제작 절차 및 복굴절 측정 자석으로 응답 란타넘족 이온 킬레이트 화 인지질 어셈블리 설계에 대 한

Stéphane Isabettini; Mirjam E. Baumgartner; Peter Fischer; Erich J. Windhab; Marianne Liebi; Simon Kuster

doi:10.3791/56812

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방법 논문

제작 절차 및 복굴절 측정 자석으로 응답 란타넘족 이온 킬레이트 화 인지질 어셈블리 설계에 대 한

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DOI:

10.3791/56812

⸱

2018년 1월 3일

Stéphane Isabettini¹ , Mirjam E. Baumgartner¹ , Peter Fischer¹ , Erich J. Windhab¹ , Marianne Liebi² , Simon Kuster¹

¹Laboratory of Food Process Engineering, ETH Zurich, ²MAX IV Laboratory, Lund University

이 논문에서

요약

자석으로 높은 반응 란타넘족 이온 킬레이트 화 polymolecular 어셈블리에 대 한 제작 절차 되 게 됩니다. 마그네틱 응답 nanopore 세포 막을 통해 밀어 남에 의해 맞게 어셈블리 크기에 의해 결정 됩니다. 어셈블리의 마그네틱 alignability 및 구조적인 변화 온도 유도 된 복굴절 측정, 핵 자기 공명 및 작은 각 중성자 뿌리기 무료 기법에 의해 감시 된다.

초록

Bicelles는 조정 디스크 같은 polymolecular 어셈블리 지질 혼합물의 큰 다양성에서 형성. 응용 프로그램 범위에서 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 막 단백질 구조 연구 nanotechnological 개발 광학 활성 및 자석으로 전환 젤의 형성을 포함 하 여. 이러한 기술 어셈블리 크기, 자석 응답 및 열저항의 높은 관리가 필요합니다. 1, 2의 혼합물-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)와 인지질 공액, 1, 2를 킬레이트 화는 란타넘족 이온 (Ln^{3 +})-dimyristoyl-sn-glycero-3-인-방법-신 triaminepentaacetate ( DMPE-DTPA), DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} 같은 높은 자석으로 응답 어셈블리에 조립 (어 금 니 비율 4:1:1) bicelles. 콜레스테롤 (철-오)과 독특한 physico-화학 특성을 제공 하는 어셈블리의 다른 세트에서 bilayer 결과에 스테로이드 파생 상품의 소개. 주어진된 지질 구성에 대 한 자석 alignability bicelle 크기에 비례 이다. Ln^{3 +} 의 complexation 크기 및 정렬 방향 측면에서 전례 없는 자석 응답에 있는 결과. 난방 시 소포에 디스크와 같은 구조의 온도 가역 붕괴 정의 된 기 공 크기와 멤브레인 필터를 통해 압출 하 여 어셈블리의 치수의 조정 수 있습니다. 자석으로 alignable bicelles 기 선구자에 의해 정의 하는 어셈블리 차원에서 발생 하는 5 ° C에 냉각 하 여 다시 생성 됩니다. 여기, 그리고 어셈블리의 자석 alignability 5.5 T 자기장에서 복굴절 측정 하 여 정량이 제작 절차 설명 했다. 인지질 bilayer에서 발생 한 복굴절 신호는 더는 bilayer에서 발생 하는 polymolecular 변경 모니터링 수 있습니다. 이 간단한 기술은 이다 bicelles 하 고용 일반적으로 NMR 실험을 보완.

서론

Bicelles는 수많은 지질 혼합물에서 얻은 디스크 모양의 polymolecular 어셈블리. ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ 그들은 널리 NMR 분광학에 의해 생체 막의 구조 특성에 대 한 사용 됩니다. ⁶ ^, ^{그러나 7} , 최근 노력 하고자 가능한 응용 프로그램의 필드를 확장 합니다. ⁵ ^, ⁸ ^, ⁹ 가장 공부 bicelle 시스템은 1, 2의 혼합물의 구성 되어-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), 구성 어셈블리 및 1, 2의 평면 부분-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DHPC) 가장자리를 포함 하는 인지질. ¹ ^, ² ^, ³ 인지질 bilayer 지시 자체 조립된 polymolecular 구조의 건축 구성의 분자 기하학. ⁴ ^, ⁵ DMPE-DTPA와 교체 DHPC 높은 자석으로 대답 하 고 조정할 수 있는 bicelle 시스템을 생성합니다. ¹⁰ ^, ¹¹ DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (어 금 니 비율 4:1:1) bicelles 연관 많은 더 많은 상자성 란타넘족 이온 (Ln^{3 +}) 향상 된 자기 반응의 결과로 하는 bilayer의 표면에. ¹⁰ 또한, 교체 수용 DHPC 분자 DMPE-DTPA/Ln^{3 +} 수 희석 방지 bicelles의 형성 ¹¹

평면 polymolecular 어셈블리의 자석 alignability는 그들의 전반적인 자기 에너지에 의해 결정

figure-introduction-1 (1)

