현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

Summary

이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.

Abstract

셀 이동은 상처 치유에 대 한 의무적 측면 이다. 인공 생성 상처 연구 동물 모델에 비용과 복잡 한 실험 절차에 자주 결과 정밀도에서 잠재적으로 부족 한 동안. 상피 세포의 생체 외에서 문화는 상처 치유와이 세포에 치료의 영향에 셀 철새 행동 연구를 위한 적합 한 플랫폼을 제공 합니다. 상피 세포의 생리는 종종 비 합칠 조건;에서 공부 그러나,이 방법은 자연 상처 치유 조건 닮은 하지 않을 수 있습니다. 기계적 방법으로 상피 무결성을 방해 현실적인 모델을 생성 하지만 분자 기술 응용 프로그램을 방해 수 있습니다. 따라서, 현미경 기반 기술을 상피 세포 이동 공부에 대 한 최적의 생체 외에서. 여기 우리는 두 가지 구체적인 방법, 인공 상처 스크래치 분석 결과 및 인공 마이그레이션 전면 분석 결과, 상피 세포의 이동 성능에 각각, 양적 및 질적 데이터를 얻을 수 있는 선발.

Introduction

셀 이동은 상피 갭의 최종 폐쇄와 방해 표면¹의 복원에 대 한 책임은 상처 치유, 필요 합니다. 생리 적인 조건²근처에이 복잡 한 과정의 복제 동물 모델에서 인위적인 상처를 수행 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 종종 비용과 복잡 한 실험 절차, 잠재적으로 상처 치유 과정의 복잡 한 특성으로 인해 개별 프로세스의 연구에 대 한 정밀 부족 발생 합니다.

상피 세포의 생체 외에서 문화는 역할이이 세포에 상처 치유와 셀 철새 행동 치료의 효과 연구를 위한 동물 모델에 대 한 유용한 대안을 제공 합니다. 상피 세포의 생리는 종종 비 합칠 문화^3,4,,56;를 사용 하 여 분자 기술로 공부 그러나, 상피 무결성 중단 일반적으로 정밀한 기계 절 개 함으로써 이루어집니다. 세포 배양에서이 셀의 무시할 수 상처 격차에 노출 될 수 있습니다 그리고 그들은 분자 생물학 기술에 대 한 너무 작은 샘플을 나타내는 의미 합니다. 그러나, 이러한 병 변 밍 크 폐 상피 세포 (Mv1Lu) 또는 자발적으로 불멸 하 게 인간의 keratinocyte (HaCaT) 셀 등 일부 상피 세포 라인의 타고 난 철새 속성의 활용, 미세한 규모에서 공부 될 수 있다 라인입니다.

여기 우리는 상처 치유^3,4,,78의 맥락에서 상피 세포의 마이그레이션에 양적 데이터를 얻기 위해 적당 한 현미경 검사 법에 대 한 방법을 설명 합니다. 또한, 우리는 마이그레이션 중 상피 monolayers에 발생 질적으로 분자와 형태학 상 변화를 공부 도움이 되는 추가 방법을 제시. 전반적으로, 이러한 메서드는 상처 치유 하는 동안 역학과 상피 세포 행동 및 치료에 대 한 응답으로 관련 된 형태학 상 변화를 공부 하는 프레임 워크를 제공 합니다.

