Drosophila 난소 줄기 세포 틈새 시장 개발을 공부 하는 우수한 모델 시스템입니다. 애벌레와 성인 난소를 해 부 방법 출판 되었습니다 비록 번데기 난소 해 자세히 게시 되지 않은 다른 기술이 필요 합니다. 여기 우리는 해 부, 얼룩, 번데기 난소를 장착 한 프로토콜 개요.
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이 논문에서
요약
초록
성인 초파리 난소와 달리 번데기 난소는 상대적으로 어려운 액세스 하 여 검사 때문에 그들의 작은 크기, 반투명, 번데기 케이스 내 인. 번데기 난소를 해 부의 도전 또한 번데기 내의 그들의 물리적 위치에 속 인 다: 난소 번데기 복 부 내부 지방 신체 세포로 둘러싸여 있으며, 적절 한 항 체 얼룩이 지기 수 있도록 이러한 지방 세포를 제거 해야 합니다. 이러한 문제를 해결 하려면이 프로토콜 번데기 복 부에서 지방을 신체 세포를 추출 하는 사용자 지정 된 파스퇴르 pipets를 사용 합니다. 또한, 연 발된 coverglass 대신 사용 된다 microcentrifuge 튜브 착 과정 중 번데기의 가시성을 개선 하기 위해. 그러나, 이들과 다른 장점이이 프로토콜에 사용 되는 툴,에 불구 하 고 이러한 기술의 성공적인 실행 될 수 있습니다 여전히 번데기 난소의 작은 크기로 인해 연습의 몇 일. 이 프로토콜에서 설명 하는 기술은 난소 번데기 개발의 다양 한 단계에서 분석 하는 시간 과정 실험에 적용할 수 있습니다.
서론
줄기 세포 연구 초파리 난소를 사용 하 여 줄기 세포 틈새1,2,,34의 첫 번째 문서부터 널리 확장 했다. 개발 도구의 계보 추적 유전자 초파리 난소 해 일반적으로 줄기 세포 계보를 연구 하는 데 사용 되었습니다 다음 하 고 줄기 세포 유지, 확산, 및 운명 줄기 세포 틈새에 경로 신호. 이러한 신호 통로의 지식 탈 선 줄기 세포 활동5,,67에서 발생 하는 암의 잠재적인 원인에 대 한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 그것은 또한 최근 여 포 줄기 세포 (FSCs)로 알려진 초파리 난소에서 체세포 줄기 세포 강하게 그들의 조직8의 여러 측면에서 포유류 장 줄기 세포를 닮은 표시 되었습니다. 이러한 이유로, 초파리 난소는 줄기 세포 행동을 공부 하기 위한 매우 유용한 모델 시스템.
이른 줄기 세포 개발 및 틈새, 마지막 줄기 세포 조직에 단서를 각각 제공 하는 애벌레와 성인 난소 번데기 난소는 생식 및 체세포 재구성 및 그들의 정체성을 확립 하는 중간 구조 9 , 10. 여러 연구 번데기 난소10,11,,1213에 조직 개발의 측면 검사, 질문 남아 있다 분화와 공간 조직에 관한 난소 세포 유형 번데기 개발 중. 특히, FSCs의 규격은이 기간 동안 발생합니다. 이 프로토콜 설명 해 부하 고 원하는 시간 지점에서 번데기 난소를 얼룩이 지는 방법-성인 단계를 자세하게는 애벌레에서 번데기 난소 개발 분석 시간 과정 실험에 사용할 수 있는 기술.
작은 크기, 반투명, 및 번데기 복 부 내에서 번데기 난소의 어려움에 대 한 계정,이 프로토콜 활용 도구 주문 품 얇은 밀고 파스퇴르 피펫으로 복 부 지방을 신체 조직에 항 체 접근을 방해를 제거 하는 난소입니다. 명확 하 고, 연 발 coverglass 번데기와 락는 "Nutator"에 난소에 gentler 플랫폼의 제공 더 큰 시야를 얼룩이 지는 항 체 중에 사용 마이몬과 Gilboa14애벌레 난소 해에 대 한 프로토콜에 따라, Triton X-100의 상대적으로 높은 농도 고용 착 절차의 초기 단계에서 세포 막 permeabilization 및 항 체에 대 한 액세스를 극대화 하는 난소 세포입니다.
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프로토콜
1입니다. EggLaying
- 결합 약 10 남자와 정상적인 풍부한 비행 음식 효 모와 보충의 유리병에 원하는 유전자의 15 여성 성인 초파리 파리. 유리병과 밀을 피하기 위해, 성관계 여성 더 이상 보다 2-4 h14에 대 한 계란을 낳을 수 없습니다.