B는 자기 필드 강도 figure-introduction-2 자석 상수, n 집계 수와 figure-introduction-3 는 bilayer를 구성 하는 지질 분자 diamagnetic 자화 율 이방성. 따라서, 자기장에 DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles의 응답은 그들의 크기 (집계 숫자 n)와 분자 diamagnetic 자화 율 이방성 Δχ에 의해 지어진 다. 후자는 쉽게 달성 chelated Ln^{3 +}의 특성을 변경 하 여. ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ 소개 콜레스테롤 (철-오) 또는 다른 스테로이드 유도체는 bilayer에 집계 숫자 n와 어셈블리의 자기 자화 율 Δχ 튜닝의 가능성을 제공 합니다. ¹¹ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ 주어진된 지질 구성에 대 한 큰 어셈블리 포함 더 많은 지질 E_{탄 창} (큰 집계 숫자 n)에 기여 가능 결과 더 alignable 종에. DMPC/DHPC bicelles의 크기 예를 들면, 전통적으로 구성 지질 비율이 나 총 농도의 최적화를 통해 제어 됩니다. ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² 이 DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles에, 있지만 난방 제공 시 소포를 bicelle에서 그들의 열 가역 변환을 짓는 옵션 추가. 기계와 같은 멤브레인 필터를 통해 압출 수는 vesicles의 형성을 의미 합니다. 자석으로 alignable bicelles는 5 ° C에 냉각 시 재생성 하 고 그들의 크기 기 선구자에서 결정 됩니다. ¹¹ 여기, 우리가에 초점을 가진 DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} 기계 제조 절차의 잠재력 (어 금 니 비율 4:1:1) 또는 DMPC/철-오/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 16:4:5:5) 참조 시스템으로. 프로세스 작업 다른 Ln^{3 +} 보다 Tm^{3 +}비슷하게 작동 합니다. 이러한 기술에서 제공 하는 가능성의 넓은 범위는 그림 1 에서 강조 표시 하 고 광범위 하 게 다른 논의. ²³

figure-introduction-4
그림 1: 가능한 제작 절차의 개요 개요. 공부 자석으로 alignable Ln^{3 +} chelating polymolecular 어셈블리는 구성 중 DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 4:1:1) 또는 DMPC/철-오/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 16:4:5:5). 건조 지질 영화 7.4의 pH 값에 50 m m 인산 염 버퍼 화 이며 총 지질 농도 15 m m. 지질 영화의 효과적인 수 분 요구도 녹고 사이클 (피트) 또는 열 및 냉각 사이클을 동결 (H & C). H & C 사이클 마지막 동결 단계, 녹고 후 샘플을 다시 생성 하거나 압출 추가 없이 사용할 수 있다면 그들은 시간의 연장된 기간 동안 냉동 보관 하는 샘플을 다시 생성에 필요 하다. 이 단계는 Isabettini 외에 의해 광범위 하 게 논의 된다. ²³ 극대 alignable polymolecular 어셈블리 지질 구성에 따라 서로 다른 어셈블리 아키텍처를 제공 하는, 달성 된다. Bicelle 크기와 자석 alignability nanopore 멤브레인 필터를 통해 압출 (Ext)에 의해 가변 이다. 제시 정렬 요소 A_f 800, 400, 200, 또는 100 통해 압출 DMPC/철-오/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 16:4:5:5) 샘플의 2D 작은 각 중성자 산란 (SANS) 패턴에서 계산 된 숨 구멍 nm. 측정 없이 더 자세히 여기에 적용 되지 것입니다 bicelle 정렬 측정의 보완 수단입니다. ¹¹ ^, ¹⁶ 는 A_f 등방성 산란에 대 한 0-1 (병렬 중성자 산란 또는 자기장 방향 bicelles의 수직 정렬)에서 배열 한다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Bicelles의 구조는 다양 한 특성화 기법에 의해 광범위 하 게 연구 되었습니다. ¹³ 자기 필드에 노출 하는 bicelles의 맞춤 NMR 분광학 또는 작은 각 중성자 산란 (SANS) 실험을 사용 하 여 측정할 되었습니다. ⁵ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁴ ^, ^{그러나 25} , 변화와 존재 Ln^{3 +} 발생 NMR 봉우리의 확대는 메서드에 심각한 한계. ¹⁵ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ 있지만 SAN 실험이이 제한, 대체에서 고통을 하지 않습니다 그리고 더 접근 기술 솔루션에서 어셈블리의 자석으로 유도 맞춤의 일상적인 정량화에 대 한 바람직한. 복굴절 측정 실용적이 고 비교적 간단한 대안입니다. 비슷하게 NMR 실험, 복굴절 측정 지질 재배열 및 지질 단계는 bilayer에 발생에 대 한 귀중 한 정보를 공개. 또한, 온도 같은 환경 조건 변경 polymolecular 어셈블리에서 발생 하는 기하학적 변환 모니터링 된다. ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ 자기 유도 복굴절 Δn′ 인지질 시스템의 다양 한 유형을 공부에 사용 되었습니다. ¹³ ^, ²⁹ ^, ³⁰ 는 자기장에서 위상 변조 기술에 따라 복굴절 측정 bicelles의 방향을 감지 하는 가능한 방법입니다. ¹² ^, ¹⁶ ^, ¹⁸ ^, ²⁹ ^, ³¹ ^, ³² 35 T까지 높은 자기장에서 복굴절와 함께 bicelles를 조사 하는의 가능성 또한 M. Liebi 그 외 여러분 에 의해 입증 되었다 ¹³