Protocol

1. 인공 상처 스크래치 분석 결과 양적 연구

1. 세포 단층 준비
   1. 무 균 조건 하에서 작업, 씨 그리고 혈 청-보충 매체를 사용 하 여 문화 플라스 크에 Mv1Lu 또는 HaCaT 상피 세포 성장. 한 번 모든 24-48 h 매체를 새로 고침 합니다. 셀 도달 80% 합류, 후는 적절 한 방법, 즉, trypsinization⁹를 사용 하 여 셀을 분리 합니다.
      참고: Mv1Lu 및 EMEM 및 DEMEM 문화 매체를 사용 하 여 상피 세포를 교양 HaCaT 각각 2 m L-글루타민, 보완 및 5% CO₂의 제어 분위기 37 ° C에서 알을 품. 모든 셀 라인 셀 농도 전체 confluency를 도달 하는 데 필요한 타이밍을 결정 하기 위해 철저 하 게 분석 해야 합니다. 일반적으로 Mv1Lu 또는 HaCaT 세포에 대 한 2-4 x 10⁴ 또는 4-6 x 10⁴ 셀/글쎄, 각각은 시드 175 cm² 문화 플라스 크에 고 합류 하 80%에서 최대 35 x 10⁶ Mv1Lu 또는 1 x 10⁷ HaCaT 세포 생성 합니다.
   2. 12 잘 또는 24-잘 문화 접시에 각 잘 셀의 2 mL에에서 씨. 일단 모든 24-48 h. 확인 셀 숫자는 2 ~ 3 일 후 100% 합류에 도달 충분히 높은 매체를 새로 고침 합니다.
   3. 셀 도달 합류, 후 혈 청-보충 매체를 제거 하 고 신선한 혈 청 무료 매체와 두 번 세척. 긁 적 전에 24 h에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 셀을 계속.
      참고: Mv1Lu 또는 HaCaT 세포 하지 않아도 특별 한 기판 요구 사항; 그러나, 셀 라인 세럼 무료 조건에서 저절로 분리에 취약, 사전 코팅 폴 리-L-리 신 솔루션을 사용 하 여 문화 접시 표면의 고려 되어야 한다¹⁰.
2. 단층 긁 적
   1. 메 마른 환경에서 working, 단단히 20 µ L 또는 원하는 스크래치 폭에 따라 200 µ L 살 균 micropipette 팁의 좁은 끝을 드래그 하 여 문화 단층 스크래치. 팁 유지 간격 동질성을 극대화 하기 위해 문화 표면에 수직.
      1. 명확 하 게 셀 단층을 모니터링 하는 어두운 표면 문화 접시를 놓습니다. 필요한 경우 각 잘 4 마이그레이션 분야까지 공부에 두 수직 흠집 (십자가 모양)을 수행 합니다.
   2. 부드럽게 문화 매체와 부드럽게 추가 신선한 혈 청 무료 매체를 제거 하 여 분리 된 세포를 씻어. 두 번, 반복 또는 가장 첨부 되지 않은 세포 제거 되었습니다 때까지.
3. 실험 절차 및 데이터 수집
   1. 잘 사용 하 여 각 CCD 카메라를 통합 하는 반전된 단계 대조 현미경에서 스크래치 간격을 중심으로 최대 4 전처리 참조 이미지를 가져가 라. 스크래치의 인접 한 교차점으로 현미경 필드의 가장자리를 정렬 하 여 관심 영역을 선택 합니다.
      참고: 일반적으로, 이미지는 인수 10 배 확대와 1280 x 1024 픽셀 이미지 크기를 사용 하 여. 쉽게 지역화 및 잘 당 최대 4 측정의 유효성 검사에 대 한 도움이 됩니다 위에서 설명한 대로 관심 영역을 선택 합니다.
   2. 일단 모든 이미지는 인수 지정 치료 우물; 선택 된 치료 포함 된 신선한 매체와 우물에서 매체를 교환 합니다.
      참고: 또는, 화학 제품, 문화 매체 동질성을 방해 하지 않는 화합물에 대 한 치료 수 수 주사 문화 매체에 직접.
