단백질 및 모 세관 전자 초점 방법으로 그들의 Isoforms의 매우 민감하고 정량적 검출

Summary

모 세관 전자 초점 단백질과 매우 작은 생물 학적 샘플에서 그들의 isoforms의 상세한 특성을 사용 하는 항 체 기반, 磁, 높은 처리량 기법입니다. 다음 자동화 하 고 운반할 방식 검색 및 특정 단백질과 그들의 isoforms의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

Immunoblotting 생물학 견본에서 단백질 특성에 대 한 많은 실험실에서 일상적인 기술 되고있다. 대체 전략을 제공 하는 다음 프로토콜, 기존의 immunoblotting 모 세관 (cIEF), 많은 장점을가지고 초점 전자 비교. 이는 완전 한 서쪽 더 럽 히 절차 수행 ultrathin 모 세관 내부 항 체 기반, 자동, 급속 한, 및 양적 방법입니다. 이 기술은 젤 막,도 말의 스트립 전송 필요 또는 기존의 immunoblotting에 일반적으로 필요한 영화를 x 선 하지 않습니다. 여기, 단백질 분리 (전자 포인트, pI) 그들의 책임에 따라, 사용 하 여 보다는 microliter (400 nL) 총 단백질 lysate의. 전기 이동 법, 후 단백질 자외선 빛 치료, 기본 및 보조 (양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 활용)에 의해 모 세관 벽에 움직일 수 있다 항 체 외피, 누구의 바인딩을 통해 감지 향상 화학 (ECL), 점령 하 고 전 하 결합 소자 (CCD) 카메라에 의해 기록 된 수 있는 광 신호를 생성 한다. 디지털 이미지 분석 될 수 있다 및 계량 (피크 지역) 소프트웨어를 사용 하 여. 이 높은 처리량 절차 한 번;에 96 샘플을 처리할 수 있습니다 매우 민감한, picogram 범위의; 단백질 검출 그리고 자동화 때문에 높은 재현성 결과 생산입니다. 이러한 측면의 모두 매우 귀중 한 때 (예를 들어, 조직 샘플 및 생 검) 샘플의 수량 제한 요소입니다. 기술은 더 넓은 응용 프로그램 뿐만 아니라, 약물 또는 항 체, 바이오 마커 발견 및 진단 목적으로의 심사를 포함 하 여 있다.

Introduction

모 세관 전자 초점 (cIEF) 그들의 충전^1,2,3에 근거 하 여 단백질을 확인 하는 자동화 된, 모 세관 기반 immunoassay입니다. 그것은 매우 재현 하 고 신속 하 고 양적 단백질과 그들의 post-translationally 수정된 isoforms를 해결 하기 위한 능력입니다. 그것은 서쪽에 게 더 럽 히기와 같은 기존의 방법에 대안을 선물 한다. 매우 쉽게 액세스할 수 있는 샘플;에 풍부한 단백질의 존재 확인에 대 한 좋은 서쪽에 게 더 럽 히기 다양성, 시간 소비, 및 정확한 정량 모두 존재 도전, 특히 생물학 조직 샘플을 검사 하는 경우. 실제로, 다양성 서쪽 blotting에 고유의 문제는, 거기에 수많은 단계 참여, 로드 및 SDS 페이지 젤의 실행, 전송, 막에는 단백질의 다양 한 시 약으로 부 화 (예., 기본 및 보조 항 체, ECL), x 선 필름⁴에 개발. 현재, 서쪽 더 럽 히 기술 chemiluminescent 신호 (디지털 westerns)의 디지털 기록의 구현 개선 이다. 최근, 자동화 된 서쪽 더 럽 히 시스템 개발 되었습니다,....

Protocol

1. 세포 문화, 자극, 및 세포의 용 해

참고:이 방법은 많은 세포 유형으로 사용할 수 있습니다. 방법을 설명 하기 위해 예를 들어 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)를 사용 하 여 설명 되어 있습니다.