편광 이방성 물자 들어가면 일반 및 특별 한 파에서 굴절 됩니다. ¹¹ 두 파 다른 속도 있고 지체 δ에 의해 단계에서 이동 된다. 지체 δ의 정도 측정 하 고 복굴절 신호로 변환 figure-introduction-5 는 소재를 사용 하 여 이방성의 정도 계량 하기

figure-introduction-6 (2)

여기서 λ는 레이저와 d의 파장은 샘플의 두께입니다. 인지질은 광학 이방성 그리고 탄화수소 꼬리에 평행 하 게 그들의 긴 분자 축과 일치 하는 그들의 광 축. ¹¹ ^, ¹² 는 인지질은 임의로 솔루션에서 지향 하는 경우 지체 없이 측정 됩니다. 지체는 인지질 서로 평행 정렬 됩니다 때 측정 된다. 자석으로 유도 복굴절 figure-introduction-7 ; 자기장에서 분자의 방향에 따라 양수 또는 음수 부호를 가질 수 있습니다 그림 2를 참조 하십시오. X 축에 평행 정렬 인지질 네거티브 귀 착될 것 이다 figure-introduction-8 z 축을 따라 정렬 된 결과 긍정적인 그러나, figure-introduction-9 . 아니 복굴절 때 광 축과 일치 빛 전파의 방향으로는 인지질 y 축에 평행 하 게 정렬 관찰 됩니다.

figure-introduction-10
그림 2: 맞춤 인지질 및 자기 유도 복굴절의 해당 표시의 figure-introduction-11 . 측정된의 figure-introduction-12 는 자기장에서 인지질의 방향에 따라 달라 집니다. 파선 분자의 광 축을 나타냅니다. 빛은 45 °에서 편광 하 고 y 방향으로 전파. 자기장 B z 방향에서입니다. 이 그림은 M. Liebi에서 수정 되었습니다. ¹¹ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Bicelles의 등방성 콜 로이드 정지, 경우는 bilayer에 인지질의 배열에 의해 유도 된 방향 지체 δ 비우기 손실 될 것입니다. Bicelles는 또한 편광된 빛의 지체 δ를 일으키는 그들의 bilayers에 광학 활성 인지질을 찾으시는 순서 정렬 해야 합니다. 따라서, 복굴절 polymolecular 어셈블리의 자석 alignability 계량 하는 중요 한 도구입니다. Bicelles 정렬 자기장에 수직 긍정적인 보장할 figure-introduction-13 병렬 정렬 그 부정적인 항복 것입니다 하는 동안, figure-introduction-14 . 서명 설정의 정렬에 따라 달라 집니다 그리고 참조 샘플을 확인할 수 있습니다.

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프로토콜

1. DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} 제작 절차 (어 금 니 비율 4:1:1) 및 어셈블리 DMPC/철-오/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 16:4:5:5) polymolecular

