방법 논문

AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

DOI:

10.3791/56766

⸱

2018년 6월 12일

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고 내용을 adeno 관련 바이러스 (AAV) titers 및 어셈블리 활성화의 역할을 연구의 응용의 정량에 대 한 간단한 점 오 점 분석 결과 단백질 (AAPs), 모든 AAV에 구조 비 바이러스 성 단백질의 새로운 클래스 serotypes capsids 동족과 분리 AAV serotypes에서 파생 된의 어셈블리를 홍보에.

초록

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Adeno 관련 바이러스 (AAV)은 유전자 치료를 위한 매력적인 벡터로 널리 허용 된다, 그러나 그것은 또한 바이러스 생물학을 이해 하기 위한 모델 바이러스 역할. 후자의 점에서 어셈블리 활성화 단백질 (AAP), 불리는 비 구조 AAV 단백질의 최근 발견은 capsid에 바이러스 성 capsid 부사장 단백질의 조립에 관련 된 프로세스에 새로운 빛을 발산 하 고. 많은 AAV serotypes 어셈블리에 대 한 AAP를 필요, 우리는 최근 보고는 AAV4, 5, 11는이 규칙에 예외. 또한, 우리는 AAPs 및 다른 serotypes의 조립된 capsids 다른 subcellular 구획을 지역화 설명 했다. 생물 학적 속성 및 다른 AAV 중 AAPs의 기능적인 역할에이 예기치 않은 serotypes 밑줄 다양 한 serotypes에서 파생 된 AAPs에 대 한 연구의 중요성 이 원고는 AAV 정량 및 capsid 어셈블리에서 AAP 종속성 및 serotype 특이성을 평가 하는 응용 프로그램에 대 한 간단한 점 오 점 분석 결과 자세히 설명 합니다. 이 점 오 점 분석 결과의 유틸리티를 보여, 우리가 밖으로 설정 capsid 어셈블리 및 AAP 종속성 뱀 AAV 이전 새롭거나 파충류 AAV로 AAV5, AAV9, AAP 독립 및 AAP 종속 이전에 표시의 특성 serotypes, 각각. 분석 결과 뱀 AAV capsid 어셈블리 뱀 AAP를 요구 한다 AAV5와 AAV9에서 AAPs에 의해 승진 될 수 없습니다 밝혔다. 분석 결과 또한, 많은 일반적인 serotype AAPs 상호 보완성으로 분리 capsid 어셈블리를 홍보 하는, 달리 뱀 AAP 홍보 하지 않습니다 AAV9 capsids의 다는 것을 보여주었다. 또한, 우리 nuclease의 선택은 크게 점 오 점 분석 결과의 판독에 영향을 하 고 따라서, 최적의 효소를 선택 하는 것은 AAV titers의 성공적인 평가 위해 매우 중요 표시.

서론

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Adeno 관련 바이러스 (AAV) 작은, 비 싸여, 단일 가닥 DNA 바이러스 게놈의 약 4.7 kilobases (kb)입니다. AAV 게놈 오픈-독서 프레임 (ORFs) 담당자 와 모자 유전자에 대 한 포함 되어 있습니다. 2010 년 이전 미확인된 nonstructural 단백질 AAV2 모자 유전자 내에서 + 1 프레임 이동 ORF 의해 월요일 외 에 의해 발견 되었고 발견 바이러스에 AAV2 capsid 부사장 단위체 단백질의 조립에 중요 한 역할을 capsid1. 이 비 발한 단백질은 capsid 어셈블리1을 추진에서 역할 그것 후 어셈블리 활성화 단백질 (AAP) 선정 되었습니다.

ORFs AAP에 대 한 모든 parvoviruses 속 Dependoparvovirus, 내만 내 parvovirus 가족1,2의 다른 속의 바이러스의 게놈의 유전자 확인 된 bioinformatically 되었습니다. 이 비 발한 단백질의 기능 연구는 AAP AAV2 프로토 타입에서 (AAP2), AAP2의 필수적인 역할에 완전히 그들의 축적과 형성에 대 한 핵소체 unassembled 부사장 단백질을 대상으로 설립에 초점을 처음 했다 조립 capsids1,,34. 압 식의 부재에 조립 하는 AAV2 capsids의 무 능력은 독립적으로 되어1,2,,34,5 우리를 포함 한 여러 그룹에 의해 확인 . AAV serotypes 1, 8, 및 9에 대 한 후속 연구 capsid 어셈블리, AAV1, 8의 VP3 단위체 단백질에에서 AAPs의 중요 한 역할을 뒷받침 9 AAP2의 공동 식의 부재에서 완벽 하 게 조립된 capsid를 형성 하지 못했습니다.

최근, 양적 점의 사용을 포함 하는 접근 방법을 통해 분석 실험을 오 점, 우리 조사 수 AAV1의 12 VP3 단위체에서 VP3 단위체의 홍보 12 capsids 압 식의 부재와 AAP1의 능력으로 조립 분리 serotypes입니다. 이 연구는 밝혔다 그 AAV4, 5, 및 11 VP3 단위체 AAP 없이 어셈블할 수 있습니다. 또한, 그것은 8 12 AAP serotypes 우리가 검사에서 발견 되었다 (즉, 모든 AAP4, 하지만 5, 11 및 12) AAP4, 5, 11 및 12에 표시 하는 동안 분리 AAV serotype capsids capsid 집합을 지원 하기 위해 광범위 한 능력을 표시는 실질적으로 이 관계6제한 된 능력입니다. 이 4 개의 serotypes phylogenetically 먼 다른 AAP serotypes2,3에서 있습니다. 또한, 연구는 다른 AAPs6의 subcellular 지 방화에서 중요 한이 발견 했다. 또한, 연구는 조립된 capsids과 핵소체, AAV2 capsid 어셈블리의 특징 AAP의 단단한 협회 AAV5를 포함 하 여 다른 serotypes에 반드시 확장할 수 없습니다 제안 했다 8, 및 9의 nucleolar 제외 표시 조립된 capsids6. 따라서, 어떤 특정 serotype AAP의 연구 로부터 얻은 정보는 모든 AAP 생물학에 광범위 하 게 적용 되지 않습니다. 압 하 고 생물학의 수수께끼 같은 자연 밑줄 정규 및 비정규 AAV serotypes에서 각 AAP의 기능과 역할을 조사 하는 필요.

