현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

Summary

이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.

Abstract

셀 이동은 상처 치유에 대 한 의무적 측면 이다. 인공 생성 상처 연구 동물 모델에 비용과 복잡 한 실험 절차에 자주 결과 정밀도에서 잠재적으로 부족 한 동안. 상피 세포의 생체 외에서 문화는 상처 치유와이 세포에 치료의 영향에 셀 철새 행동 연구를 위한 적합 한 플랫폼을 제공 합니다. 상피 세포의 생리는 종종 비 합칠 조건;에서 공부 그러나,이 방법은 자연 상처 치유 조건 닮은 하지 않을 수 있습니다. 기계적 방법으로 상피 무결성을 방해 현실적인 모델을 생성 하지만 분자 기술 응용 프로그램을 방해 수 있습니다. 따라서, 현미경 기반 기술을 상피 세포 이동 공부에 대 한 최적의 생체 외에서. 여기 우리는 두 가지 구체적인 방법, 인공 상처 스크래치 분석 결과 및 인공 마이그레이션 전면 분석 결과, 상피 세포의 이동 성능에 각각, 양적 및 질적 데이터를 얻을 수 있는 선발.

Introduction

셀 이동은 상피 갭의 최종 폐쇄와 방해 표면¹의 복원에 대 한 책임은 상처 치유, 필요 합니다. 생리 적인 조건²근처에이 복잡 한 과정의 복제 동물 모델에서 인위적인 상처를 수행 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 종종 비용과 복잡 한 실험 절차, 잠재적으로 상처 치유 과정의 복잡 한 특성으로 인해 개별 프로세스의 연구에 대 한 정밀 부족 발생 합니다.

상피 세포의 생체 외에서 문화는 역할이이 세포에 상처 치유와 셀 철새 행동 치료의 효과 연구를 위한 동물 모델에 대 한 유용한 대안을 제공 합니다. 상피 세포의 생리는 종종 비 합칠 문화^3,4,,56;를 사용 하 여 분자 기술로 공부 그러나, 상피 무결성 중단 일반적으로 정밀한 기계 절 개 함으로써 이루어집니다. 세포 배양에서이 셀의 무시할 수 상처 격차에 노출 될 수 있습니다 그리고 그들은 분자 생물학 기술에 대 한 너무 작은 샘플을 나타내는 의미 합니다. 그러나,....

Protocol

1. 인공 상처 스크래치 분석 결과 양적 연구

1. 세포 단층 준비
   1. 무 균 조건 하에서 작업, 씨 그리고 혈 청-보충 매체를 사용 하 여 문화 플라스 크에 Mv1Lu 또는 HaCaT 상피 세포 성장. 한 번 모든 24-48 h 매체를 새로 고침 합니다. 셀 도달 80% 합류, 후는 적절 한 방법, 즉, trypsinization⁹를 사용 하 여 셀을 분리 합니다.
      참고: Mv1Lu 및 EMEM 및 DEMEM 문화 매체를 사용 하 여 상피 세포를 교양 HaCaT 각각 2 m L-글루타민, 보완 및 5% CO₂의 제어 분위기 37 ° C에서 알을 품. 모든 셀 라인 셀 농도 전체 confluency를 도달 하는 데 필요한 타이밍을 결정 하기 위해 철저 하 게 분석 해야 합니다. 일반적으로 Mv1Lu 또는 HaCaT 세포에 대 한 2-4 x 10⁴ 또는 4-6 x 10⁴ 셀/글쎄, 각각은 시드 175 cm² 문화 플라스 크에 고 합류 하 80%에서 최대 35 x 10⁶ Mv1Lu 또는 1 x 10⁷ HaCaT 세포 생성 합니다.
   2. 1....