사전 준비
1. 에탄올으로 워시 홍 조에 의해 모든 유리 한번는 클로 프롬을 안정화 (> 99% 클로 프롬) 압축 공기 건조.
2. 2 가지 10 mg/mL 재고 솔루션 DMPC와 DMPE-DTPA의 에탄올 안정 클로 프롬에 생산 (> 99% 클로 프롬), 에탄올 안정 클로 프롬에 철 오의 10 m m 재고 솔루션 (> 99% 클로 프롬)와 TmCl₃ 10 m m 재고 솔루션 메탄올입니다.
3. 나트륨 디 인산이 수화물의 0.121 g 및 무수 디 나트륨의 0.599 g 초순 H₂o.의 100 mL에 수소 인산 염을 혼합 하 여 7.4의 pH 값에 50 m m 인산 염 버퍼를 준비
건조 지질 필름의 준비
1. 2.5 mL 유리 주사기 amphiphiles (DMPC, DMPE-DTPA, 그리고 선택적으로 철 오)와 Ln^{3 +} 재고 솔루션의 필요한 금액을 별도 3 mL 유리 스냅-컵에 무게.
  1. DMPC/DMPE-DTPA의 3 mL 샘플 볼륨에 대 한 / Tm3 + (어 금 니 비율 4:1:1, 총 지질 농도 15 m m), 3.6435 g DMPC 재고 솔루션, DMPE-DTPA 재고 솔루션 및 TmCl₃ 재고 솔루션의 0.7126 g 1.4731 g의 무게.
  2. DMPC/철-오/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 16:4:5:5, 15 밀리미터의 총 지질 농도) 3 mL 샘플 볼륨, DMPC 재고 솔루션의 2.9148 g, DMPE-DTPA 재고 솔루션의 1.4731 g, 철 오 재고 솔루션의 1.0749 g에 0.7126 g의 무게 TmCl₃ 재고 솔루션입니다.
    주의: 클로 프롬과 메탄올은 유독 하 고 실내 온도에 휘발성. 증기 두건에서 작동 하 고 신속 하 게 대량 측정 진행.
2. 25 mL 둥근 바닥 플라스 크에 스냅 컵의 콘텐츠를 전송. 해당 용 매 약 2.5 mL와 둥근 바닥 플라스 크에 각각 스냅 컵을 플러시.
3. 40 ° c.에서 회전 증발 기에 진공에서 용 매를 제거 30 000 초기 압력 설정 Pa까지 대부분의 용 매 제거 됩니다. 100을 압력을 줄이기 위해 Pa와 드라이 2 헤의 최소 회전 아래 샘플 플라스 크의 유리 벽에 균일 한 건조 지질 영화를 얻을.
4. 공기에 있는 지질 산화를 방지 하 고 재 전에 냉동 실에 샘플을 저장 하는 아르곤의 꾸준한 스트림 아래 1 분 건조 지질 필름을 놓습니다.
건조 지질 영화의 수 화
1. 15 m m의 총 지질 농도 도달 하는 둥근 바닥 플라스 크에 인산 염 버퍼의 3 mL를 추가 합니다.
2. 그것은 철저 하 게 (끓는 액체 질소 중지), 냉동은 다음 열까지 액체 질소에 회전 아래 플라스 크를 폭락 하 여 동결 해빙 (피트) 사이클 수행을 지속적으로 술병을 소용돌이 물 욕조에 5 분에 대 한 샘플을 배치 하 여 60 ° C까지 다시 녹는 과정을 도움이 됩니다. 30 적용 때 샘플은 액체 지질 영화의 수 화를 돕기 위해 각 어 주기 전에 vortexing의 s.
  참고: 없음 지질 영화 표시 됩니다 플라스 크의 벽에 후 두 번째 고정 녹고 주기.
3. 1.3.2 총 5 회 반복 합니다. 샘플은 뜨거운 때 인산 염 버퍼의 불필요 한 증발을 피하기 위해 모자와 함께 플라스 크를 닫습니다. 프로토콜 샘플을 동결 하는 경우 일시 중지 될 수 있습니다.
4. 두 개의 열 및 냉각을 진행 (H & C) 마지막 동결 단계에서 나오는 샘플 안정 또는 최대 2 개월까지 냉동 보관 주기. DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} 40 또는 60 ° C에 샘플 열 (어 금 니 비율 4:1:1) DMPC/철-오/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 16:4:5:5), 각각, 1 ° C/분에서 5 ° C에 냉각 하기 전에 유지 샘플 최대 및 최소 5 분 또는 사이클의 온도입니다.
5. 자, 하나는 외부 자기장 (2 단계)에서 샘플의 복굴절 신호 결정 또는 추가 bicelle 크기 및 자석 alignability (1.4 단계)에 맞게 샘플을 돌출.
  참고: DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 4:1:1) 샘플은 70의 평균 유체역학 직경 D_H bicelles의 주로 구성 된다 nm 숫자 분포에 의해 공개 5 ° c.에 동적 산란 (DL) 측정에서 얻은 이러한 샘플 평균 D_H 500의 더 큰 polymolecular 어셈블리 포함 nm는 광도 분포에 의해 밝혀. DMPC/철-오/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 16:4:5:5) 샘플은 매우 의미 D_H 700을 드러내는 전형적인 강도 분포와 크기에서 polydisperse nm, 숫자 배포판 공개 인구 작은 의해 지배 하는 동안 200의 크기 범위에서 bicelles nm. 자세한 크기 분포 및이 샘플의 cryo 전송 전자 현미경 이미지 Isabettini 그 외 여러분 에 의해 보고 되었습니다. ²³
Polymolecular 어셈블리 돌출
1. 그림 3에서 보듯이 압출 기를 조립 한다. 장갑 및 족집게를 사용 하 여 처리에 대 한 실리 카 튜브를 보호. 멤브레인 필터 (6)의 최적 배치에 대 한 허용 하는 버퍼의 몇 방울과 필터 종이 (5) 젖은. 종이 위에 링 (7) 후 아무 주름은 다는 것을 확인 하십시오.
  참고: 압출 과정 100, 200, 400, 800의 기 공 직경 멤브레인 필터 (6)에 시험 되었다 nm; 그림 7을 참조 하십시오.
2. DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} 40 ° C에 물 목욕을 설정 (어 금 니 비율 4:1:1) 샘플 또는 DMPC/철-오/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 16:4:5:5) 샘플 extrudable vesicles의 형성을 보장을 위한 60 ° C.
3. 고압 PVC 튜브를 사용 하 여 가압된 질소 병에 압출 기를 연결 (> 4 MPa) serto 어댑터를 장착 하 고 막을 통해 액체 물자 돌출. 1 MPa의 압력은 200의 기 공 직경 멤브레인 필터 (6)를 통해 압출에 일반적으로 필요한 nm 이상. 1.5-2.5 MPa 100의 기 공 직경을 가진 작은 멤브레인 필터 (6)를 위해 제시해 nm.
  참고: 멤브레인 필터 변경 경우 비정상적으로 높은 압력 (> 2.5 MPa) (이것이 막힘의 첫 징후) 샘플을 돌출 하는 데 필요한.
4. (10) 커버 열고 2 mL 유리 피 펫을 사용 하 여 샘플을 삽입 합니다. 다음 커버 (10)를 닫고 샘플 콘센트 튜브 (2)를 잡고 압력 밸브 (12)를 엽니다. 압력 밸브 (12) 밀어 주기 완료 된 후, 환기 닫고 주기를 계속 합니다.
  참고: 너무 오래 손실을 방지 하기 위해 과도 한 샘플 증발에 의해 뜨거운 외피 용기 (8)와 함께 연락처에서 샘플을 떠나 지 마.