Capsid 어셈블리에서 AAP의 생물학 역할 완전 포장 AAV 바이러스 성 입자 titers에서에서 생산 인간 미 발달 신장 (HEK) 293 세포, AAV 벡터 생산, 또는 AAP 단백질 없이 가장 일반적으로 사용 되 셀 라인을 확인 하 여 평가 될 수 있다 식입니다. AAV 정량의 표준 방법으로는 정량적 PCR (정량)-근거한 분석 실험7,8 및 양적 점 오 점 기반 분석 실험9. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과10,11 등 광학 밀도 측정12 AAV 바이러스 성 입자 정량에 대 한 다른 방법 많은 다른 AAV serotypes에서 파생 된 시료에 적합 하지 않습니다. 불순물 (원유 lysates 또는 문화 미디어), AAV 연구에 사용 되는 예제는으로 오염. 현재, 정량은 가장 널리 사용 되 AAV 정량; 그러나, 그것은 잠재적인 주의 정량 기반 분석 결과, 분석 결과로 체계적 오류 및 중요 한 titer 유사13,14귀 착될 수 있다 인정 하는 데 필요한. PCR 기반 분석 실험은 잠재적으로 혼동 요인, 증폭13을 억제 하는 PCR 서식 파일에서 covalently 닫힌된 터미널 헤어핀의 존재 등의 숫자에 의해 영향을 받습니다. 심지어 경험이 개인 잠재력을 소개 수 정량 기반으로 혼동 요인 시험13의 무의식적으로. 반면, 양적 점 오 점 분석은 게놈 증폭을 포함 하지 않는 매우 간단한 원리를 사용 하 여 정량 기반 분석 실험에 비해 오류의 위험을 최소화 하는 고전 분자 생물학 기술. 방법은 덜 기술적으로 도전; 따라서, 시험 결과 미숙한 개인에 의해 합리적으로 재현.

이 보고서에서 우리는 양적 점 오 점 분석 결과 우리가 일상적으로 AAV 벡터 정량에 대 한 사용 하 고 어떻게 공통 AAPs의 어셈블리 홍보 역할 연구 분석 결과 적용 하려면 serotypes (AAV5 및 AAV9) 및의 예를 제공의 방법론 세부 설명 뱀 AAV14에서 이전 새롭거나 AAP 자연, AAV 부사장 단백질 및 AAP 단백질 단일 유전자 (즉, 부사장-AAP cis-보완성), 동안 여기서 설명 하는 분석 결과에서에서 cis에서 표현 됩니다, 그리고 부사장 및 AAP 단백질 (즉, 부사장-압 하 고 두 개의 별도 플라스 미드에서 트랜스에서 공급 된다 트랜스-보완성)입니다. 이후 다른 serotypes에서 각 부사장 또는 AAP 단백질 각 독립적인 플라스 미드에서 표현 될 수 있다, 그것은 capsid 어셈블리 (즉, 부사장-AAP 크로스-보완성) 분리 부사장 AAP 조합을 테스트할 수 된다. 간단히, 다양 한 serotypes에서 AAV VP3 HEK 293 세포 존재 또는 부재의 동족 serotype AAP, 또는 분리 serotype AAP의 존재는 AAV 벡터 게놈을 포장 하는 플라스 미드 DNA transfection에 의해 표현 된다. 생산, 다음 문화 미디어와 세포 lysates capsid 셸 내 바이러스 성 게놈을 계량 점 오 점 분석 결과를 받게 됩니다. 점 오 점 분석 결과의 첫 번째 단계 샘플 샘플에 오염 플라스 미드 DNAs 및 비포장된 AAV 게놈을 제거 하는 nuclease 치료 하는 것입니다. 이렇게 하지 않으면 것 증가 배경 신호 특히 unpurified 샘플 분석. 이것 다음 바이러스 성 capsids 휴식과 샘플 솔루션으로 nuclease 내성 바이러스 성 게놈을 풀어 효소 처리에 의해 선행 된다. 다음, 바이러스 성 게놈 변성, 막에 얼룩이 고 정량에 대 한 바이러스 성 게놈 관련 DNA 프로브 때 교배. 여기 보고 예제 분석 결과 보여 줍니다 뱀 AAV VP3 capsid 어셈블리에 대 한 뱀 AAP를 요구 하 고 뱀 압 달리의 홍보 또한 수 AAP 종속 serotypes에서 파생 된 AAPs의 많은 AAV9 capsids 어셈블리를 홍보 하지 않습니다. 분리 serotype capsids입니다. 마지막으로, 우리 정량 하는 중요 한 경고를 보고 또는 점 오 점 기반 AAV 정량 분석 실험 nuclease의 크게 시험 결과 영향을.