   3. 관측 범위 90% 스크래치 간격 폐쇄 조건까지 긁힌된 플레이트 (37 ° C 5% CO₂를 포함 하는 제어 분위기)를 품 어. 완전 폐쇄를 하지 마십시오.
      참고: 총 간격 폐쇄 무효화 치료 후 사진 모음 참조 영역 감지 되지 않습니다 하 고 갭 닫는 시간 참조를 설정할 수 없습니다. Mv1Lu 또는 HaCaT 세포의 경우 16-19 h 90% 합류에 도달 해야 합니다.
   4. 셀; 수정 하 여 셀 마이그레이션 중지 부드럽게 실험적인 문화 매체 1 mL PBS에 4% 포 르 말린의 대체. 실시간에서 15 분 동안 품 어
   5. 초과 말린;를 제거 하는 세포를 씻어 부드럽게 신선한 PBS 우물에 솔루션 대체. 두 번 이상 반복 합니다.
      참고:이 단계에서 씰링, 후 접시 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 무기한.
   6. 긁 적 후 캡처한 원본 참조 영역에서 각의 후 처리 참조 이미지를 가져가 라. 사용 하 여 동일한 장비 (거꾸로 광학 단계 대조 현미경 통합 CCD 카메라)와 일치 그림 설정 (확대 및 디지털 해상도/밀도).
      참고: 개별적으로 마이그레이션 하 고 일관 된 정면 (예를 들어, MDA-MB-231 유방암 인간의 세포)의 형성에 관계 없이 공백을 채울 셀에 대 한 시간 코스 이미지는 개별 셀 마이그레이션 속도의 계산을 수 있습니다.
4. 이미지 분석 및 마이그레이션의 정량화
   1. 이미지 프로세싱 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ)를 사용 하 여 스크래치 간격 한계를 정의 하 고 치료 전 사진에 최대 4 개의 측정 간격 표면 결정. "표면 전처리 격차"로 데이터 기록 (PREGAP). 치료 후 사진에 대 한 동일한 절차를 반복 합니다. "후 처리 간격 표면"으로 데이터를 기록 (POSTGAP).
      1. ImageJ를 사용 하 여 기록 된 이미지를 엽니다. "이미지" 메뉴에서 이미지 형식 8 비트 설정. "프로세스" 메뉴에서 "필터" 메뉴에가 고 "분산" 필터링 적용.
      2. "이미지" 메뉴에서 "조정" 하위 메뉴 및 설정된 임계값 흑인과 백인을 입력 (B & W), "어두운 배경"을 선택 하지 않은 있는지 확인 하십시오. "프로세스" 메뉴에서 "바이너리" 하위 메뉴에가 고 "구멍 채우기"를 선택 합니다.
      3. "분석" 메뉴에서 "측정 설정"을 선택 하 고 "지역"를 활성화 합니다. 다음 따라서 격차를 구분 마이그레이션 가장자리 윤곽을 따라 측정 영역을 그립니다.
      4. "분석" 메뉴에서 "입자 분석"을 선택 하 고 그려진된 영역 표면에 대 한 "전체 영역" 값을 기록 합니다.
   2. PREGAP 및 POSTGAP 총 면적 값 간격 표면 측정의 차이 개별 샘플의 각 집합에 대 한 절대 마이그레이션 척도를 스프레드시트에 소개: PREGAP − POSTGAP [임의 단위]. 또한, 각 조건 제어 샘플의 절대 마이그레이션 데이터를 정상화: (샘플 / 제어) * 100 [%].
      참고: 셀을 개별적으로 마이그레이션할 일관 된 정면, (예를 들어, MDA-MB-231 유방암 인간의 세포)의 형성에 관계 없이 공백을 채울, 절대 마이그레이션 산출 될 수 있다 계산 셀 중앙에 침입 하 여 스트립에 컨트롤 또는 치료 샘플입니다.
   3. ( 그림 1참조) 부 량 출력을 플롯 합니다. 필요한 경우 통계 분석을 수행 합니다.