30-60 s 3 mL 샘플 (12) 압력 밸브를 열기 전에 압출 기에서 equilibrate을 위한 충분 한 시간 이다.

그림 3에서 같이 주어진된 막 공 차원에 대 한 10 압출 주기를 진행 합니다. 대부분 bicelle 시스템의 기 공 직경 100의 세포 막을 통해 200 및 또 다른 10 시간의 기 공 직경을 가진 세포 막을 통해 10 번 돌출 되어 nm, 샘플 comparability 보장.

이제, 외부 자기장 (2 단계)에서 샘플의 복굴절 신호를 확인 합니다.

figure-protocol-1
그림 3: bicelle 및 소포 준비에 사용 되는 실험실 압출 기. 압출 기를 바닥에서 조립 된다: (1) 산, (2) 샘플 수집 2.4 m m (안 직경) 플라스틱 콘센트 튜브 및 링, (3) 및 (4) 크고 작은 안정화 메쉬, (5) 필터 종이, (6) 멤브레인 필터, o-링 (7), (8) 외피 선박, 공간 (9. ) 탑 입구와 압력 연결, (10) 커버, (11) 나비 나사, (12) 압력 밸브와 함께 커버. 조립된 압출 기의 스케치는 오른쪽 손 쪽의 표시 됩니다. 질소 가스 (N₂) 압력 용기에 의해 제공 되 고 외피 선박 (9) 물 목욕 온도 제어에 연결 되어. 샘플 어떤 주어진된 멤브레인 필터 기 공 직경 (샘플 경로 파란색으로 표시)에 대 한 10 압출 사이클을 겪 습. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 복굴절 측정의 DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 4:1:1) 및 어셈블리 DMPC/철-오/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (어 금 니 비율 16:4:5:5) polymolecular.

고 그림 4에서와 같이 복굴절 설치 연결 빌드하고 각각 전자 요소에 전원을 공급 합니다. 배치 하지 마십시오 PEM, 샘플, 그리고 두 번째 편광판 레이저 경로에이 단계에서. 반사 표면, 예를 들어 알루미늄 미러 홀더, 검은 종이 취재 하 여 다시 흩어져 레이저 빛을 감지 하지 마십시오.
직류의 강도 의해 표시 되는 검출기에서 레이저 강도 극대화 하기 위해 거울을 조정 그림 4B에서낮은 패스 필터에서 얻은.
주의: 거울을 조정할 때 적절 한 눈 보호를 착용 하 고 처음으로 레이저를 조작 하는 경우는 레이저 안전 강사와 상담.
극대화 하기 위해 첫 번째 교차 선형 편광판 (유지 수직 입사 레이저 광선에) 설정에서 .