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프로토콜

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참고: 솔루션 및이 프로토콜에 대 한 필요한 버퍼 조리법은 표 1에 제공 됩니다. 아래에 설명 된 프로토콜 capsid 어셈블리에서 AAP 단백질의 역할을 연구 부사장 AAP 상호 보완성 점 오 점 분석 결과입니다. 순화 AAV 벡터 적정에 대 한 보다 일반적인 양적 점 오 점 분석 결과 대 한 방법은 대표 결과 섹션에서 설명 합니다.

1. 건설 VP3, AAP, 플라스 미드를 표현 하는 AAV2 담당자

  1. PCMV-AAVx-VP3 (x = serotypes)의 건설
    1. 고 충실도 DNA 중 합 효소와 다음 뇌관 쌍을 사용 하 여 전체 VP3 ORF (1.6 kb) PCR 증폭: VP3 앞으로, CTAA-RE1-CACC-N25 (VP3 ORF의 처음 25 뉴클레오티드); VP3 역, TCTT-RE2-N25 (VP3 ORF의 마지막 25 뉴클레오티드).
      참고: RE1 및 RE2는 복제에 대 한 제한 효소 (REs)에 대 한 사이트. CTAA와 TCTT는 터미널 5' 그리고 3' tetranucleotides 금지 효소 소화를 촉진에 추가 이중 가닥 DNA의 끝 근처. CACC는 Kozak 합의 순서입니다.
    2. 인간의 세포 즉시 초기 (CMV-IE) 증강-발기인을 사용 하 여 높은 수준의 식 포유류 표정 벡터의 사이트 다시 해당 사이 RE-digested PCR 제품을 복제.
      참고: 분자 클로닝을 위해 최적의 온도에서 1 h 4 U / µ g의 DNA의 농도에 금지와 백본 플라스 미드 DNA의 5 µ g 다이제스트. PCR 파편, 단위 길이 당 제한 효소 인식 사이트의 수의 증가로 인해 효소 사용 (예를 들어, 1.6 kb VP3 ORF PCR 제품의 10 U / µ g)와 긴 부 화 시간 (예를 들어, 4 h)의 단위를 증가. 분자 생물학 효소와 세균 변화를 포함 하 여 복제 프로시저에 유용한 정보 다른 곳에서15,,1617찾을 수 있습니다.
  2. PCMV-플래그-AAPx (x = serotypes)의 건설
    1. 고 충실도 DNA 중 합 효소와 다음 뇌관 쌍을 사용 하 여 첫 번째 아미노산을 제외 하 고 전체 AAP ORF (0.6 kb) PCR 증폭: 압 하 고 앞으로, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (에 4 뉴클레오티드에서 25 뉴클레오티드는 AAP ORF); AAP 역, TCTT-RE2-N25 (AAP ORF의 마지막 25 뉴클레오티드).
      참고: GACTACAAGGACGACGATGACAAA 코드 플래그 태그 아무 해로운 효과4,5 를가지고 표시 되었습니다 하지만 불필요 한 경우 생략할 수 있습니다.
    2. CMV IE 증강 발기인15,,1617포유류 표정 벡터의 해당 사이트 간에 RE-digested PCR 제품을 복제.
  3. PHLP 담당자의 건설
    1. 20 단위 각 Xho pAAV RC2 플라스 미드 (7.3 kb)의 다이제스트 5 µ g 어 Xcm, 상업 DNA 정제 키트를 사용 하 여 DNA를 정화 또는 페 놀-클로 프롬 적 출.
      참고: 1.8 kb Xho 나-Xcm Rep 단백질 표정 유지 하면서 capsid 부사장 단백질 식의 7.3 kb pAAV RC2 플라스 미드 결과 손실에서에서 파편의 제거.
    2. 무딘 DNA 6 단위 T4 DNA 중 합 효소의 끝나는, agarose 젤 5.5 kb DNA 파편을 정화 하 고 자기 위하여 순화 된 조각 50 ~ 100을 사용 하 여 제조업체의 추천15에 따라 T4 DNA 리가의 400 단위 및 DNA의 ng.
    3. 1.1.2 단계에서 참조 표준 세균성 변환 절차 참고.
  4. 금지 효소 소화와 시퀀싱15,18여 플라스 미드 구성 확인 하십시오.
  5. 플라스 미드 minipreps 또는 maxipreps 충분 한 양의 다운스트림 AAV 생산 실험에 대 한 플라스 미드 DNA 상업적으로 사용할 수 있는 키트를 사용 하 여 수행 합니다.

