), 형광 일생 히스토그램의 피팅을 빠른 구성 요소의 진폭은 복잡 한 (SNAREs의 분 율에 비례 방정식 3)입니다. 그러나, 같은 피팅 2 구성 요소 모델은 기술적으로 도전적 이다. 여러 무료 맞춤된 매개 변수 (2 개의 형광 수명 및 2 개의 진폭)과 매개 변수가 서로 영향을 미칠 것 이다 수명에 작은 오류 진폭 및 부에 영향을 미칠 것입니다 때문에 특히 광자의 매우 많은 수를 요구 한다. 반대. 이러한 피팅 문제를 해결 하려면 느린 구성의 형광 수명 기증자 유일한 조건 (즉, 아니 무서 워;만 mCitrine 현재)의 수명에 고쳐질 수 있다 고 그는 협동의 수명과 빠른 구성 요소 (구성 최대한 expectable 무서 워)입니다. 그러나,이 한다 또한 해석 될 주의 형광 수명 이러한 제어 상태와 동일 하지 않을 수 있습니다 (자동 냉각, 쌍 극 자 방향, 변화는 microenvironment에) 여러 이유로 이탈 수 있기 때문에. 내 여러 무 복합물 (< 10 nm) 수 결과 거리 의존 무서 워, 무서 워 "분자 통치자"로 사용 될 수 있는 동일한 원리에에서 그러나이 경우에, 가린다 무 단지의 정량화. 또한, 양적 예상은 항상 의미가 없습니다, 레이블이 SNAREs 생 (레이블된) SNAREs와 경쟁 하기 때문에. 결과적으로, mCherry 라는 무의 식을 수준 비율 무서 워⁵에 대 한 주요 결정 이다. 이러한 모든 주의 때문에 모노 지 수 감퇴 기능 (방정식 1)와 형광 일생 히스토그램을 맞게 하는 것이 좋습니다. 이 이점이 그것은 평생의 선험적 지식이 필요로 하지 않습니다 및 결과 명백한 평균 형광 일생 무 complexing⁵고체 측정을 제공 합니다.

그럼에도 불구 하 고, 양적 무서 워 FLIM 영상 2 분 피팅 모델 강력한 미래의 응용 프로그램을 가질 것 이라고 예상 된다. 올 무 인코딩 유전자는 염색체 내에서 CRISPR/CAS9 여 형광 기자 단백질 예 융합 수 있습니다. 이 생 단백질 수준과 레이블이 SNAREs의 배경이 생 무 단백질의 형광 라벨에 결과 하 고 그로 인하여 무서 워 FLIM에 의해 무 단지의 분수의 의미 있는 양적 평가 허용 합니다. 식 생 SNAREs의 수도 있습니다 매우 낮은 수 및 제공 하는 동안 상대적으로 낮은 형광 신호, 그것은 광자의 충분 한 수 얻을 수 있습니다, 특히 전체 셀 (요구 하는 광자의 단지 몇 가지 1, 000s) FLIM에 대 한 예정 이다. 또한, 이러한 무서 워 FLIM 측정 또한 높은 형광 신호에 더 나은 광자 통계 될 더 민감한 눈사태 포토 다이오드 감지기와 함께 수행할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine'	추가유전자	ID 92422	형광 단백질이 C-말단 막관통 나선에 융합된 다른 SNARE도 사용할 수 있습니다. mCitrine-mCherry 대신에, 스펙트럼으로 분리된 형광단의 다른 공여체-수용체 쌍도 사용될 수 있다(예: CFP-YFP).
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry'Addgene		ID 92423	C-말단 막관통 나선에 형광 단백질이 융합된 다른 SNARE도 사용할 수 있습니다. mCitrine-mCherry 대신에, 스펙트럼으로 분리된 형광단의 다른 공여체-수용체 쌍도 사용될 수 있다(예: CFP-YFP).
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry'Addgene		ID 92426	달성 가능한 FRET를 위한 양성 대조군.
헬라 셀
35mm 유리 바닥 접시	Willco Wells	HBST-3522	기타 라이브 셀 이미징 챔버
대체 Dulbecco의 Modified Eagle Medium	Gibco, Life Technologies	31966-021
태아 송아지 혈청	Greiner Bio-one	758093
항생제-항진균 용액	Gibco, Life Technologies	15240-062	Pen/Strep
대체 라이브 셀 이미징으로 작동합니다. medium	Thermo Fisher Scientific	A14291DJ	매체로부터의 형광이 방지되는 한 다른 모든 라이브 셀 이미징 솔루션이 작동합니다
63x 1.20 NA 수침 대물렌즈가 있는 Leica SP8 컨포칼 현미경	Leica	SP8	시간 영역 FLIM이 가능한 다른 컨포칼 현미경도 사용할 수 있습니다
펄스 백색광 레이저	Leica	SP8	다른 펄스 레이저 소스도 사용할
TCSPC(Time-Correlated Single Photon Counting) 시스템	PicoQuant	PicoHarp 300
Fiji ImageJ
Intensity Fiji ImageJ를 사용한 FLIM 이미지 컨볼루션을 위한 맞춤형 Fiji ImageJ 매크로		의 '소프트웨어' 섹션에서 사용 가능 www.membranetrafficking.com
rker 헤모사이토미터	VWR	630-1541
HeLa 세포	ATCC	ATCC  CCL-2
PBS	B 브라운 멜숭겐  AG	362 3140
EDTA 2 mM	Merck	108417	CAS: 60-00-4
15 mL 튜브	Greiner Bio-one	188271
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595	CAS: 72-57-1
NEON cell electroporation device	Thermo Fisher Scientific	MPK5000S