figure-protocol-4
그림 4: 복굴절 설치 및 광학 신호에 대 한 연결의 도식 대표. A) 초전도 전자석 자기장 5.5 T을 공급. 635에서 다이오드 레이저에서 빛 nm 두 교차 편광판에 의해 편광 이다. Photoelastic 변조기 PEM 90₀ 2.405 rad의 진폭으로 50 KHz에서 동작 하 고 두 명의 편광판 사이 위치. 샘플 자석 PEM과 두 번째 편광판 사이에서 놓여 있습니다. 비 편광 미러 다른 요소를 통해 빛을 가이드 하 고 마지막으로 사진 탐지기에 의해 검출 된다. 첫 번째 및 두 번째 고조파 figure-protocol-5 및 figure-protocol-6 AC 신호는 모니터링, 복굴절 신호는 Ln의^{3 +} polymolecular 어셈블리를 킬레이트 화 자석 alignability에 대 한 정보의 계산을 허용. 샘플 베트는 외부 물 목욕 온도 제어 (파란색)에 연결 된다. 온도 프로브 (빨간색)와 샘플의 온도 모니터링 합니다. B) 사진 감지기에서 신호는 ± 12 V DC 전원 공급 장치 braded 케이블 (3)을 통해 360 Hz의 컷오프 주파수와 함께 두 번째 순서 Sallen-키 낮은 패스 필터 (24 V AC 전원 공급 장치)에 먹인 다. 로우 패스 필터 추출 DC 구성 요소 figure-protocol-7 BNC 50 Ω 케이블을 통해 PC 인터페이스 (4)에 그것을 제공 합니다. 사진 감지기에서 신호 두 잠금 앰프에 전달 (는 첫 번째와 두 번째 고조파 추출 figure-protocol-8 및 figure-protocol-9 ) BNC 50 Ω 케이블 (1) & (2). 고조파 농도 단계 구분 검색에 의해 검색 됩니다. 따라서, PEM 신호 (1 층-출력의 첫 번째 잠금 앰프에 PEM과 2 층-출력, 두 번째에 연결 된 bnc 50 Ω 케이블) 잠금 앰프에 대 한 참조 신호로 사용 된다. 출력 신호는 BNC 50 Ω 케이블을 통해 PC 인터페이스 장치에 전달 됩니다. 아날로그 수집 단위 c f p-a I-110와 c f p-c B-1은 모니터링을 위한 RS 232 케이블을 통해 컴퓨터에 전송 된 신호를 디지털화. 유형 K 온도 프로브는 또한 어디 아날로그 수집 단위 c f p-c B-3와 c f p-t C-120 디지털화 신호 모니터링을 위한 RS 232 케이블을 통해 컴퓨터에 전송 하기 전에 PC 인터페이스 장치에 연결 됩니다. B. 핵심 요소에 기초 설치의 C) 그림 4에 1에서 해당 숫자 식별 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4A와 같이 입사 레이저 광선에 수직인 두 번째 교차 선형 편광판을 배치 합니다. 최소화는 는 처음에 관하여 90 ° 각도로 두 번째 편광판을 설정 하 여.
두 개의 교차 선형 편광판과 그림 4A와 같이 입사 레이저 광선에 수직인 사이 0 °에서 photoelastic 변조기 (PEM) 장소. 그림 5A와 같이 50 kHz와 진폭 A0 2.405 rad에 주파수를 PEM을 조정 합니다. 이것은 DC 성분 복굴절 및 향상 된 .
참고: PEM의 광 축 상수를 유지 하기 위해 몇도 의해 조정 될 수 있습니다 어떤 샘플을 측정 하기 전에 공기에서.
레이저 및 전자 장비는 신호를 안정화를 켠 후 1 시간까지 기다립니다.

일단 일정 하 게 유지 자동 단계적 잠금 증폭기의 신호를 안정적입니다.

10 m m의 경로 길이와 온도 제어 석 영 cuvette에 샘플을 놓고 처음 5 ° c.에 설정 하는 외부 물 목욕에 연결

직접 샘플의 온도 모니터링 하는 샘플에에서 0.5 m m 두꺼운 유형 K 열전대 (온도 프로브)를 배치 합니다. (Cuvette) 후 레이저 경로에 흰 종이 배치 하 고 조사에 의해 발생 하는 그림자를 찾고 여는 프로브 레이저 빛으로 방해 하지 않는 확인 하십시오.
참고: 2-3 ° C 물 목욕의 온도 기록 및 샘플의 온도 차이가 있다.

그림 4A와 같이 자석, 구멍에는 베트를 놓습니다. 레이저 광은 샘플을 통해 수평 전파, 비 편광 거울에 의해 반사 이며 사진 검출기에 의해 감지.
참고: 레이저는 감독 아래, 샘플을 통해와 같은 경로를 다시 패러데이 효과 (즉, 다시 밖으로 반대 방향에서 올 때 취소 추락 때 자기장에 의해 발생 하는 빛의 분극 비행기의 회전)에 대 한 계정.

실내 온도 및 10000에서 압축 공기의 꾸준한 공기 흐름을 적용의 신호 강도 줄일 수 고 소음 증가 세포 벽에 결로 방지 하는 베트에 Pa. 5 ° c.에 측정할 때 이것은 특히 중요 하다

첫 번째 및 두 번째 고조파를 감지 figure-protocol-13

및

두 잠금에 앰프와 AC 신호. 자동 그림 5B 에 표시 (2) 버튼을 눌러 잠금 증폭기 단계 고 그림 5B (1)에서 같이 감도 조정 합니다. 거기에 있지 않은 개 이상의 빨간색 막대 증폭기 신호 과부하를 피하기 위해 그림 5B (3)와 같이 다는 것을 확인 하십시오. 그림 5C (8)와 같이 프로그램 Tesla_Magnet_Const_V092 앰프 잠금에 모두에 대 한 고용된 감도 아래 note. 프로그램 부가 정보로 제공 됩니다.

