절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

요약

이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 마우스 긴 뼈에서 골 수 기질 세포와 조 혈 줄기 세포 분화 방법 제시. 두 개의 서로 다른 프로토콜에는 저조한 다른 세포 인구 확장 및 차별화 osteoblasts, adipocytes, osteoclasts에 적합 되 게 됩니다.

초록

중간 엽 줄기 세포의 표현으로 일상적으로 사용 되는 세포 인구를 구성 하는 골 수 기질 세포 (BMSCs) 생체 외에서. 그들은 캐비티 내에 골 수 조 혈 줄기 세포 (HSCs), 적혈구, 면역 창시자, 및 osteoclasts 증가 줄 수 있는 함께 상주 합니다. 따라서, 다양 한 세포 인구, 실험 설계 과제를 제시 하 고 데이터 해석을 혼동 수 있는 매우 다른 유형의 혼합에 골 결과에서 세포 인구의 기사. 여러 격리 및 문화 기술 BMSCs 및 HSCs invitro의 더 많거나 적은 균질 인구를 얻기 위하여 실험실에서 개발 되었습니다. 여기, 우리가 마우스 긴 뼈에서 BMSCs 및 HSCs의 격리에 대 한 두 가지 방법을 제시: 부착을 기반으로 BMSCs 및 HSCs의 혼합된 인구를 생성 한 방법 및 두 세포 인구를 분리 하는 한 방법. 두 방법 모두 제공 세포 적합 osteogenic 및 adipogenic 분화 실험 뿐만 아니라 기능적 분석 실험.

서론

기본 murine BMSCs¹초기 1980 년대 있는 그들의 발견부터 중간 엽 줄기 세포의 생체 외에서 모델으로 일반적으로 사용 됩니다. 긴 뼈의 골 수 구멍에서 플러시 플라스틱 부착 한 세포의 문화 osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes, 또는 많은 연구^2,3, adipocytes에 분화 될 수 있는 능력을 유지 하는 사실, ^{4 , 그러나 5}., 골 수는 독특한 조직 HSCs, 내 피, 그리고 면역 세포 포함 하 되이 국한 되지 않음, BMSCs, 하지만 많은 다른 세포 인구의 구성. 따라서, 고립과 문화 기술을 다른 동질성과 세포 인구를 얻을 수 있습니다. 이러한 기술을 사용 하 여 셀에서 잠재적인 차별화 테스트 전하실 수 있습니다. 예를 들어 다른 genotypes와 쥐에서 셀을 비교할 때 데이터의 해석을 제한 혼합된 세포 인구로 시작 합니다. 반대로, BMSCs 및 HSCs의 균질 성 인구 기술적으로 어려울 수 있습니다 고로 대표 되지 않을 수 있습니다 ex vivo 모델의.

우리의 실험실에서 우리는 주로 BMSCs osteoblasts, osteoclasts, adipocytes에 분화 될 그들의 잠재력 활용에 관심이. 여기, 우리가 osteoclasts에 차별화를 HSCs의 문화 뿐만 아니라 BMSCs와 HSCs 격리와 문화 osteoblastogenesis 또는 지질에서 생체 외에서평가 하는 데 사용의 기법 제시. 한 가지 방법은 BMSCs 및 HSCs 지질, osteoblastogenesis, 및 osteoclastogenesis (총 Bmc 라고 함)에 대 한 직접 적합 한 골 수 세포 (Bmc)의 혼합된 인구를 사용 합니다. 이 방법은 골 microenvironment의 세포 사이 발견이 성분의 가까이 비보 전 표현입니다. 또 다른 방법은 BMSCs (점착 BMSCs 라는) HSCs의 문화 "순수한" 인구 하려고 비 부착 한 세포에서 점착을 구분 합니다. 이후 방법은 세포 배양 실험의 BMSCs 또는 HSCs의 더 정확한 숫자와 함께 시작 하 고 문화에 남아 있는 다른 세포 인구의 복잡 한 간접 효과의 가능성을 줄일 수 있습니다. 두 방법 모두는 이전 출판 되었고 다른 연구 질문^6,7,,89를 해결 하는 데 사용.

프로토콜

모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 메인 의료 센터 연구소에 의해 승인 되었다.