- 비행 음식 다른 유리병에 대 한 열기는 유리병을 활용 하 여 새로운 병으로 유리병에서 성인 전송. 계란 3-4 일 동안 실 온에서 애벌레로 개발을 허용 합니다.
2. 여성 애벌레를 선택
- 소프트로 촉촉한 좋은 브러시를 사용 하 여, 잘 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 가득한 테두리에 유리를 유리병에서 방황 3 탈피 애벌레를 전송 유리병의 벽을 따라 브러시와 롤링 운동을 확인 합니다. 1 x PBS 가득 잘 다른 그들을 전송 하 여 애벌레에서 음식을 파편을 씻어.
- 남성과 여성의 애벌레 집게를 사용 하 여 구분 합니다. 남성 애벌레, 라운드, 크고 반투명 testes의 앞쪽 끝15에서 아래로 몸 약 2/3의 측면 쪽에 뚱뚱한 몸에 포함 된의 쌍을 확인 합니다. 여성 애벌레 평균에 더 큰, 남성, 보다 덜 반투명 고 훨씬 작은 생식 선을 검출 하기가 더 어렵습니다.
- 여성 애벌레를 수집 남성 애벌레에 대 한 선택 합니다. 우물에서 적어도 10 여성을 수집 합니다. 1 x PBS 잘 가득 별도 여성 애벌레를 놓습니다.
- 부드럽게 신선한 비행 식품의 새로운 유리병에 여성 애벌레를 전송 집게를 사용 누 룩과 보충.
- Pupariation16을 촉진 하기 위하여 어두운 위치에서 여성 애벌레와 유리병을 놓습니다. 하루 동안, pupariation에 대 한 애벌레를 모니터링 합니다. 각 유 충 움직이게 하 고는 prepupa로 개발 하 고, 원형 유리병에 대 한 prepupa 고 때 처음에 prepupa 형성 하는 대략적인 시간을 기록 합니다. 앞쪽 spiracles의 돌출 및 puparium 형성17의 타이밍에 의해 prepupae를 식별 합니다. Prepupae (puparium 형성, APF 후 시간 측정) 원하는 시간 정도로 개발을 허용 합니다.
참고: 약 10 h 간격 내에서 puparium 형성을 받 다 어떤 동물 든 지 여겨질 수 있다는 prepupa. 자리를 차지 하는 내부 탈피 후 번데기 단계 puparium 형성 후 약 12 h를 시작 합니다.
3. 항 체 얼룩이 Pupae 준비
-
번데기 뚱뚱한 몸을 비운 나중 단계에서 사용 되는 얇은 유리 피펫으로 형성 합니다.
- 분 젠 버너에 파스퇴르 피펫으로의 유리 팁을 녹여. 유리가 녹으면 집게를 사용 하 여 얇은 팁을 피펫으로의 나머지에서 가로로 팁을.
- 냉각 후, 깔끔한 원형 개통을 형성을 피펫으로 팁의 일부를 끊다. 전구는 피펫으로의 다른 쪽 끝에 연결 합니다.
- 1 x PBS와 피펫으로 로드.
- 유리병의 벽에 붙어 있다, pupae 수확 번데기와 유리병 사이의 접촉 영역에 따라 물 작은 방울을 적용 합니다. 단백질 수 있도록 1-2 분을 대기 접착제를 부드럽게 촉촉한 괜 찮 브러시와 벽에서 번데기를 해제 하기 전에 해산. 1 x PBS 가득 잘 유리에 번데기를 전송 합니다. 우물과 밀을 피하기 위해 번데기 당 단일 잘을 칩니다.
- 한 쌍의 집게와 번데기의 후부 끝을 잡고, 번데기의 머리 표시 될 때까지 신중 하 게 다른 쌍 번데기 케이스의 앞쪽 부분을 눈물.
- 집게와 번데기 머리의 앞쪽 대부분 팁을 부드럽게 당겨 번데기는 번데기 케이스에서.
참고: 뚱뚱한 몸 부분의이 과정 밖으로 유출 수 있습니다. - 하 고 복 부 자루만 남아 때까지 후부 반에서 번데기의 앞쪽 절반을 삭제 합니다.
-
복 부 자루에서 뚱뚱한 몸 세포를 추출 합니다.
- 얇은 유리 피펫으로 1 x PBS 다른 손에 가득 들고 한 손에 집게와 우물의 바닥에 대 한 복 부 자루를 파악.
- 번데기 난소 주변의 지방 신체 세포를 씻어 하 복 부에 자루와 천천히 피펫으로 1 x PBS의 개통으로 얇은 피펫으로 팁을 목표로 합니다.