그림 5C (5)와 같이 전류 자석 프로그램 Tesla_Magnet_Const_V092 를 제공 하 여 5.5 T까지 자기장에 진입로.

얻기는 복굴절

방정식 2는 지체와 함께 계산 됩니다를 사용 하 여
figure-protocol-16

(3)
어디

및

와 함께 첫 번째 종류의 베셀 함수는 figure-protocol-19

및

. ¹¹ ^, ¹³ ^, ¹⁸ ^, ³³ ^, 그림 5C (4)와 같이 ³⁴ Tesla_Magnet_Const_V092, 프로그램에 지체를 플롯 합니다.
참고: 프로그램에서 제공 하는 지체가 사용할 수 없습니다 두 잠금 앰프 같은 감도에서 작동 하지는 복굴절 신호를 계산 (단계 2.12 참조). 기록 된 고조파 농도 figure-protocol-21

및

올바른 크기를 얻으려면 잠금 증폭기의 감도 의해 곱할 필요가. 또한, 자석 필드에서 측정 복굴절 신호 0 t.에서 얻은 의미 복굴절 신호를 빼서 정규화 해야 합니다.

상수 또는 그림 4에 표시 된 베트에 연결 된 물 목욕의 온도 조절 하 여 변화 하는 온도 (1 ° C/min)에서 샘플의 복굴절 신호를 모니터링 합니다.

(9), 파일 이름을 제공 하 고 (10) "시작 로그" 버튼을 누르면 그림 5C (8), 실험 설명에서 작성 하 여 실험 데이터를 로그 합니다.

figure-protocol-23
그림 5: 고용 설정과 프로그램 화면 캡처의 그림. A) PEM 설정: 지체 2.405 rad, 파장 635 nm, 주파수 50 Hz. 화이트 원형 표시 설정을 활성화 (USR 사용자 정의 지체, LOC = = 작업의 로컬 모드). B) 앰프 설정 잠금. (1) 감도 단계 2.11에서에서 필요에 따라 각 측정 하기 전에 선택할 수 있다. 거기 해서는 안됩니다 개 이상의 빨간색 막대 신호 과부하를 피하기 위해 (3) 디스플레이에. (1) led가 빨간색 켜 측정 불가능해 과부하 발생 합니다. 모든 측정 전에 자동 단계 버튼 (2)를 누릅니다. C) Tesla_Magnet_Const_V092 보충 정보 제공 프로그램의 스크린샷. 프로그램은 자기 분야의 제어 및 신호 시간의 기능으로 출력 모든 기록 있습니다. (1) 자기 필드 힘과 샘플 온도 그려집니다. 첫 번째 및 두 번째 고조파 figure-protocol-24 및 figure-protocol-25 두 잠금 앰프에 측정 AC 신호 (2)에 그려집니다. 직류의 figure-protocol-26 (3)에 그려집니다. 지체 2.13 단계에서 설명한 대로 계산 하 고 플롯 (4). 자기 필드 힘 (5)에 설정 됩니다. 유형 K 열전대에 의해 기록 된 온도의 직접 측정 (6)에 표시 됩니다와 출력 신호 ( figure-protocol-27 , figure-protocol-28 ) (7). 추가 샘플 정보 앰프, 샘플 이름, 등의 고용된 감도 등 (8)에 삽입 될 수 있습니다. 데이터 기록 하 고 (9)에 제공 된.txt 파일을 내보낼 수 있습니다. 시작 하 고 "시작 로그" 버튼 (10)으로 데이터 수집을 중지 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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결과

압출 비 DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} 의 복굴절 신호 (어 금 니 비율 4:1:1) 샘플 난방 및 냉각 주기 5에서 ~ 40 ° C 및 1 ° C/min (그림 6)의 속도로 다시 동안 5.5 T 자기장에서 모니터링 했습니다. 복굴절 결과 1.5 x 10^-5, 배나 강한 보고 압출 시스템의 값이 있는 5 ° C에서 높은 자기 정렬 확인. ⁶ ^, ⁷ ^, ²³ 24 ° C에서 DMPC의 T_m 위에 복굴절 신호 제로 비 alignable vesicles의 형성에 의해 발생 했다. 액체 무질서 단계의 운동 모양을 polymolecular 어셈블리에서 주요 재배열 트리거됩니다. 이 재배열은 온도...