1. 컬렉션 튜브 준비

1. 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린/스의 최소 필수 매체 α (MEM α)을 보완 하 여 BMSC 문화 미디어를 확인 합니다.
2. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 BMSC 문화 미디어의 100 µ L를 배치 합니다. 3 뼈 보통 단일 튜브 그래서 그에 따라 준비 하나에 적합할 것 이다.
3. 그들은 원심 분리기 튜브에 들어가도록 충분히 200 µ L 피 펫 팁의 끝을 잘라. 튜브 내부 팁 넣고 뚜껑 얼음에 튜브를 배치 하기 전에 닫을 수 있도록 합니다.
   참고: 또는, 0.75 mL microcentrifuge 튜브 끝 잘라 삽입할 수 있습니다 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에.

2입니다. 쥐에서 뼈의 수확

1. CO₂ 뒤에 자 궁 경부 전위를 사용 하 여 동물을 안락사 하 고 70% 에탄올으로 그들을 살포.
   주: 동물 같은 섹스 그리고 가급적 이면 같은 나이에서 사용 하는 확인 하십시오. 우리는 정기적으로 동물 세 7 ~ 8 주를 사용 합니다. 더 나은 대표 및 재현성 세포 인구를 실험 그룹 당 적어도 3 동물에서 세포를 풀링 하는 것이 좋습니다.
2. 해 보드에 그것의 뒤에 안락사 마우스를 놓습니다. 집게를 사용 하 여 복 부에 피부의 텐트를 만들. 살 균 해가 위를 사용 하 여 작은 절 개 (약 1cm)을 확인 합니다. 더 낮은 복 부와 다리를 노출 하려면 다시 사지와 컷에서 발 피부 껍질.
   1. 잘라 발목 아래 발 제거 공동. hipbone에서 대 퇴 골 머리를 분리 하는 엉덩이에 장 골의 크레스트 따라 자릅니다. 그것의 뒤에 아직도 마우스를 실행 하는 동안 2 개의 장 골 뼈 분리 hipbone 중간 절 개를 확인 합니다.
3. 보풀이 물티슈를 사용 하 여 조심 스럽게 화관, tibias, 장 골 뼈에서 근육을 제거.
   참고: 절단 힘 줄과 뼈에서 근육의 가능한 게로 보풀 잎사귀 (예, kimwipes)와 함께 쉽고 빠르게 청소. 그들은 쉽게 휴식 하는 경향이 하 고 그들의 취약성 특정 genotypes 증가 될 수 있습니다 뼈를 조작 하는 때 주의 사용 합니다.
4. 일단 모든 샘플 해 부 되는, 얼음에 PBS에 넣어 고 절연의 나머지 단계에 대 한 살 균 문화 후드로 이동.
   참고: aseptically 가능한 작업 문화에 오염에 대 한 가능성을 줄일 것입니다.
5. 원심 분리기 튜브 내에서 sectioned 팁에 그들을 배치 하기 전에 뼈의 인접 하 고 원심 끝에 작은 상처 (약 1 ~ 2 m m)를 확인 합니다.
   주: 골 수; centrifuged 수 있도록 충분 한 금액을 확인 그러나, 주의가 피하기 위해 골 수 공간에 근접에 따라 너무 많은 절단 세포 인구 변화 하는 경향이.
6. 15에 대 한 10000 x g에서 원심 분리기 실 온에서 s. 확인 한 모든 골 수는 플러시 1.5 mL 튜브의 하단에 삽입 (중 200 µ L 피펫으로 팁 또는 0.75 mL microcentrifuge 튜브) 안에 뼈는 일지도. 일단 모든 골 수 수집 컬렉션 튜브에서 뼈와 함께 삽입을 제거 합니다.
   참고: 모든 골 수 플러시 뼈 나타납니다 흰색. 그러나, 골 수는 특정 뼈에 남아, 경우 절단 끝을 다시 시도 하 고 원심.

3. 세포 현 탁 액

1. 25g 바늘, 풀을 사용 하 여 셀 쥐 똥를 위아래로 천천히 대단히 짧은 시간을 휴식과 단일 15 mL 원뿔 튜브로 모든 샘플을 결합. 샘플의 500 µ L 당 BMSC 문화 미디어의 10 mL를 추가 합니다.
2. 70 µ m 필터 50 mL 원뿔 튜브 위에 놓고 가능한 뼈 조각을 제거 세포 현 탁 액이이 필터를 통해 전달 합니다.