2. 생산 HEK 293에서에서 AAV의 플라스 미드 DNA Transfection (상호 보완성 분석 결과)에 의해 세포

  1. HEK 293 세포에서 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 문화-페니실린 & 스 믹스, 높은 포도 당 (4.5 g/L) 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1%와 5% 이산화탄소 (CO2)와 함께 37 ° C 배양 기에서 1 m m L-글루타민.
    참고: AAV titers HEK 293 세포의 원본에 따라 크게 다릅니다.
    주의: AAV에 처리할 수 있지만 biosafety 수준 1 (BSL1) 포함, BSL2 포함 HEK 293 세포 작업에 대 한 것이 좋습니다.
  2. 주-(24 h transfection 이전) 1, 6-잘 plate(s)에서 2.1 단계에 설명 된 완전 한 매체의 105 HEK 293 세포/음 2 ml에서 x 6-7 접시. 이 일반적으로 다음 날 ~ 90 %confluency 달성 한다.
  3. 하루 0: Transfection
    1. DNA transfection에 대 한 준비
      1. 셀 confluency ~ 90%에 도달 했습니다 확인 하십시오.
      2. DMEM 않고 10%와 1% 페니실린 & 스 믹스 1 mM L-글루타민 보충 워밍업 FBS (즉, 혈 청 무료 중간) 37 ° C 물 목욕에서.
      3. 실내 온도 도달 polyethylenimine (페이) 솔루션을 수 있습니다.
    2. 플라스 미드 DNA 혼합물의 준비
      1. 표 2에 표시 된 대로 CaCl2 또는 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 MgCl2 없이 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 96 µ L에서 플라스 미드를 믹스. DNA의 총 금액은 2 µ g/잘.
        참고: 만약 그들이 명목상 플라스 미드 DNA 솔루션에 대 한 볼륨 무시 될 수 있습니다. 볼륨 조절 하는 것이 좋습니다 경우 플라스 미드 DNA 솔루션의 전체 볼륨은 ≥10 µ L.
    3. 페이 transfection
      1. (준비 위) PBS-플라스 미드 DNA에 페이 솔루션 (1 mg/mL)의 4 µ L를 추가 합니다. 마지막 볼륨은 약 100 µ L (문화 매체의 5% 볼륨). 소용돌이 관 짧게 고 실 온에서 15 분 동안 DNA: 페이 혼합물을 품 어.
      2. 완료 하는 데 15 분 부 화를 기다리는 동안 2.3.1.2 단계에서 설명 하는 prewarmed 혈 청 무료 매체와 문화 매체를 교체 합니다.
      3. 일단 DNA의 15 분 부 화: 페이 혼합 완료 짧게 회전 튜브는 튜브의 바닥에 액체를 수집 하는 microcentrifuge 이며, HEK 293 문화 판의 각 잘 문화 매체에 dropwise DNA: 페이 혼합물을 추가. 부드럽게 접시를 선동 하 고 5% CO2와 37 ° C 배양 기에 그들을 반환 합니다.
      4. 하루 5 (중간 변화가 필요)에서 수확까지이 transfection 매체에 세포를 유지 합니다.
  4. 주 1 와 주 2, 세포 transfection 효율을 평가 하는 거꾸로 형광 현미경 pCMV GFP 플라스 미드와 페 관찰 합니다.
    참고: 형광 현미경 검사 법, 10 배는 여기에 대 한 / 0.25 숫자 조리개 목표 10 × 접 안 렌즈와 함께에서 사용 되었다, 및 450-490 nm 여기 대역 통과 필터와 515-565 nm 대역 방출 필터 채택 되었다. 위의 조건에 일반적으로 70 %transfection 효율 보다 더 얻을 수 있습니다. 셀 형태 론 적 변화 (예: 셀 슬림 되고있다) 혈 청 자유로운 상태로 인해 전시 수 있습니다.
  5. 일 3-5, 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 transfected 세포 문화를 계속 합니다.
  6. 5 일째, 세포와 바이러스를 포함 하는 매체 15 mL 원뿔 튜브를 폴 리 프로필 렌으로 아래로 pipetting으로 또는 수집 셀 스 크레이 퍼와 된다고 하 여.
  7. 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.