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토론

복굴절 측정 했다 SAN과 함께에서 사용 하는 방법의 세부 계정을 생성 높은 자석으로 응답 Ln^{3 +}어셈블리 Isabettini 외 에 인지질 킬레이트 화 하기 위한 방법을 평가 하 실험 ²³ 제안 된 제조 프로토콜은 또한 더 긴 DPPC와 DPPE DTPA 인지질으로 구성 하는 어셈블리에 대 한 또는 그들의 bilayer에 화학적 조작된 스테로이드 유도체를 포함에 대 한 적용 됩니다. ¹¹ ^, ¹² ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ 하기만 하면 되는 샘플은 충분히 높은 온도에 열에 단계 1.3.2, 1.3.3, 1.3.4 1.4.2. 온도 건조 지질 필름 또는 샘플 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 회계 SMhardBi (프로젝트 번호 200021_150088/1)를 위한 스위스 국립 과학 재단을 인정 합니다. SANS 실험은 스위스 spallation 중성자 소스 SINQ, 폴 Scherrer Instute, Villigen, 스위스에서 수행 했다. 따뜻하게 저자 박사 요 아 킴 Kohlbrecher SAN 실험과 함께 그의 지도 감사합니다. 높은 자기장에서 복굴절 측정 설치 높은 분야 자석 실험실 HFML, Nijmegen, 네덜란드에서 기존 설치에서 영감을 했다. 우리는 브루노 Pfister 복굴절 설치의 전자 제품 개발에 그의 도움에 대 한, 1 월 Corsano와 다니엘 Kiechl, 레이저의 정밀 하 고 손쉬운 맞춤을 허용 하는 프레임 워크를 구축 및 지속적인 기술 지원에 대 한 박사 베른하르트 콜 러 감사 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA)Avanti	Polar Lipids	790535P	>99%
Thulium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439649	anhydrous, 분말, 99.9 % 미량 금속 기초
디스프로슘 (III) 염화물	시그마 - 알드리치	325546	무수, 분말, 99.9 % 미량 금속 기초
이테르븀 (III) 염화물	시그마 - 알드리치	439614	무수, 분말, 99.9 % 미량 금속 기초
클로로포름	시그마 - 알드리치	319988	안정제로 에탄올, ACS 시약, ≥ 99.8%
메탄올	시그마-알드리치	34860	≥ 99.9%
콜레스테롤	Amresco	433	초순수 등급
D2O	ARMAR 화학 물질	1410	99.8 원자 % D
초순수	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
전자 pH 측정기	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm 멤브레인 필터	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25mm 200nm 멤브레인 필터	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25mm 400nm 멤브레인 필터	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25mm 800nm 멤브레인 필터	VWR	515-2032
Whatmann 여과지	VWR	230600
25ml 둥근 바닥 플라스크	VWR	201-1352	14/23 NS
3ml 유리 스냅 컵	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
2.5ml 유리 주사기	Hamilton
나트륨 인산이 수소 이수화물	Merk	1.06342	인산염 완충액을 만드는 데 사용되는 소금
인산수소 이	Merk	1.06586	인산염 완충액을 만드는 데 사용되는 소금
액체 질소	Carbagas	-
가압 질소 가스	Carbagas-200		bar bottle
지질 압출기 10 ml	Lipex-thermobarrel
High-pressure PVC tube	NETUM-must	4 MPa
Serto adaptors	Sertot-Nitrile
gloves	VWR-2
ml glass pipettes	VWR	612-1702	230mm 길이의
다이오드 레이저	Newport	LPM635-25C
DSP 이중 위상 잠금 증폭기	SRS	SR830
포토다이오드 검출기	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, 실리콘, 광전도
5.5 T 극저온 자기	극저온/Oerlikon AG-12		bar He-냉각. RW4000/6000 압축기, RGD 5/100 TA 극저온 헤드
2차 저역 통과 필터	가정용		선형 전원 공급 장치 24V DC, 2차 주문, Sallen Key, 차단 주파수 360Hz, +/- 12V, 최대 10mA
광탄성 변조기	Hinds 기기	PEM-90
Glan-Thompson 방해석 편광자	Newport	10GT04	25.4mm 직경
석영 샘플 큐벳	Hellma	165-10-40	온도 제어 셀, 0.8 ml, 10mm 경로 길이
온도 프로브	Thermocontrol-Type		K, 0.5mm 직경, Thermocoax
Non-polarizing mirrors	Newport	50326-1002	25.4mm
RS 232 케이블	National Instruments	189284-02	Compact FieldPoint 컨트롤러 BNC 50 &Omega 전면의 RS-232 포트에 연결
용; 케이블 및 커넥터	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	내쇼날인스트루먼트	777318-110	Compact FieldPoint용 8개 채널 아날로그 전압 및 전류 입력 모듈
cFP-CB-1	내쇼날인스트루먼트	778618-01	Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3	내쇼날인스트루먼트	778618-03	cFP-TC-120 모듈에 열전대를 배선하기 위한 통합 등온 커넥터 블록
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	Compact FieldPoint용 8채널 열전대 입력 모듈
cFP-1804	NI		Compact용 이더넷/시리얼 인터페이스
LabView 2010	National Instruments-Industrial
power 공급	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
수조	Julabo	FP40-HE	냉장/난방 순환기

나트륨 GR resistant with 성 와이어링용 통합 커넥터 블록 , , , , , , ,

참고문헌

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제작 절차 및 복굴절 측정 자석으로 응답 란타넘족 이온 킬레이트 화 인지질 어셈블리 설계에 대 한

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요약

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서론

프로토콜

결과

토론

공개 사항

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재료

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