4. 도금의 골 수 세포 (전체 Bmc)의 혼합된 인구와 문화

참고: 셀은 5% CO₂배양 기에서 37 ° C에서으로 경작 된

1. 셀의 수를 계산 하 고 x 10⁶ 셀/cm² 문화 미디어에서 1.0에서 접시. 연결할 셀에 대 한 혼합 문화의 72 h를 허용 합니다.
   참고: 문화 미디어에 세포 현 탁 액 20 배 고 trypan 블루는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하기 전에에서 다시 diluting diluting 것이 좋습니다. 7 주 된 남성 C57Bl6/J 쥐에 대 한 우리 정기적으로⁶ 셀 약 50 x 10의 셀 번호를 생성 하지만 나이, 성별, 및 스트레인 수 영향을 셀 수 크게.
   참고: 셀의 혼합 인구 연결 해야 문화의 하단에 잘 합니다.
2. 72 h 후 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어와 함께 그것을 대체 합니다. 계속 변화 하는 미디어 모든 다른 하루 confluency 확인 합니다. 셀 confluency 80-100%에 도달, 그들은 차별화에 대 한 준비가 되었습니다.
   참고:이 문화 BMSCs와 HSCs, 혼합 때문에 그것은 사용할 수 있습니다 직접 osteoblastogenesis, 지질으로 osteoclastogenesis.

5. 도금의 BMSCs (부착 BMSCs)의 분할 인구와 문화

참고: 셀은 5% CO₂배양 기에서 37 ° C에서으로 경작 된

1. 10 cm 문화 요리 (55 c m² 의 문화 영역)으로 화관, tibias, 그리고 한 마우스의 장 골 뼈에서 수집 하는 모든 셀 접시
   참고: 2-3 C57BL/6J 마우스를 풀링할 때 우리가 일반적으로 접시 150 c m² 플라스 크에서이 '총' 골 인구.
2. 혼합 문화 48 h 후 (비-부착 HSCs 포함) 문화 미디어를 제거 합니다. Osteoclastogenesis 실험을 수행할 수 있다면, 비 부착 한 세포 제쳐두고 (섹션 7 참조), 하지 않을 경우, aspirate이이 인구를 설정 하 고 이러한 셀을 삭제.
3. 연결 된 셀을 방해 하지로 신중 하 게 PBS 가진 접시/플라스 크를 씻으십시오.
4. PBS를 제거 하 고 추가 0.25 %trypsin 및 세포 현 탁 액을 셀 미디어를 추가 하 여 1-3 분 끄다는 트립 신에 대 한 37 ° C에서 배양 하 여 세포를 리프트. 이 시점에서, BMSCs, 지금 해제, 될 수 있는 (로 이전에 완료 단계 4.1) 미래 실험을 위한 도금.
5. 도금에 필요한 셀의 수를 계산 합니다. 필요한 양의 세포 현 탁 액 상 온에서 5 분 동안 1000 x g에서 원심
   참고: 셀은 일반적으로 도금 끝점 실험에 따라. 예를 들어 단백질/RNA 격리 되어야 하는 경우 우리가 일반적으로 격판덮개 높은 밀도 (~1.0-2.0 x 10⁶ 셀/잘 6 잘 플레이트).
6. 미디어를 제거 하 고 도금에 필요한 문화 미디어의 볼륨에서 셀 펠 릿 resuspend. 실험에 따르면 문화 미디어에 셀 접시 하 고 몇 일 동안 연결할 수 있도록. BMSCs confluency에 도달, 수행 차별화를 진행 합니다.