비교 하는 두 가지 조건 또는 더 많은 수의 조건에 대 한 분산 분석 테스트 스튜던트 t-검정을 고려 하십시오.

2. 인공 마이그레이션 지형 연구에 대 한 전면 분석 결과

1. 세포 단층 준비
   1. 무 균 조건에서 작업 플레이트의 표면이 완전히 덮여 때까지 빈 문화 접시에 소독된 라운드 coverslips의 1 개의 층을 놓습니다.
      참고: 12와 33 coverslips까지에 맞게 5 cm, 10 cm 직경 접시, 각각.
   2. 문화 접시에 2 ~ 3 일 후 100% 합류를 허용 하는 농도에서 세포의 적절 한 볼륨을 씨앗 부드럽게. 아니 coverslip 겹치는 인접 coverslips 다는 것을 확인 하 고 살 균 micropipette 팁 부드러운 압력을 적용 하 여 부동에서 coverslips를 방지 합니다. 모든 24-48 h 매체를 새로 고칩니다.
      참고: 모든 셀 라인 셀 농도 전체 confluency를 도달 하는 데 필요한 타이밍을 결정 하기 위해 철저 하 게 분석 될 해야 합니다. 일반적으로 Mv1Lu 또는 HaCaT 세포에 대 한 2-3 x 10⁶ 또는 2.5-4 x 10⁶ 세포/10 cm 직경 접시, 각각은 시드. 작은 접시에 대 한 셀 숫자 축소 되어야 합니다.
   3. 셀 도달 합류, 후 혈 청-보충 매체를 제거 하 고 신선한 혈 청 무료 매체를 바꿉니다. 인위적인 상처를 수행 하기 전에 셀 24 h에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 계속.
      참고: Mv1Lu 또는 HaCaT 세포 하지 않아도 특별 한 기판 요구 사항; 그러나, 셀 라인 세럼 무료 조건에서 저절로 분리의 취약, 사전 코팅 폴 리-L-리 신 솔루션을 사용 하 여 문화 표면의 고려 되어야 한다¹⁰.
2. 단층 부상
   1. 깨끗 한 10 cm 접시 신선한 혈 청 무료 매체를 포함 하는 coverslip 이동 조심 스럽게 멸 균 핀셋을 사용 하 여. 핀셋으로 주변에는 coverslip를 눌러는 단층을 손상 하지 마십시오. Coverslip 파손에서 발생할 수 있는 과도 한 압력을 피하십시오.
   2. coverslips의 중심에 가로 라인에 소독된 면도날을 끌어 인공 상처를 만듭니다. 뒤로-및-앞뒤, 완전히 중앙 단층 스트립을 제거 하려면 3-4 m m를 끕니다. 아무 셀 파편 계속 부상된 가장자리에 연결 되어 있는지 확인 합니다.
      참고: 12 m m 직경에 coverslip, 라운드 절 개에서 이루어집니다는 중반에 coverslip의. 셀의 충분히 큰 메인 전면 반대 (적어도 2 m m 폭)의 다음 단계에 coverslip 기울이기 피하기 위해 행진을 두고 있는지 확인 합니다.
   3. 깨끗 한 6 잘 플레이트 포함 최소 2 mL 신선한 혈 청 자유로운 매체를, 직면 하는 세포와 부상된 coverslips를 전송 합니다. 최대 4 부 coverslips/잘 맞습니다.
   4. 부드럽게 씻어 두 번 사용 하 여 신선한 혈 청 자유로운 매체 분리 된 세포를 제거 하.
3. 실험 절차 및 샘플링
   1. 부드럽게 선택한 치료 포함 된 신선한 매체와 우물에서 매체를 교환 합니다.
      참고: 또는, 화학 제품, 문화 매체 동질성을 방해 하지 않는 화합물에 대 한 치료 수 수 주사 문화 매체에 직접. 어떤 잠재적인 세포 분리를 피하기 위해 주의 함께 진행 합니다.
   2. 원하는 실험 타이밍에 대 한 (37 ° C, 5% CO₂) 셀 인큐베이터 안에 접시를 유지.
   3. 셀; 수정 하 여 셀 마이그레이션 중지 부드럽게 실험적인 문화 매체 1 mL PBS에 4% 포 르 말린의 대체. 실시간에서 15 분 동안 품 어
      참고: 시간 과정 실험, 문화 접시에서 샘플을 제거 하 고 다른, 지속적인 실험 조건에 영향을 주는 포 르 말린 가스를 피하기 위해 별도 접시에 그들을 수정.
   4. 초과 말린;를 제거 하는 세포를 씻어 부드럽게 신선한 PBS 우물에 솔루션 대체. 두 번 이상 반복 합니다.
      참고:이 단계에서 씰링, 후 접시 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 무기한.
4. 면역 형광 검사 (IF) 및 토폴로지 분석
   1. 만약 얼룩이 수행 하 고 영상으로 개별 coverslips에 설명 다른^3,,411.
      1. PBS에서 0.3% 트라이 톤 X-100 솔루션에서 coverslips를 immersing 하 여 10 분 동안 permeabilize.
      2. 다음 차단 솔루션을 사용 하 여 30 분 동안 블록: 0.3% 소 혈 청 알 부 민; 10% 태아 둔감 한 혈 청; 5% 탈지 우유; 0.3 PBS에서 % 트라이 톤 X-100 솔루션.
         참고: 우유 없이 솔루션 차단 사전에 준비 하 고 수-20 ° c.에 저장
      3. 1 차적인 항 체 우유 무료 차단 솔루션에 희석 된 촉촉한 챔버 내부 실내 온도에서 1 h에 대 한 품 어. 거꾸로 15 µ L 항 체 솔루션을 적절 한 배포에는 coverslips를 놓습니다.
         참고: 항 체 작업 희석 변수 이며 사용에서 항 체에 따라 달라 집니다. 예를 들어 토끼 6 월 안티-c 항 체는 1/100 희석이 필요합니다.
      4. PBS에는 0.1% 트라이 톤 X-100 솔루션에서 coverslips을 찍기로 세 번 세척.
      5. 30 분 동안 우유 무료 차단 버퍼에 희석 이차 항 체에 coverslips를 품 어.
         참고: 항 체 작업 희석 변수 이며 사용에서 항 체에 따라 달라 집니다. 예를 들어 염소-안티-토끼 (488) 최적 해상도 대 한 1/400 희석을 요구 한다. Phalloidin, Hoechst 33258 등 다른 표기 시 약이이 단계에서 인큐베이션 버퍼에 추가할 수 있습니다.
      6. PBS에서 0.1% 트라이 톤 X-100 솔루션에서 coverslips을 찍기로 세 번 세척.
      7. Coverslips는 10 µ L 장착 미디어 드롭 (예, Vectashield)는 현미경 슬라이드에 배치에 거꾸로 탑재 합니다. 장착 매체 강화 위해 하룻밤 실 온에서 어둠 속에서 슬라이드를 둡니다. 나중에, 어둠 속에서 4 ° C에서 무기한 저장 합니다.
   2. Epifluorescence 또는 마이그레이션 앞쪽 가장자리에서 발생 하는 구조 변경의 confocal 현미경 이미지를 얻을.
      참고: 토폴로지 연구 기와 내부 단층 마이그레이션 앞에서 사진을 하 여 수행할 수 있습니다. 반 양적 연구는 로컬 형광 강렬에 소프트웨어를 기반으로 분석 하 여 가능 합니다.

