변환 규칙 단백질 풍부의 제어에서 중요 한 역할을 한다. 여기, 우리는 높은 처리량 방법 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 번역의 정량 분석에 대 한 설명.
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이 논문에서
요약
초록
단백질으로 mRNA의 번역 규칙의 여러 레이어를 포함 하는 복잡 한 공정 이다. 그것은 종종 가정 mRNA 녹음 방송에 있는 변화 단백질 합성, 변화를 반영 하지만 많은 예외 관찰 되었습니다. 최근, 리보솜 프로 파일링 (또는 Ribo-Seq) 이라는 기술을 mRNA의 어떤 영역 단백질 및 게놈 넓은 수준에서 번역의 정량화로 번역 된다 높은 정확도 식별, 수 있도록 강력한 방법으로 떠오르고 있다. 여기, 선물이 신진 효 모에 Ribo-Seq를 사용 하 여 번역의 게놈 넓은 정량화에 대 한 일반화 된 프로토콜. 또한, mRNA 풍부 측정 Ribo-Seq 데이터를 결합 수 있습니다 동일한 샘플에서 mRNA 사본의 수천의 번역 효율을 동시에 계량 하 여 비교 실험에 대 한 응답에서 이러한 매개 변수에서 변경 조작 또는 다른 생리 적인 상태에서. 우리는 리보솜 발자국 nuclease 소화, 자당 그라데이션 분류를 통해 그대로 리보솜-풋프린트 단지의 고립과 DNA 라이브러리의 준비를 사용 하 여 적절 한 함께 깊은 시퀀싱에 대 한의 세대에 대 한 자세한 프로토콜 설명 vivo에서 번역의 정확한 분석을 위해 필요한 품질 제어 합니다.
서론
mRNA의 번역 단백질 식의 규칙에 있는 중요 한 역할 셀에 기본적인 프로세스 중 하나입니다. 따라서, mRNA 번역은 밀접 하 게 다른 내부 및 외부 생리 자극 1,2에 대 한 응답 제어 됩니다. 그러나, 변환 규칙의 메커니즘 understudied 남아 있습니다. 여기, 우리는 리보솜 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 리보솜 프로 파일링 기법의 전반적인 목표는 연구 하 고 계량 다른 세포질 조건 하에서 특정 한 mRNAs의 번역입니다. 이 기술은 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 게놈에 걸쳐 리보솜 인 양적 분석을 하며 단백질 합성에서 vivo에서 단일 codon 해상도 3,4속도 모니터링 현재,이 방법은 단백질 번역의 수준을 측정 하는 가장 고급 방법을 이며 다른 현재 사용할 수 있는 기술, 예를 들면 microarrays에 의해 밝혀질 수 없는 정보를 제공 하는 유용한 검색 도구 입증 또는 번역 상태 배열 분석 (TSAA) 5. 성적 수준 및 변환 출력에 결합 된 변화....
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프로토콜
1. 추출 준비
- (효 모 추출 물 1%, 2% 펩, 2% 포도 당, 및 2 %agar) YPD 접시에 단일 식민지를 위한 냉동된 주식에서 행진 효 모 변종. 2 일 동안 30 ° C에서 번호판을 품 어.
- YPD 플레이트 (사용 하나의 식민지)에서 효 모 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 YPD 매체 (효 모 추출 물 1%, 2% 펩, 2% 포도 당)의 15 mL에 접종 하 고 하룻밤 30 ° c.에 (200-250 rpm)을 떨고와 성장
- 메 마른 플라스 크 2 L에에서 YPD 매체의 500 mL로 문화를 희석 되도록 OD600 < 0.1. OD600 까지 3-5 h 30 ° C에서 흔들어와 효 모 세포 성장 = 0.5 (중간 로그 단계).
- 유리 홀더 필터 어셈블리를 사용 하 여 0.45 ㎛ 멤브레인 필터를 통해 필터링 하 여 세포를 수집 합니다. 주걱, 액체 질소, 플래시 동결와 펠 릿을 긁 고-80 ° c.에 저장 고정 된 펠 릿의 예상된 크기는 ~ 0.2-0.5 g.