6입니다. BMSCs의 차별화

1. Osteoblasts
   1. 게 osteoblast 차별화 미디어 1 M β-글리세롤의 800 µ L을 추가 하 여 인산 염 PBS에 PBS에 의약품 0.5 M의 200 µ L BMSC 문화 미디어의 99 mL (BMSC 문화 미디어의 구성에 대 한 단계 1.1 참조).
      1. BMSCs 문화 (총 Bmc 단계 4.3에서에서) 또는 BMSCs 단계 5.6에서에서 점착 confluent 일단 osteoblast 차별화 미디어 문화 미디어를 전환 하 여 그들을 osteoblasts로 차별화.
   2. 매일 차별화 미디어를 교체 합니다. 셀 강화 작용의 백색 혹 생산 시작. 우물의 바닥에 맨 눈으로 그들을 시각화합니다 이 과정은 3 주 몇 일 이내에 발생할 수 있습니다.
      1. Osteoblastogenesis 평가, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 또는 폰 Kossa 섹션 8에에서 설명 된 대로 우물에 얼룩을 수행 합니다.
         참고: 셀 단층의 파괴를 피하기 위해 약간의 각도에 접시를 기울이기에 의해 신중 하 게 미디어를 변경 합니다.
2. Adipocytes
   1. Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) 높은 포도 당, 소 태아 혈 청, 페니실린/스의 1 mL, 100 µ L 20 mM Rosiglitazone 2mm 인슐린의 100 µ L의 10ml의 90 mL을 함께 혼합 하 여 체형 기본 미디어를 확인 합니다. 필요한 경우 차별화 실험 기간 동안 주 4 ° C에이 미디어를 저장 합니다.
   2. 62.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)의 200 µ L을 추가 하 여 체형 유도 미디어 만들기와 체형 베이스 미디어의 25 ml 1 m m Dexamethasone의 25 µ L.
   3. BMSCs 문화 (총 Bmc 단계 4.3에서에서) 또는 BMSCs 단계 5.6에서에서 점착 confluent 일단 체형 유도 미디어를 미디어를 변경 합니다. 차별화의이 오늘을 0를 고려 하십시오.
   4. 48 h 후 미디어를 제거 하 고 체형 유도 미디어 문화를 새로 고칩니다.
   5. 4 일에 체형 기본 미디어로 전환.
      참고: 지질 방울 주 2 또는 4 일 일찍 나타나는 것을 시작할 수 있습니다.
   6. 7 일 셀 최대 지질 방울 축적 및 성숙한 체형과 유사한 표현 형을 표시를 준수 합니다. 그것은 세포 죽음/분리를 발생할 수 있습니다이 시점 과거 문화 하지 마십시오.

7입니다. Osteoclasts에 HSCs의 차별화

1. Osteoclast 차별화 미디어 25 ml BMSC 문화 미디어의 25 µ g/mL의 수용 체 활성의 NFKB Ligand (RANKL)와 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (mCSF)의 25 µ g/mL의 15 µ L의 50 µ L을 추가 하 여 확인 합니다.
2. 일단 총 Bmc (4.3 단계)에서 나는 비 부착 한 세포 (5.2 단계)에서 우물에 연결 된, 문화 미디어 Osteoclast 차별화 미디어를 전환할 수 있습니다. 차별화 미디어 매일 보충.
3. Osteoclast 문화에서 10 배 확대 현미경 매일 관찰 합니다. Osteoclasts 퓨즈와 차별화의 5-7 일의 주위에 일반적으로 multinucleated 세포 형성을 관찰 합니다.