1. 적절 한 보충과 내 피 세포 기저 매체에서 10 cm 배양 접시 젤라틴 코팅에 HUVECs 문화 ( 재료의 표참조), 또한 5 %FCS, 표 피 성장 인자 (5 ng/mL), 혈관 내 피 성장 인자를 포함 하 고 (VEGF: 0.5 ng/mL), 기본적인 FGF (10 ng/mL), 인슐린과 같은 성장 인자 (20 ng/mL), 하이드로 코 티 손 (0.2 µ g/mL), 및 의약품 (1 µ g/mL).
2. 내 피 세포 기저 매체 1 %FCS 더 성장 인자 보충 보충 셀 밤새 굶 어.
3. 모든 매체를 발음, 한 접시 (제어), 내 피 세포 성장 인자 (기아 매체) 없이 문화 매체의 2 개 mL를 추가 다음 7 분에 대 한 두 번째 접시에 기아 문화 매체의 2 ml에서 50 ng/mL VEGF를 추가 합니다.
4. 매체를 발음 하 고 셀 10 mL 실내 온도 PBS로 2 회 세척.
5. 페 트리 접시 얼음에는 앞으로이 단계에서 ....

Results

디자인의 새로운 분석 결과: 분석 결과 플레이트 레이아웃 그림 1A에 표시 됩니다. 극대, 96 웰 스 384-잘 접시 12 웰 스의 블록에서에서 각 조건 (항 체)에 대 한 사용할 수 있습니다. 12 우물의 각 블록 A1-A12 또는 A13-A24에서 시작할 수 있습니다. 색상 코드 행 하나 다른 샘플 또는 시 약을 구별할 수 있습니다. 분석 결과 서식 파일 (그림 1B), 그에 대 한 관련 정보에서에서 특정 분석 결과 저장할 수 있습니다, 결과 분석의 나중 단계에서 사용할 수 있는. 그림 1C 는 프로토콜의 요약을 보여 줍니다.

HUVEC lysate에 ph.......

Discussion

감도 및 단백질의 해상도 proteomic 연구 생물 학적 샘플에 대 한 중요 한 있습니다. 셀에 분 수량에 존재 하는 단백질을 감지할 수 있게 되 고 큰 가치가 있다. cIEF는 향상 된 감도 단백질과 그들의 isoforms⁴의 검출에 대 한 해상도 제공할 수 있습니다.

이 기술은 많은 proteomic 연구 보고서^5,,67에 성공적으로 사용 되었습니다. 그래도, 몇 가지 제한이 연관, 등 모든 주요 항 체 그들은 기존의 immunoblots에서 잘 작동 하는 경우에 신호를 줄 수 있습니다. 아직, 유효한 항 체 때문에이 기술은 아주 새로운 cIEF, 기능 표시의 목록입니다. 마지막으로, 악기 한 번에 미만의 12 샘플 또는 이상의 96 샘플을 처리할 수 없습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinSimple
Premix G2, pH 5– 8 (중첩) 분리 구배, pH 2– 4 플러그	ProteinSimple	040-972	Ampholyte premix
DMSO 억제제 혼합물	ProteinSimple	040-510	Phosphatase 억제제; cIEF 1:50 희석용
수성 억제제 혼합	ProteinSimple	040-482	Protease 억제제; cIEF 1:25 희석용
pI 표준 ladder 3	ProteinSimple	040-646	cIEF 1:60 희석용
시료 사용 희석제	ProteinSimple	040-649
항체 희석제	ProteinSimple	040-309
Wash concentrate	ProteinSimple	041-108
양극액 리필	ProteinSimple	040-337
음극질 리필	ProteinSimple	040-338
과산화물 XDR	단백질Simple	041-084
Luminol	ProteinSimple	040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer	ProteinSimple	040-764
Capillaries-Charge Separation (1 pack) for	ProteinSimple	CBS700
분석 플레이트/뚜껑 키트	ProteinSimple	040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	잭슨 이뮤노리서치	711-035-152	cIEF용 사용 (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure 당나귀 안티-마우스 IgG (H+L)	잭슨 이뮤노리서치	715-035-150	사용된 cIEF용 (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody	Cell Signaling	9101	사용된 cIEF용 (1: 50)
Pan Erk Primary Antibody	Cell Signaling	9102	사용된 cIEF용 (1: 100)
Compass software	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	& 주의; C-22221	내피 세포 기저 매체
내피 세포 성장 매체 MV2 SupplementPack	PromoCell	C-39221	VEGFA 이상의 MV2에 대한 보충
	PeproTech	100-20
Long R3 IGF	Sigma-Aldrich	85580C/I1146	인슐린 유사 성장 인자
Bioruptor (Sonicator)	Diagenode	B01020001
BCA Protein 분석 키트	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 겔	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF 멤브레인	Millipore	IPVH00010
마이크로퓨지 튜브 보텍서
원심분리기
마이크로타이터 플레이트 어댑터, 원심분리기
피펫터용
팁
얼음