3. 점 오 점 분석 결과 AAV 정량에 대 한

  1. 바이러스 성 입자의 복구
    1. 신속 하 게 녹여 37 ° C 물 욕조에 냉동된 관. 소용돌이 1 분 셀에서 AAV의 복구를 최대화 하기 위해 적극적으로 튜브.
    2. 10 분 동안 4 ° C에서 3700 x g에서 centrifuging 여 셀 파편을 펠 렛. 각 관에서 상쾌한의 200 µ L을 스크류 캡 점 오 점 분석 결과 대 한 레이블된 microcentrifuge 튜브로 전송.
      참고: 약 수 microcentrifuge에 나머지 상쾌한 튜브 하 고 나중에 사용-80 ° C에서 냉동 보관. 여기, 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브 연결 나사 모자와 O-ring을 사용 했다. 꽉 봉인은 AAV 및 페 놀-클로 프롬의 유출을 방지 하기 위해 필요 합니다.
  2. Serratia marcescens endonuclease 치료
    1. 혼합 A 및 혼합물 B 시 약 (표 3)를 준비 합니다. 10 µ L의 혼합 및 각 관으로 혼합 b 10 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 관 5 s, 짧게 튜브는 튜브의 바닥에 액체를 수집 하 고 적어도 1 시간에 대 한 37 ° C에서 튜브를 품 어를 스핀.
      참고: 혼합 A NaOH를 포함 하 고 pH S. marcescens endonuclease 치료에 대 한 최적화. 혼합 B 마그네슘 보충. 상업적으로 이용 가능한 효소 주식에 S. marcescens endonuclease의 농도가 달라질 수 있습니다. S. marcescens endonuclease의 볼륨 믹스 A와 혼합 B 단계 3.2.1에서에서 튜브로 추가한 후 200 U/mL을 적절 하 게 조정 될 필요가 있다.
      참고: 더 이상 보육 시간 최대 4 h, 줄일 수 있습니다 배경 신호.
    2. 외피의 끝에, 짧게 위쪽 및 튜브의 측면에서 응축 및 솔루션을 수집 하는 벤치탑 원심 분리기와 튜브를 회전 합니다.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 샘플-20 ° C 또는-80 ° C에 얼어 저장 될 수 있다
  3. 가수분해 K 치료
    1. 혼합 C 시 (표 3)를 준비 합니다. 각 관으로 혼합 c 180 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 관 5 s, 짧게 튜브를 회전 시키고 1 h 55 ° C에서 튜브를 품 어.
      참고: 혼합 C 시에 EDTA chelates 자유로운 마그네슘 이온 및 S. marcescens endonuclease 생긴다.
    2. 외피의 끝에, 실내 온도 도달 하는 샘플을 허용 하 고 짧게 위쪽 및 튜브의 측면에서 응축 및 솔루션을 수집 하는 벤치탑 원심 분리기와 튜브를 회전.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 샘플-20 ° C 또는-80 ° C에 얼어 저장 될 수 있다 다시 시작 하려면 프로토콜, 해산 SDS 결정 완전히 버퍼에 포함 된 5 ~ 10 분 55 ° C에서 튜브를 품 어.
  4. 페 놀-클로 프롬 추출 및 에탄올 강 수
    1. 샘플 및 그들 1 분 ≥16, 실 온에서 ≥5 분 x 100g에 microcentrifuge에서 샘플을 회전 하는 소용돌이를 페 놀-클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다.
      주의: 페 놀-클로 프롬은 적절 한 개인 보호 장비 (PPE;를 가진 화학 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 즉,니트 릴 장갑, 고글 또는 얼굴 방패을 긴 소매와 실험실 외 투).
    2. 새로운 표준 microcentrifuge 튜브 (수성 액체 볼륨의 80%)을 수성 층 (P200 피 펫을 두 번 160 µ L)의 320 µ L를 전송 합니다.
      참고: 샘플 사이 수성 해결책의 동일한 볼륨을 vitally 중요 한, 그렇지 않으면 분석 결과 양적 정확도 잃는다.
    3. 혼합 D 시 (표 3)를 준비 합니다. 각 관으로 믹스 d 833 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 관 5 s, 그리고 ≥20 분-80 ° C에서 튜브를 품 어.
      참고: 혼합 D 에탄올, 아세트산 나트륨, 및 DNA의 편리한 에탄올 강수량에 대 한 글 리 코겐의 혼합물 이다. 샘플은이 단계에서-80 ° C에 저장 될 수 있다 고 프로토콜은 나중에 다시 시작할 수 있습니다.
    4. 원심 분리기 샘플 ≥16에서 microcentrifuge, ≥15 분 4 ° C에서 100 x g을 부 어 상쾌한 고 깨끗 한 종이 타월에 한 번 오 점. 각 관, 70% 에탄올의 약 500 µ L를 넣고 소용돌이 5 s, 및 원심 분리기 튜브 벤치탑 microcentrifuge ≥16, ≥5 분 4 ° C에서 100 x g에 튜브.
    5. 상쾌한 오프와 깨끗 한 종이 타월에 한 번 오 점. 65 ° C;에 건조 펠 릿 펠 릿 완전히 건조 될 수 있습니다.
      참고: 튜브 blotting 후 남아 있는 초과 에탄올을 제거 하는 피 펫을 사용 하지 마십시오. 펠 릿 수 또한 건조 실 온에서 하룻밤. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 그리고 말린된 DNA 펠 릿 튜브 뚜껑 닫힌 몇 일 동안 실내 온도에 저장할 수 있습니다.
  5. 물의 Resuspension 테 버퍼에서 바이러스 성 DNA의
    1. 실 온에서 1 시간 30 분 각 튜브를 떨고 하 여 120 µ L 각 테 버퍼에서 DNA 펠 릿을 디졸브.
  6. 점 오 점
    1. 플라스 미드 DNA 표준의 준비
      1. AAV 벡터 게놈 플라스 미드 DNA 물 또는 Tris HCl 버퍼 (10 m m, pH 8.0) 10 ng / µ L를 희석. 이 희석의 플라스 미드 DNA, 50 µ L의 반응 볼륨에서 선형화를 1 시간에 대 한 적절 한 제한 효소로 다이제스트 25 µ L를 가져가 라.
        참고: 우리는 소화의 중복된 집합을 만들 (단계 3.6.4.1 참조). 적절 한 효소 점 오 점 프로브 바인딩 영역 밖으로 플라스 미드 DNA를 인하 하는 것 이어야 한다. 편의 위해 희석된 플라스 미드 DNA aliquoted (25 µ L/튜브) 될 수 있으며 저장 된 미래 사용을 위한-20 ° C에서 냉동. 튜브 단계 3.5.1에서에서 떨고는 동안 플라스 미드 DNA를 소화. -플라스 미드 DNA 표준 소화 하지 않습니다.
      2. 소화 플라스 미드 DNA 표준 포함 된 튜브에 물 또는 테의 450 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브 물 또는 희석된 플라스 표준 (25 세 / µ L) 만들려고 테 1,330 µ L에이 혼합물의 70 µ L를 전송.
      3. 표 4 두 배 직렬 희석 (600 µ L/튜브)의 집합을 만드는 따르십시오. 5 vortexing에 의해 철저 하 게는 희석 혼합 s.
    2. 표준 및 바이러스 성 DNA 샘플의 변성 시키기
      1. 각 표준 희석에 알칼리 성 해결책 x 2의 600 µ L를 추가 합니다. 10 분 동안 실 온에서 5 ~ 10 미 품에 대 한 vortexing에 의해 잘 혼합.
      2. 각 바이러스 성 DNA 샘플을 알카라인 솔루션 x 2의 120 µ L를 추가 합니다. 10 분 동안 실 온에서 5 ~ 10 미 품에 대 한 vortexing에 의해 잘 혼합.