Results

양적 연구에 대 한 인공 상처 스크래치 분석 결과: 마이그레이션의 표 피 성장 인자 (EGF) 승진 평가:

EGF는 상피 세포 확산 및 마이그레이션, 그리고 이렇게 측정 마이그레이션 프로 모션에 대 한 긍정적인 통제의 유명한 유도. Mv1Lu 및 HaCaT 세포 monolayers 상처 스크래치 분석 실험에서 사용 되었다 고 치료 전 사진을 입수 했다. 10 ng/mL EGF와 함께 접종 후 셀 고정 및 치료 후 사진 전에 19 h incubated 했다. 확산은 혈 청 기아 상태를 유지 하 여 최소한으로 유지 되었다. 그림의 전처리 및 후 처리 집합 ImageJ를 사용 하 여 분석 했다 그리고 중앙 간격 영역 결정 했다. 실험은 중복 등록 하는 각 음에 대 한 4 개의 측정에서에서 실행 되었다. 절대적인 이동의 정량화 표면의 차이로 계산 했다: (PREGAP − PO...

Discussion

피부 또는 점 막 파열, 수많은 종류의 세포, 섬유 아 세포 또는 상피와 면역 세포를 포함 하 여 행동에 의해 장벽 기능 복원 됩니다. 이 세포는 복잡 한을 받아야 하는 conjointly, apoptosis, 확산, 차별화, 그리고 중요 한 것은, 섬유 관련 된 프로세스 및 상피 세포 궁극적인 메커니즘 방해 조직의 복원에 대 한 책임은 마이그레이션 및 표면 상피 간격^1,12 따라서, 세포 이동 공부 폐쇄 정확 하 게 또한 상처에 대 한 치료의 modulatory 잠재력을 결정 하면서 상피 세포의 생리 적인 동작을 설명 하는 데 도움이 치유.

생리 적인 조건², 근처에이 복잡 한 과정의 복제 및 따라서 일부 병 적인 조건 평가 또는 제약의 효과 대 한 수 있습니다 다른 연구 동물 모델에서 인위적인 상처를 수행 처리

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
둘베코' s Modified Eagle Medium (DMEM)	Biowest, Nuaillé, France	L0102-500	옵션 10% FBS 보충제
Eagles' s 최소 필수 매체 (EMEM)	Lonza	BE12 -662F	선택적 10 % FBS 보충제
L-글루타민	Lonza	BE17-605E	2 mM
소 태아 혈청 (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA	DE17603A
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T4049	적절하게 희석
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)	Gibco by Life	Technologies 14200-067	1x
24-well 배양 플레이트	BD FALCON//SARSTED	734-0020
6-well culture plates	SARSTEDT	83-3920
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	E9644	중고 10 ng/mL
원형 커버 유리	MENZEL-GLÄ SER	MENZCB00120RA020	SHORT DEPTH OF FIELD
강화 면도날 No. 743	Martor (VWR을 통해)	MARO743.50
200 µ l 멸균 에어로졸 피펫 팁	VWR	732-0541
20 µ l 멸균 에어로졸 피펫 팁	VWR	732-0528
디지털 카메라 결합 위상차 현미경	Motic Spain	Moticam 카메라 2300 3.0 M 픽셀 USB 2.0; Motic Optic AE31
컨포칼 현미경	ZEISS Microimaging, 독일	LSM 510 META
10 cm 배양 접시	BD FALCON	353003
토끼 다클론 안티 c-Jun 항체	Santa Cruz Biotechnology	sc-1694	중고 1:100
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat) AF 488	Invitrogen	A11008	중고 1:400
Hoechst-33258	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	14530	중고 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)	Invitrogen	A12381	중고 1:100
소 혈청 알부민	Santa Cruz Biotechnology	SC-2323
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T9284
탈지 우유	BD DIFCO	232100
ImageJ	National Institutes of Health, 미국	릴리스 1.50i
Zen LSM 510 이미지 처리 소프트웨어	ZEISS Microimaging, 독일	릴리스 5.0 SP 1.1