Drosophila 난소 줄기 세포 틈새 시장 개발을 공부 하는 우수한 모델 시스템입니다. 애벌레와 성인 난소를 해 부 방법 출판 되었습니다 비록 번데기 난소 해 자세히 게시 되지 않은 다른 기술이 필요 합니다. 여기 우리는 해 부, 얼룩, 번데기 난소를 장착 한 프로토콜 개요.
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이 논문에서
요약
초록
성인 초파리 난소와 달리 번데기 난소는 상대적으로 어려운 액세스 하 여 검사 때문에 그들의 작은 크기, 반투명, 번데기 케이스 내 인. 번데기 난소를 해 부의 도전 또한 번데기 내의 그들의 물리적 위치에 속 인 다: 난소 번데기 복 부 내부 지방 신체 세포로 둘러싸여 있으며, 적절 한 항 체 얼룩이 지기 수 있도록 이러한 지방 세포를 제거 해야 합니다. 이러한 문제를 해결 하려면이 프로토콜 번데기 복 부에서 지방을 신체 세포를 추출 하는 사용자 지정 된 파스퇴르 pipets를 사용 합니다. 또한, 연 발된 coverglass 대신 사용 된다 microcentrifuge 튜브 착 과정 중 번데기의 가시성을 개선 하기 위해. 그러나, 이들과 다른 장점이이 프로토콜에 사용 되는 툴,에 불구 하 고 이러한 기술의 성공적인 실행 될 수 있습니다 여전히 번데기 난소의 작은 크기로 인해 연습의 몇 일. 이 프로토콜에서 설명 하는 기술은 난소 번데기 개발의 다양 한 단계에서 분석 하는 시간 과정 실험에 적용할 수 있습니다.
서론
줄기 세포 연구 초파리 난소를 사용 하 여 줄기 세포 틈새1,2,,34의 첫 번째 문서부터 널리 확장 했다. 개발 도구의 계보 추적 유전자 초파리 난소 해 일반적으로 줄기 세포 계보를 연구 하는 데 사용 되었습니다 다음 하 고 줄기 세포 유지, 확산, 및 운명 줄기 세포 틈새에 경로 신호. 이러한 신호 통로의 지식 탈 선 줄기 세포 활동5,,67에서 발생 하는 암의 잠재적인 원인에 대 한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 그것은 또한 최근 여 포 줄기 세포 (FSCs)로 알려진 초파리 난소에서 체세포 줄기 세포 강하게 그들의 조직8의 여러 측면에서 포유류 장 줄기 세포를 닮은 표시 되었습니다. 이러한 이유로, 초파리 난소는 줄기 세포 행동을 공부 하기 위한 매우 유용한 모델 시스템.
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프로토콜
1입니다. EggLaying
- 결합 약 10 남자와 정상적인 풍부한 비행 음식 효 모와 보충의 유리병에 원하는 유전자의 15 여성 성인 초파리 파리. 유리병과 밀을 피하기 위해, 성관계 여성 더 이상 보다 2-4 h14에 대 한 계란을 낳을 수 없습니다.
- 비행 음식 다른 유리병에 대 한 열기는 유리병을 활용 하 여 새로운 병으로 유리병에서 성인 전송. 계란 3-4 일 동안 실 온에서 애벌레로 개발을 허용 합니다.
2. 여성 애벌레를 선택
- 소프트로 촉촉한 좋은 브러시를 사용 하 여, 잘 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 가득한 테두리에 유리를 유리병에서 방황 3 탈피 애벌레를 전송 유리병의 벽을 따라 브러시와 롤링 운동을 확인 합니다. 1 x PBS 가득 잘 다른 그들을 전송 하 여 애벌레에서 음식을 파편을 씻어.
- 남성과 여성의 애벌레 집게를 사용 하 여 구분 합니다. 남성 애벌레, 라운드, 크고 반투명 testes의 앞쪽 끝15에서 아래로 몸 약 2/3의 측면 쪽에 뚱뚱한 몸에 포함 된의 쌍을 확인 합니다. 여성 애벌레 평균에 더 큰, 남성, 보다 덜 반....