    3. 점 오 점 장치를 설정
      1. 샘플 및 기준의 수에 대 한 적절 한 크기 (예를 들어, 제타-프로브) blotting 막 잘라가 위를 사용 하 여. 점 오 점 장치에 그것을 배치 하기 전에 10 분 동안 물으로 막 담근 다. 멤브레인 장치에 사용 되지 않는 우물을 커버.
        참고: 깨끗 한 핀셋으로 멤브레인을 처리 합니다. 커버 하기 위해 빈 우물, 멤브레인와 함께 제공 되는 밝은 파란색 보호 시트를 사용할 수 있습니다. 샘플 및 표준 바인딩 전에 건조 막을 허용 하지 않습니다. 에 대 한 자세한 내용은 어셈블리 및 기구의 사용, 사용자 수동19를 참조 하십시오.
      2. 샘플 로드 될 우물에 물을 추가 합니다. 진공 및 풀 물 우물 오류를 확인 하 고 고정 될 때 다시 테스트를 통해 적용 됩니다. 다시 꽉 씰링을 보장 하기 위해 진공을 적용 하는 동안 나사를 조입니다.
        참고: 불완전 한 씰링 우물 사이 샘플 누설이 될 수 있습니다.
      3. 물을 가져온 완전히, 일단 완전히 진공을 해제 (즉, 진공 매니폴드 열려 있어야 공기 압력).
    4. 표준 및 샘플 점 오 점 장치를 로드
      1. 각 잘 각 희석된 플라스 미드 DNA 표준의 400 µ L 적용 하 고 표준 희석의 4 개의 차선을 실행 합니다. 표준 다이제스트의 두 개의 별도 aliquots를 사용 하 고 각 중복에서 로드. 각 바이러스 성 DNA 샘플의 200 µ L/잘 적용 됩니다.
        참고: 변성된 샘플의 나머지 ~ 40 µ L를 사용 하 여 희석된 샘플 수 있습니다 (예를 들어, 사용 하 여 샘플의 20 µ L 플러스 알카라인 솔루션 x 1의 180 µ L의 희석된 샘플 10 개) 준비 되며 필요한 경우 얼룩이.
      2. DNA 솔루션을 잘 이겨낼 부드러운 진공을 적용 합니다.
        참고: 부분적으로 진공 압력 점을에 적용 되도록 3 방향 밸브를 열어 조정 진공 압력 요구 되 리 분위기 뿐 아니라 장치 (즉, 자 지 팔에 위치는 약 45 ° 각도 어디 그것 크게 흡입 소음을) 합니다.
      3. 일단 모든 우물을 비우지는, 3 방향 밸브를 조정 하 여 진공을 해제. 표준 및 샘플을 포함 하는 각 음에 알칼리 성 해결책 x 1의 400 µ L를 추가 합니다. 다시 빈 우물에 진공을 적용 하기 전에 5 분 기다립니다.
      4. 다시 같은 방식으로 진공을 적용 (단계 3.6.4.2 참조).
      5. 진공에서 점 오 점 기구를 분해, 멤브레인를 제거 하 고 2로 그것을 씻어 x SSC. DNA 바인딩 면이 초과 2를 제거 하는 깨끗 한 종이 타월에 막 배치 x SSC.
      6. UV-crosslink 적절 한 UV crosslinker;와 막에 blotted DNA 막 이제 교 잡에 대 한 준비입니다.
        참고: 젖은 막 자외선 가교에 대 한 사용할 수 있습니다. 건조, 자외선 가교 화 막 저장 될 수 실내 온도에. 자세한 내용은 테이블의 자료에서 찾을 수 있습니다.
  7. 교 잡 및 세척
    1. 워밍업-65 ° C 물 목욕에서 교 잡 버퍼.
    2. 효소 방사성 α-32P dCTP와 DNA 프로브를 레이블 하 고 제조자의 권고에 따라 상용 키트를 사용 하 여 그것을 정화.
      참고: 우리가 사용 하는 0.5-2.0의 프로브 길이 증강 발기인 지역 또는 바이러스 성 게놈에 단백질 코딩 순서에서 kb. 이 프로토콜 활용 신호 검출에 대 한 P 라는 방사성 조사 32, 비록 비 방사능 chemiluminescent 또는 형광 프로브 사용할 수 있습니다 ( 토론 섹션을 참고 하십시오).
    3. DNA 바인딩 측을 가진 교 잡 병에 막 장소, 린스 5 mL와 함께 막 prewarmed 교 잡 버퍼, 버퍼를 삭제. 그런 다음 prewarmed 교 잡 버퍼의 10 mL을 추가 하 고 65 ° c.에 설정 회전 교 잡 오븐에 병을 배치 ≥5 분 회전 합니다.
    4. 100 ° c.에서 열 블록 세트에 튜브를 삽입 하 여 20 µ L 10 mg/mL 전단 청 어 나 연어 정자 DNA 솔루션 및 32P 표시 된 프로브 (≥107 cpm) 5 분의 열 변성 그런 다음 스냅인-≥2 분, 짧게, 스핀에 대 한 얼음에 그들 감기 고 사용까지 얼음에 계속.
      주의: 방사성 DNA 프로브에 대 한 스크류 캡 및 o-링 1.5 mL 튜브 사용 해야 합니다.
    5. 병 변성된 정자 DNA와 방사성 프로브는 교 잡에서 교 잡 버퍼를 신속 하 게 추가할 10 병을 흔들어 혼합 하는 s. 65 ° C 오븐에 병을 반환 하 고 ≥4 h 65 ° C에서 회전 병 품 어.
    6. 교 잡 완료 되 면 회전을 중지 하 고 교 잡 병을 제거 한 다음 누출 방지 플러그 물개 모자와 함께 50 mL 원뿔 관으로 방사성 프로브 솔루션을 붓는 다. 방사성 물질에 대 한 지정 냉장고에 배치 하는 적절 한 컨테이너에 프로브를 저장 합니다.
      참고: 사용된 교 잡 버퍼 4 ° C에서 저장 된 프로브를 사용할 수 있습니다 다시 5 번 이상 5 분 동안 100 ° C 물 목욕에서 교 잡 버퍼를 포함 하는 누출 방지 플러그 인감 모자 50 mL 원뿔 튜브를 배치 하 여.
    7. 워시 버퍼 65 ° c 온수로 막 씻어 교 잡 병을 20 ~ 30 mL의 워시 버퍼를 추가 하 고 5 분이 세척 2 번 더 반복에 대 한 회전.
      참고: 세척 솔루션의 방사능을 측정 하 고 현지 연구소에서 요구 하는 경우 그것을 기록 합니다.
    8. 막 세척 하는 동안 5 분에 대 한 이미지 지우개에 스크린 이미징 형광체를 놓습니다.
    9. 3 세척 후 교 잡 병에서 멤브레인을 제거 하 고 제거 종이 타 올, 멤브레인에 초과 버퍼에 투명 한 플라스틱 종이 홀더 막 장소. 가 거 카운터를 사용 하 여 막에 방사성 신호를 확인 하십시오. 신호 강도 따라 하룻밤 10 분 막에 지워진된 형광 이미징 화면을 표시 합니다.
    10. 시스템 스캔 및 이미지를 사용 하 여 화면을 검색 하 고 각 도트의 신호 강도 대 한 데이터를 얻을.
  8. 데이터 분석
    1. 스프레드시트 및 데이터 분석 소프트웨어 (예를 들어, Excel)을 사용 하 여 표준 곡선을 그립니다.
      참고: 로그 로그 선형 회귀 표준 곡선을 그리는 데 사용 되었다.
    2. 보간에 의해 바이러스 성 DNA 샘플의 각각에 대 한 나노 그램 (ng-eq)에 해당을 결정 합니다. Ng-eq DNA 바이러스 성 DNA 분자의 수에 해당 하는 표준 곡선을 그리는 데 사용 되는 플라스 미드의 금액입니다. 때 플라스 미드 DNA의 길이가 8000 혈압, 단일 가닥 AAV 바이러스 성 DNA의 1 ng-eq 2.275 108 입자 x에 해당.
      참고: ng-eq 변환할 수 바이러스 성 입자의 수는 다음 방정식에 의해:
      단일 가닥 AAV 입자를 계산하기 위한 방정식; DNA 정량화; 분자 유전학 공식.
      플라스미드 길이를 이용하여 이중 가닥 AAV 입자를 계산하기 위한 방정식; 과학적 공식.
      AAV 입자의 수는 전통적으로 "vg" (벡터 게놈) 또는 "DRP" (DNase I-저항 입자)로 표현 됩니다.
    3. 시작 자료의 AAV 농도 계산 합니다. Blotted 바이러스 성 DNA는 66.7%를 대표 하기 때문에 백분율 계산 공식: 데이터 분석의 경우 (320/400 × 200/240 × 100%). 1 ng-eq 1.7 x 109 입자/mL에 해당 하는 시작 물자에 있는 바이러스 성 DNA의 수학 방정식 계산식, 비율 나눗셈 곱셈 과학적 표기법 .
      참고:이 수정 필요 하지 않습니다 시작 자료에 포함 된 모든 바이러스 성 DNA 손실 없이 막에 얼룩이 ( 그림 1참조).