8. 얼룩

1. Osteoblasts
   참고: 사용 하는 우리는 종종 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 얼룩 얼룩 하는 AP 키트 ( 재료의 표참조) 지침에 따라.
   1. AP 얼룩 키트 제조 업체의 지침에 따라 수행 합니다.
      1. 미디어를 발음 하 고 PBS로 세포를 씻어. 4% 셀 수정 Paraformaldehyde (PFA) 실 온에서 12 분에 대 한 PBS에.
      2. 한편, AP 500 µ L을 추가 하 여 키트를 얼룩이 지기에서 시 약을 사용 하 여 AP 솔루션을 만들어 500 µ L FRV 알카라인 솔루션을 부드럽게; 혼합 나트륨 아 질산염 하자 2 분 추가 22.5 mL dH₂O와 500 µ L Naphthol AS BI 알칼리 성. 부드럽게 혼합.
         주의: PFA 독성 이며 관리와 처리 해야 합니다.
      3. 일단 셀 고정, PBS로 씻어 고 각 잘 (우물 당 1 ~ 2 mL)을 AP 솔루션을 추가 합니다. 커버 알루미늄 호 일 및 빛에서 보호 하는 실 온에서 30 분 동안 하자 얼룩. 솔루션을 발음 하 고, 증류수로 씻어 접시 건조를 허용.
   2. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 긍정적인 세포를 관찰 하기 위해 카메라를 사용 하 여 스테인드 식민지의 이미지를 취득 합니다.
   3. 또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 대신 폰 Kossa 수행 합니다. 이 위해, 모든 나머지 PBS로 증류수로 깨끗이 세척 웰 스 실버 질산염. 와 침전 것입니다.
      1. 4% 셀 수정 PFA 실 온에서 12 분에 대 한 PBS에. 그런 다음 충분 한 5% 실버 질산염 솔루션 잘 커버 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 강한 빛에 노출에 추가 합니다.
   4. 실버 질산염 솔루션을 제거 하 고 증류수로 각 잘 린스. 셀에 5% 나트륨 thiosulfate 솔루션을 추가 하 고 3 분 서 보자.
   5. 나트륨 thiosulfate 발음 하 고 증류수로 씻어. 접시 건조 미네랄 예금에서 맨 눈으로 어두운 갈색/검은색 얼룩이 관찰 하자.
2. Adipocytes
   1. 기름 빨간 O (오로) 얼룩이 지기에 대 한 10%를 사용 하 여 셀 수정 중립 버퍼링 말린 실 온에서 1 h.
   2. 한편, 0.035 g 소 프로 파 놀의 10 mL에 용 해 하 여 오로 재고 솔루션을 확인 합니다. 이것은 6 잘 플레이트에 대 한 충분 한입니다. 혼합 하 고 하나의 필터 종이 (기 공 크기 11 µ m)를 사용 하 여 솔루션을 전달 합니다.
   3. 6 mL 증류수의과 오로 재고 솔루션의 9 mL를 diluting 하 여 오로 작업 솔루션을 확인 합니다. 사용할 준비까지 로커에 솔루션을 둡니다.
   4. 증류수에 60% 소 프로 파 놀 준비 (각을 커버 하기에 충분 하 게 잘).
   5. 셀 고정, 증류수와 통 및 세척 한 번 제거. 1 분 60% 소 프로 파 놀 솔루션에 물을 바꿉니다.
      참고: 추가 팁 접시; 하는 동안 액체도 천천히 adipocytes 매우 쉽게 분리 하십시오.
   6. 소 프로 파 놀을 제거 하 고 모든 세포를 충당 하기 위해 충분 한 오로 작업 솔루션을 추가 합니다. 실 온에서 저속 로커에 15 분 동안 품 어. 오로 제거 하 고 증류수로 두 번 세척.
      참고:이 시점에서 오로 얼룩진 지질 방울 수 구상 될 현미경.
   7. 오로 계량, 각 음을 100% 소 프로 파 놀의 1 mL을 추가 하 고 10 분 동안 천천히 흔들어는 오로 destain.
   8. 한편, 오로 작업 솔루션을 사용 하 여 다음 8 표준에 따라 표준 곡선을 만드는 희석 시리즈를 준비 (2100 µ g/mL)와 소 프로 파 놀은 희석제로: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75, 및 0 µ g/mL.
   9. 표준과 접시에 triplicates에서 destained 샘플의 200 µ L을 로드 하 고 490에서 흡 광도 읽고 nm.
      1. 표준 곡선에 따라 각 샘플에 대 한 오로의 농도 결정 합니다.
         참고: 셀 수 오로 농도 정상화 것이 좋습니다. 휴대폰 번호 크리스탈 바이올렛 얼룩 또는 DNA 양을 측정할 수 있습니다.
3. Osteoclasts
   참고: 경우 준비, 좋습니다 osteoclasts 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정) 트랩 얼룩을 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조)에 대 한 얼룩.
   1. 트랩 얼룩, PBS에 2.5%도 함께 실 온에서 30 분에 대 한 셀을 수정. 한편, 함께 빠른 가닛 기반 솔루션의 50 µ L, 나트륨 아 질산염, 증류수의 4.55 mL, Napthol AS Biphosphate 아세테이트 솔루션의 200 µ L, 100 µ L 주석산 솔루션의 50 µ L의 50 µ L를 혼합 하 여 트랩 솔루션을 확인 합니다.
   2. 정착 액에서 aspirate 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 트랩 솔루션을 추가 하기 전에 두 번 PBS 가진 세포를 씻어
   3. Osteoclasts 현미경 (10 배 확대) 아래를 계산 하기 전에 증류수로 세척. 트랩⁺ 셀 3 개 이상의 핵을 보라색 나타납니다.