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결과
이 절차의 성공적인 실행 명확한 항 체는 그 구조와 초파리 번데기 난소의 세포 조직 얼룩 발생 한다. 이 프로토콜에서 설명 Immunohistochemistry 애벌레와 성인 난소에 얼룩진 일반적으로 셀 형식을 식별 하 사용할 수 있습니다. 셀에서 파생 된 번데기 줄기의 메뚜기 세포18 (흰색에서 Fasciclin III에 의해 제시 된)는 그림 3에 표시 됩니다. 번데기 난소의 세포 조직을 강조, 이외에 (인 히스톤 H3 그림 3에서처럼 녹색 얼룩) 등 세포 증식에 얼룩이 지는 항 체를 사용할 수 있는 줄기 세포 등의 세포 분열 패턴을 공부 mitotically 현재 셀 종류입니다. 형광 항 체 신호 confocal 현미경 검사 때 약한 경우, 그것은 가능성이 난소 항 체 번데기 복 부에 있는 부족 한 뚱.......
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토론
이 프로토콜의 가장 중요 하 고 어려운 단계 고정 전에 번데기 난소의 준비를 포함 한다. 작고 뚱뚱한 몸 세포 번데기 복 부 내부에 의해 묻혀 난소 항 체와 함께 충분히 스테인드은,이 뿐만 아니라 복 부 자루에 큰 여 겸 자, 함께 눈물 하지만 방해 하는 뚱뚱한 몸을 셀 추출 하는 것이 중요 합니다 항 체에서의 난소 이 단계를 성공적으로 실행 해야 복 부 자루에서 뚱뚱한 몸 세포를 세척 하는 동안 파스퇴르 피펫으로 전구에 미묘한 압력의 응용 프로그램 (예: 1-2 지방 신체 세포가이 단계 동안 초당 복 부를 떠나야 한다). 부드러운 힘을 사용 하 여 실패 가능성이 난소는 복 부와 유리에 잘 유출 될 수 있습니다. 스스로 난소, 반투명, 작고 포 셉으로 파악 하기가 어렵습니다 때문에, 그들은 전체 얼룩 절차에 걸쳐 복 부 자루 내에서 유지 되어야 합니다. 따라서, 온다면 난소는 복 부의 고정 이전 준비 단계, 그것은 매우 어려운 검색 하 여, 얼룩, 프로토콜 중 그들을 그들의 고립 된 형태로 탑재 것 것 이다.
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공개 사항
저자는 선언 하는 관심의 없습니다 충돌 있다.
감사의 글
이 연구는 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 대표이사 (RO1 GM079351). 우리는 그녀의 원래 프로토콜에 따라 번데기 난소 해에 그녀의 유용한 조언에 대 한 Dorothea 좋음 감사 합니다. 우리는 또한 그녀의 지원 및 원고에 대 한 의견에 대 한에 이미 Reilein 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 겸자, 생물학 | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek 챔버 커버 유리 | , Thermo Fisher, Scientific | 155383 | |
| 해부 현미경 | Nikon | SMZ-10A | |
| 컨포칼 현미경 | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| 분석 소프트웨어 | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 우울증 유리 스폿 플레이트 | Pyrex | 7220-85 | |
| 파스퇴르 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| 파스퇴르 피펫 전구 | 다양한 공급 업체 | ||
| 분젠 버너 | 다양한 공급 업체 | ||
| Fisherfinest 프리미엄 서리 현미경 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm 유리 커버 슬립 No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| 양면 테이프 | 스카치 | ||
| 너트 클레 | 이 아담스 | ||
| 파인 브러시 #0, #3-#5 | 다양한 공급업체 | ||
| Gilson Pipetman 스타터 키트 | 토마스 사이언티픽 | F167300 | p20, p200, p1000 포함 피펫터 |
| 16% 파라포름알데히드 | 전자 현미경 과학 | 15710 | 에서 4% 파라포름알데히드로 희석 |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | 0.5% Triton 농도로 PBST에서 10% 정상 염소 혈청으로 희석 |
| 1차 항체(프로토콜: 7G10 anti-Fasciclin III 희석 1:250, 토끼 항인히스톤 H3 희석 1:1000) | 다양한 공급업체(프로토콜: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | 0.5% 트리톤 농도로 PBST에 희석 | |
| 2차 항체(프로토콜: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | 다양한 공급업체(프로토콜: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | 0.5% 트리톤 농도로 PBST에서 희석 | |
| 플라이 바이알 | Denville Scientific | V9406 | |
| 면봉, 와이드 바이알용 | Genesee Scientific | 51-102W | |
| 효모, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| 플라이 식품 | 실험실 | 에서 생산물, 맥주 효모, 옥수수 가루, 당밀, 한천, EtOH, 페니실린, 메틸 4- 하이드로 벤조 에이트 및 프로피온산 | |
| 수컷 및 암컷 Drosophila< / em>의 혼합물 (프로토콜에 사용되는 유전자형 : yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | 블루밍턴 초파리 주식 센터 |
참고문헌
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P.
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