참고: 난소는 한 쌍의 작은, 반투명, 전기, 및 직사각형 구조를 복 자루 안에 남아 있어야 한다. - 뚱뚱한 몸 세포 지방 시체의 2/3 이상 사라질 때까지 또는 난소 복 자루의 개통의 가까이 볼 수 있습니다 때까지 씻어. 그것은 매우 천천히이 단계를 실행 하는 것이 중요 사고에 의해 복 부 로부터 난소를 씻어 수 없습니다.
- 난소 뚱뚱한 몸을 셀 세척 하는 동안 밖으로 유출가지고 확인을 잘을 검사 합니다. 난소 안에 잘 볼 수 있다면, 그들은 복 부에 남아 있다 한다. 경우 난소 밖으로 서, 새로운 번데기에 잘 놓고이 단계를 반복 합니다.
- 고정 버퍼 (1 x PBS, 4 %paraformaldehyde)으로 가득 분명 coverglass 챔버로 복 부를 전송 하 고 상단에는 뚜껑을 배치. 되도록 난소의 충분 한 수 견딜 얼룩 및 장착 과정 보다 더 많은 난소를 해 부.
주의: 고정 버퍼 paraformaldehyde 독성을 포함 합니다. 적절 한 보호 장갑, 안전 안경, 등등을 착용 하십시오.
4입니다. Immunohistochemistry
- 착 색 과정을 통해 집게를 사용 하 여 부드럽게 밀어 어떤 부동 난소는 덮개 유리의 바닥에 난소 항 체 솔루션에 완전히 몰입 하는 보장 하기 위해.
- 장소는 Nutator의 평평한 표면에 양면 테이프의 스트립 하 고 연 발된 coverglass 접착 표면에 장소.
- 실 온에서 15 분 동안 3.7 단계에서 고정 버퍼에서 난소를 품 어.
- 난소를 씻어 3 시간 1 %1 x PBS에 Triton X-100 5, 10, 및 45 분 (총에서 1 시간), 각각, 철저 한 permeabilization 수 있도록.
- 1 x PBS 0.5%에서 10% 정상 염소 혈 청에서 난소를 차단 30 분 대 한 트라이 톤 X-100.
- 600에서 난소를 밤새 품 어 선택의 1 차적인 항 체의 µ L 희석 0.5%와 1 x PBS에 적절 한 농도에 4 ° c.에 트라이 톤 X-100
- 1 x PBS 0.5%에서 3 시간 5 분 동안 난소 린스 트라이 톤 X-100.
- 선택의 이차 항 체의 600 µ L에 2 h 0.5%와 1 x PBS에 적절 한 농도를 희석 Triton X-100 실내 온도에 대 한 난소를 품 어.
- 1 x PBS 0.5% 트라이 톤 X-100와 1 x PBS에 5 분 동안 한 번에에서 5 분 동안 두 번 난소를 씻어.
5. 해 부하 고 번데기 난소를 장착
- 현미경 슬라이드에 1 x PBS의 작은 방울을 배치 합니다. 복 부 자루에서 연 발된 coverglass 유리 잘 전송 사용 집게 1 x PBS 가득 합니다. 우물과 밀을 피하기 위해 번데기 당 단일 잘을 칩니다.
- 찢 어 떨어져 복 부 자루 및 모든 나머지 지방 시체 집게와.
참고: 작은, 반투명, 전기, 및 직사각형 구조는, 난소는 우물 안에 표시 되어야 합니다. 난소는 종종 밀접 하 게 지방 기관에 의해 포위, 모든 뚱뚱한 몸을 철저 하 게 늘 확인 하는 것이 중요 하다 그래서 떨어져. - 1 x는 집게의 끝 사이 난소의 중심을 파악 하 여 슬라이드를 현미경에 PBS의 드롭에 우물에서 난소를 전송. 그것은 매우 잃을 또는 전송 하는 동안 그들을 파괴 하는 것을 그렇게 하지 않도록 난소를 압박 하지 않고 확고 한 그립을 사용 하는 것이 중요. 솔루션을 시간이 지남에 밖으로 마르면 때 슬라이드에 1 x PBS의 몇 방울을 추가 합니다.
- 일단 모든 난소는 해 부 하 고 현미경 슬라이드, 피펫으로 40 µ L 22 x 22 mm coverslip 장소 난소 위에 부드럽게 coverslip에 장착 매체의 전송. 슬라이드 이미징 전에 하룻밤을 건조 하 게.