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결과

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순화 AAV 벡터 주식 대규모 생산의 정량에 대 한 양적 도트도 말의 대표적인 결과 그림 1에 표시 됩니다. 이 점 오 점 분석 결과 함께 더블-좌초 AAV2G9-CMV-GFP 벡터 재고 titer 결정 했다. 벡터는 세 슘 염화 물 (CsCl) 밀도 그라데이션 ultracentrifugation 다음 앞에서 설명한20으로 투 석의 두 라운드 순화 되었다. 일반적으로, 순화 AAV 벡터 주식에 대 한 각 AAV 벡터 주식 (예를 들어, 0.3 µ L, 0.1 µ L, 그리고 0.03 µ L)의 3 개의 다른 볼륨 중복 수정에 위에서 설명한 점 오 점 절차를 받게 됩니다. DNase I 효소 A 단계 3.2, S. marcescens endonuclease 대신 사용 되 고 추출 하 고 바이러스 성 DNA를 정화 상용 키트 단계 3.4 (

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토론

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이 보고서에서 AAPs AAV capsid 어셈블리에서 그들의 역할을 공부 하 고 양적 점 오 점 분석 실험의 유틸리티를 설명 합니다. 이러한 연구에서 얻은 지식을 AAV capsid 어셈블리 과정에서 타고 난 차이 다른 serotypes 사이 AAPs의 기능적인 역할에 대 한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 점에서 AAV VP3 AAP 상호 보완성 점 얼룩 뱀 AAV VP3 capsid 어셈블리에 대 한 그것의 동족 AAP의 공동 식에 엄격한 종속성 표시 그리고 뱀 AAP의 분리 serotypes capsid 어셈블리를 홍보 하지 않습니다 분석 결과 . 이 관측은 흥미로운 AAP 종속 AAV serotypes에 있기 때문에 이전 조사 되었다 (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 12)는 모두 분리 압6을 이용 하 여 어느 정도 이상 어셈블리를 처리할 수.