Results

양적 연구에 대 한 인공 상처 스크래치 분석 결과: 마이그레이션의 표 피 성장 인자 (EGF) 승진 평가:

EGF는 상피 세포 확산 및 마이그레이션, 그리고 이렇게 측정 마이그레이션 프로 모션에 대 한 긍정적인 통제의 유명한 유도. Mv1Lu 및 HaCaT 세포 monolayers 상처 스크래치 분석 실험에서 사용 되었다 고 치료 전 사진을 입수 했다. 10 ng/mL EGF와 함께 접종 후 셀 고정 및 치료 후 사진 전에 19 h incubated 했다. 확산은 혈 청 기아 상태를 유지 하 여 최소한으로 유지 되었다. 그림의 전처리 및 후 처리 집합 ImageJ를 사용 하 여 분석 했다 그리고 중앙 간격 영역 결정 했다. 실험은 중복 등록 하는 각 음에 대 한 4 개의 측정에서에서 실행 되었다. 절대적인 이동의 정량화 표면의 차이로 계산 했다: (PREGAP − PO.......

Discussion

피부 또는 점 막 파열, 수많은 종류의 세포, 섬유 아 세포 또는 상피와 면역 세포를 포함 하 여 행동에 의해 장벽 기능 복원 됩니다. 이 세포는 복잡 한을 받아야 하는 conjointly, apoptosis, 확산, 차별화, 그리고 중요 한 것은, 섬유 관련 된 프로세스 및 상피 세포 궁극적인 메커니즘 방해 조직의 복원에 대 한 책임은 마이그레이션 및 표면 상피 간격^1,12 따라서, 세포 이동 공부 폐쇄 정확 하 게 또한 상처에 대 한 치료의 modulatory 잠재력을 결정 하면서 상피 세포의 생리 적인 동작을 설명 하는 데 도움이 치유.

생리 적인 조건², 근처에이 복잡 한 과정의 복제 및 따라서 일부 병 적인 조건 평가 또는 제약의 효과 대 한 수 있습니다 다른 연구 동물 모델에서 인위적인 상처를 수행 처리

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
둘베코' s Modified Eagle Medium (DMEM)	Biowest, Nuaillé, France	L0102-500	옵션 10% FBS 보충제
Eagles' s 최소 필수 매체 (EMEM)	Lonza	BE12 -662F	선택적 10 % FBS 보충제
L-글루타민	Lonza	BE17-605E	2 mM
소 태아 혈청 (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA	DE17603A
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T4049	적절하게 희석
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)	Gibco by Life	Technologies 14200-067	1x
24-well 배양 플레이트	BD FALCON//SARSTED	734-0020
6-well culture plates	SARSTEDT	83-3920
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	E9644	중고 10 ng/mL
원형 커버 유리	MENZEL-GLÄ SER	MENZCB00120RA020	SHORT DEPTH OF FIELD
강화 면도날 No. 743	Martor (VWR을 통해)	MARO743.50
200 µ l 멸균 에어로졸 피펫 팁	VWR	732-0541
20 µ l 멸균 에어로졸 피펫 팁	VWR	732-0528
디지털 카메라 결합 위상차 현미경	Motic Spain	Moticam 카메라 2300 3.0 M 픽셀 USB 2.0; Motic Optic AE31
컨포칼 현미경	ZEISS Microimaging, 독일	LSM 510 META
10 cm 배양 접시	BD FALCON	353003
토끼 다클론 안티 c-Jun 항체	Santa Cruz Biotechnology	sc-1694	중고 1:100
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat) AF 488	Invitrogen	A11008	중고 1:400
Hoechst-33258	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	14530	중고 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)	Invitrogen	A12381	중고 1:100
소 혈청 알부민	Santa Cruz Biotechnology	SC-2323
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T9284
탈지 우유	BD DIFCO	232100
ImageJ	National Institutes of Health, 미국	릴리스 1.50i
Zen LSM 510 이미지 처리 소프트웨어	ZEISS Microimaging, 독일	릴리스 5.0 SP 1.1