주의: 액체 질소는 매우 낮은 온도; 적절 한 보호를 착용 하십시오. - 신선한 세포의 용 해 버퍼를 준비 (20 mM Tris HCl pH 8.0, 140 m m KCl, 5 mM....
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결과
데이터를 프로 파일링 하는 리보솜의 bioinformatic 분석에 대 한 자세한 파이프라인 되었습니다 8,9위에서 설명한. 또한, 여러 연구 그룹 차동 유전자 표정 분석 및 시퀀싱 데이터를 프로 파일링 방법 10,11,12 리보솜에 대 한 특정의 처리를 위한 생물 정보학 도구 개발 ,13,14,15,,16
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토론
Ribo-Seq 접근 mRNA 번역에서 vivo에서 게놈 넓은 레벨 3에서 분석을 위한 강력한 기술로 떠오르고 있다. 연구 모니터링 단일 codon 해상도 번역에서는이 방법을 사용 하는 변환 규칙에 대 한 우리의 이해에 기여 했다. 자사의 장점에도 불구 하 고 Ribo-Seq는 몇 가지 제한이 있습니다. 리보솜 RNA (rRNA) 조각 리보솜 보호 발자국 Ribo-Seq 실험 9,25에서 얻을 수 있는 유용한 연속 읽기의 수확량 감소의 격리 중 공동 순화 항상 있습니다. 우리의 데이터 rRNA 오염 모든 읽기 (그림 8)의 40-50%에 기여할 수 있는 방법을 보여 줍니다. 이 한계를 극복 하는 방법 중 하나는 시퀀싱 깊이 증가 하는. 시퀀싱의 추가 라운드 분석된 샘플의 각 연속 읽기의 필요한 수를 얻을 때까지 수.......
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
이 작품은 AG040191 및 AG054566 VML에 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 이 연구는 VML 노화 연구를 위한 미국 연맹에서 멀리 연구 보조금 받는 동안 실시 됐다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.45 &무; M 멤브레인 필터 | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL 원심 필터 (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4° C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE 완충액 | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-요소 겔 | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-요소 겔 | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-요소 샘플 버퍼 | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' 데데닐라제(10 U/μ L) | 진앙 | DA11101K | |
| 5X 핵산 샘플 로딩 버퍼 | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8 % TBE 젤 | Invitrogen | EC6215BOX | |
| 산 - 페놀 : 클로로포름, pH 4.5 (IAA 포함, 125 : 24 : 1) | Invitrogen | AM9722 | |
| 블루 라이트 트랜스 루미네이터 | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| 크롬 스틸 비드, 3.2mm | BioSpec 제품 | 11079132c | |
| 극저온 분쇄기 | Biospec 제품 | 3110BX | |
| 사이클로헥시미드 | RPI | C81040-5.0 | |
| 데이터 수집 시스템 | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| 데옥시뉴클레오티드(dNTP) 용액 혼합물(10mM) | NEB | N0447L | |
| 글리코겐 | 인비트로젠 | AM9510 | |
| 그래디언트 분획 시스템 | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | 5X Phusion HF Buffer와 함께 제공, |
| 차세대 염기서열분석 라이브러리, 정량 분석 키트 | , Kapa Biosystems | KK4824 | |
| 핵산 겔 염색 | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90, 초원심분리기 | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA 분리 키트 | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J 엑소뉴클레아제(10 U/μ L) | 진원지 | RJ411250 | |
| 역전사효소 (200 U/μ L) | Invitrogen | 18080093 | 5X first-strand buffer 및 0.1 M DTT |
| RNA 단편화 완충액 | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μ L) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μ L) | Invitrogen | AM2696 | |
| 실리콘 고무 캡 | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA 리가제(100 U/μ L) | 진원지 | CL9021K | 10X CircLigase II 완충액 및 50 mM MnCl2 |
| 스테인리스 스틸 마이크로바이알, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(10,000 U/mL) | NEB | M0201S | 10X T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 완충액 |
| T4 RNA 리가아제 2 절단 KQ(200,000 U/mL) | NEB | M0373S | 10X T4 RNA 리가제 완충액 및 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall 폴리알로머 튜브, 13.2 mL | 벡크만 쿨터 | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV 모니터 | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae 균주 BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
참고문헌
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., N....
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재인쇄 및 허가