양적 점 또는 슬롯 오 점 교 잡의 편리한 방식으로

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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아오 아오 채 플 힐에서 북캐롤라이나의 대학에는 pEMBL-CMV-GFP 플라스 미드와 함께 우리를 제공 하는 감사 합니다. 우리는 원고의 중요 한 독서에 대 한 크리스토퍼 쳉과 사무엘 제이 황 감사합니다. 이 작품에 의해 지원 되었다 공중 보건 서비스 부여 (NIH R01 NS088399 T32 EY232113).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
벤조나제밀리포어시그마1016970001본문에서 Serratia marcescen endonuclease로 언급됩니다.
DNase IRoche4716728001본문에서 DNase I Enzyme A로 지칭된다.
DNase IInvitrogen18047019본문에서 DNase I Enzyme B라고 합니다.
DNase INew England BiolabsM0303L본문에서는 DNase I Enzyme C라고 합니다.
1.5mL 부착 O-링 나사 캡 미세 원심분리기 튜브Corning430909
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브Thermo Fisher Scientific05-408-129
15mL 폴리프로필렌 원추형 튜브Corning352097
3m 아세트산나트륨TeknovaS0298
50mL 폴리프로필렌 원추형 튜브Corning430291
AAV-293 세포애질런240073HEK-293 세포주는 AAV 비리온의 패키징에 최적화되어 있습니다.
AccuGENE 0.5 M EDTA 용액Lonza51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0Lonza51238
AccuGENE 10% SDSLonza51213
AccuGENE 1X TE 버퍼Lonza51235
Bio-Dot ApparatusBio-Rad1706545
소 혈청 알부민MilliporeSigmaA3294
Cell LifterCorning3008
클로로포름MilliporeSigma 372978
DNA 추출기 키트Wako Pure Chemical Industries295-50201이것은 정제된 바이러스의 정량적 점 얼룩에 사용됩니다. 당사는 제조업체가 제공한 설명서에서 Protocol Scheme 2에 대해 권장되는 각 단계에서 모든 시약의 절반 부피만 사용합니다.
둘베코' s DMEM(Modified Eagle Medium)-고포도당(4.5g/L)Lonza12-614F
ElectroMAX DH10BCells Thermo Fisher Scientific18290015
Ethanol 200 ProofDecon Labs2716
Fetal Bovine SerumVWR1500-500
Ficoll 400Alfa AesarB22095폴리수크로스 400이라고 합니다.
광 현미경ZeissAxiovert 40 CFL
GlycogenRoche10901393001
Herring Sperm DNAInvitrogen15634-017
혼성관Thermo Fisher Scientific13-247-150
ImageQuant TLGE Healthcare Life SciencesImageQuant TL
L-glutamine 200 mMLonza17-605E
염화마그네슘 육수화물MilliporeSigmaM0250
MicroPulser ElectroporatorBio-Rad1652100
미니 퀵 스핀 DNA 컬럼MilliporeSigma11814419001
pAAV-RC2 VectorCell Biolabs IncVPK-422
페니실린/스트렙토마이신 10K/10KLonza17-602E
인산염 완충 식염수Lonza17-516F
인광 노출 카세트GE 헬스케어 생명 과학다양한
인광 이미징 스크린GE 헬스케어 생명 과학다양한
플라스미드 맥시 키트QIAGEN12162
플래티넘 PFX DNA 중합효소Invitrogen
PolyethyleniminePolysciences Inc23966-2
폴리비닐피롤리돈MilliporeSigmaP5288
Prime-It II 랜덤 프라이머 라벨링 키트Agilent Technologies300385
프라이머 AAP Forward (N25 AAP ORF의 4번째 뉴클레오타이드, RE1은 클로닝을 위한 제한 효소 부위임): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		MilliporeSigmaCustom Primer
Primer AAP Reverse (N25는 AAP ORF의 마지막 25개 뉴클레오티드이며, RE2는 클로닝을 위한 제한 효소 부위입니다): TCTT-RE2-N25MilliporeSigma커스텀 프라이머
Primer VP3 Forward (N25 VP3 ORF의 처음 25개 뉴클레오티드, RE1은 클로닝을 위한 제한 효소 부위임): CTAA-RE1-CACC-N25MilliporeSigmaCustom Primer Primer
VP3 Reverse (N25는 AAP ORF의 마지막 25개 뉴클레오티드입니다. RE2는 클로닝을 위한 제한 효소 부위입니다): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Proteinase K SolutionInvitrogen25530-049
Restriction EnzymesNew England BiolabsVarious
Salmon Sperm DNAInvitrogen15632011
Serological PipettesThermo Fisher Scientific13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
염화나트륨Thermo Fisher ScientificS271-10
구연산나트륨 이수화물MilliporeSigmaC8532
T4 DNA 중합효소New England BiolabsM0203L
Thermal CyclerEppendorf6321000515
Tissue-Culture Treated 6-well PlateCorning
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-5
Typhoon FLA 7000GE Healthcare Life Sciences28955809
UltraPure Buffer-Saturated PhenolInvitrogen15513-047
UV CrosslinkerSpectrolineXLE-1000Optimal Crosslink 모드를 사용하여 120mJ/cm2.
Zeta-Probe 멤브레인Bio-Rad162-0165
트 형11708013353046

참고문헌

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