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결과
이 절차의 성공적인 실행 명확한 항 체는 그 구조와 초파리 번데기 난소의 세포 조직 얼룩 발생 한다. 이 프로토콜에서 설명 Immunohistochemistry 애벌레와 성인 난소에 얼룩진 일반적으로 셀 형식을 식별 하 사용할 수 있습니다. 셀에서 파생 된 번데기 줄기의 메뚜기 세포18 (흰색에서 Fasciclin III에 의해 제시 된)는 그림 3에 표시 됩니다. 번데기 난소의 세포 조직을 강조, 이외에 (인 히스톤 H3 그림 3에서처럼 녹색 얼룩) 등 세포 증식에 얼룩이 지는 항 체를 사용할 수 있는 줄기 세포 등의 세포 분열 패턴을 공부 mitotically 현재 셀 종류입니다. 형광 항 체 신호 confocal 현미경 검사 때 약한 경우, 그것은 가능성이 난소 항 체 번데기 복 부에 있는 부족 한 뚱...
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토론
이 프로토콜의 가장 중요 하 고 어려운 단계 고정 전에 번데기 난소의 준비를 포함 한다. 작고 뚱뚱한 몸 세포 번데기 복 부 내부에 의해 묻혀 난소 항 체와 함께 충분히 스테인드은,이 뿐만 아니라 복 부 자루에 큰 여 겸 자, 함께 눈물 하지만 방해 하는 뚱뚱한 몸을 셀 추출 하는 것이 중요 합니다 항 체에서의 난소 이 단계를 성공적으로 실행 해야 복 부 자루에서 뚱뚱한 몸 세포를 세척 하는 동안 파스퇴르 피펫으로 전구에 미묘한 압력의 응용 프로그램 (예: 1-2 지방 신체 세포가이 단계 동안 초당 복 부를 떠나야 한다). 부드러운 힘을 사용 하 여 실패 가능성이 난소는 복 부와 유리에 잘 유출 될 수 있습니다. 스스로 난소, 반투명, 작고 포 셉으로 파악 하기가 어렵습니다 때문에, 그들은 전체 얼룩 절차에 걸쳐 복 부 자루 내에서 유지 되어야 합니다. 따라서, 온다면 난소는 복 부의 고정 이전 준비 단계, 그것은 매우 어려운 검색 하 여, 얼룩, 프로토콜 중 그들을 그들의 고립 된 형태로 탑재 것 것 이다.
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공개 사항
저자는 선언 하는 관심의 없습니다 충돌 있다.
감사의 글
이 연구는 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 대표이사 (RO1 GM079351). 우리는 그녀의 원래 프로토콜에 따라 번데기 난소 해에 그녀의 유용한 조언에 대 한 Dorothea 좋음 감사 합니다. 우리는 또한 그녀의 지원 및 원고에 대 한 의견에 대 한에 이미 Reilein 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
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| Nunc Lab-Tek 챔버 커버 유리 | , Thermo Fisher, Scientific | 155383 | |
| 해부 현미경 | Nikon | SMZ-10A | |
| 컨포칼 현미경 | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| 분석 소프트웨어 | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 우울증 유리 스폿 플레이트 | Pyrex | 7220-85 | |
| 파스퇴르 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| 파스퇴르 피펫 전구 | 다양한 공급 업체 | ||
| 분젠 버너 | 다양한 공급 업체 | ||
| Fisherfinest 프리미엄 서리 현미경 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm 유리 커버 슬립 No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| 양면 테이프 | 스카치 | ||
| 너트 클레 | 이 아담스 | ||
| 파인 브러시 #0, #3-#5 | 다양한 공급업체 | ||
| Gilson Pipetman 스타터 키트 | 토마스 사이언티픽 | F167300 | p20, p200, p1000 포함 피펫터 |
| 16% 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | 15710 | 에서 4% 파라포름알데히드로 희석 |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | 0.5% Triton 농도로 PBST에서 10% 정상 염소 혈청으로 희석 |
| 1차 항체(프로토콜: 7G10 anti-Fasciclin III 희석 1:250, 토끼 항인히스톤 H3 희석 1:1000) | 다양한 공급업체(프로토콜: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | 0.5% 트리톤 농도로 PBST에 희석 | |
| 2차 항체(프로토콜: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | 다양한 공급업체(프로토콜: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | 0.5% 트리톤 농도로 PBST에서 희석 | |
| 플라이 바이알 | Denville Scientific | V9406 | |
| 면봉, 와이드 바이알용 | Genesee Scientific | 51-102W | |
| 효모, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| 플라이 식품 | 실험실 | 에서 생산물, 맥주 효모, 옥수수 가루, 당밀, 한천, EtOH, 페니실린, 메틸 4- 하이드로 벤조 에이트 및 프로피온산 | |
| 수컷 및 암컷 Drosophila< / em>의 혼합물 (프로토콜에 사용되는 유전자형 : yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | 블루밍턴 초파리 주식 센터 |
참고문헌
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