결과

세포 배양의 개요
두 문화 기술 BMSCs 및 HSCs (총 Bmc, 그림 1A)로 구성 된 Bmc의 혼합된 인구 또는 BMSCs의 인구에 차별화의 평가 HSCs (부착 BMSCs, 그림 1B)에서 분리 수 있습니다. 48 시간 후에 골 수에서 세포 격리 및 도금 (그림 1C), 그들은 신속 하 게 플라스틱 문화 접시의 바닥에 연결 고는 단층을 형성 하는 경향이 있다. 셀 합류 (그림 1D)에 도달, 그들은 감 별 법 분석 실험을 위해 사용할 수 있습니다.

BMSCs Osteoblasts로 분화

토론

이 문서에서는, BMSCs의 문화의 두 가지 방법은 자신의 장점과 한계 표시 됩니다. 세포는 골 수에서 오는 격리 상대적으로 어려움 없이 과정 이다. 그러나, 중간 엽 줄기 세포 또는 osteoclastic 창시자의 대표적인 세포 인구를 얻기 때문에 골 수 구멍의 다양 한 세포 환경 전하실 수 있습니다.

골 수 내용의 전체를 경작 vivo에서 microenvironment의 가까운 표현을 제공 합니다. 그러나, 생체 외에서 실험의 처음에 BMSCs 또는 HSCs의 아주 다른 수 귀 착될 수 있다 쥐 (genotypes, 트리 트 먼 트, 나가, 등)의 다른 그룹에서 세포를 분리. 따라서, BMSCs 및 HSCs를 분리 하 고 다시 그들을 도금 차별화 실험의 시작에 휴대폰 번호를 통해 더 나은 제어를 허용 합니다. 그러나, 세포 배양의이 감소 수 있습니다 영향을 BMSCs 또는 HSCs의 결과 둘 다 분 엽 및 osteoclastic...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
200&뮤; L 피펫 팁	Rainin	17014401
1.5 mL 원심분리기 튜브	USA Scientific	1615-5500
15 mL 원추형 튜브	VWR	89039-668
50 mL 원뿔형 튜브	VWR	89039-660
인산염 완충 식염수 (PBS)	Sigma-Aldrich	21-040-CM
에탄올	피셔 사이언	04-355-451
해부 도구
70 μ m 필터	BD Falcon	352350
0.25% 트립신	Gibco	25200
Kimwipe	VWR	82003-820
파라포름알데히드(PFA)	전자 현미경 과학	15710
알칼리성 인산가수분해효소 키트	Sigma-Aldrich	86R
질산은	Sigma-Aldrich	S6506
나트륨 티오 설페이	시그마 -알드리치	S7026
오일 레드 O	시그마 -알드리치	O0625
이소프로판올	시그마 알드리치	190764
10 % 중성 완충 포르말린	시그마 -알드리치	F5554-4L
Whatman 필터 등급 1	시그마 알드리치	Z274852
주석산 내성 산 인산 가산 분해 효소 키트	시그마-알드리치	387A
글루타르알데히드	전자	16220
MEM&알파;	Gibco	12571
태아 소 혈청	VWR	97068-085
페니실린/스트렙토마이신	인비트로젠	15140-122
&베타;-글리세롤 포스페이	시그마-알드리치	G9891
아스코르브산	시그마-알드리치	A4544
DMEM 고포도당	시그마-알드리치	D5796
로시글리타존	케이맨 화학	717410
인슐린	시그마-알드리치	I6634
IBMX	시그마-알드리치	I5879
덱사메타손	시그마-알드리치	D4902
RANKL	페프로텍	310-01
mCSF	페프로텍	315-02
Axio Observer 인버터 현미경	Zeiss