생선 정자 평가 소프트웨어를 사용 하 여 및 냉각 장치

요약

현재 프로토콜 물고기 정자 평가 정자 컴퓨터 기반 분석을 사용 하 여 및 냉각 장치에의 한 절차를 설명 합니다. 소프트웨어는 신속, 정확 및 재생산 성공을 개선 하 양식 업에 유용한 도구가 될 수 있는 정 충 운동에 따라 생선 정자 품질의 정량 분석을 제공 합니다.

초록

배우자 품질 평가 대 한 양식 업에 대 한 유용한 데이터를 제공할 수 있는 혁신적이 고 빠른, 양적 기술이 있다. 정자 분석을 위한 전산화 시스템 여러 매개 변수를 측정 하기 위해 개발 되었다 이며 가장 일반적으로 측정의 한 정자 운동 성.

처음, 그것은 또한 물고기 정자 분석에 사용할 수 있지만이 컴퓨터 기술 포유류 종, 위해 설계 되었습니다. 물고기는 정자 평가 짧은 운동 시간 활성화 후, 경우에 따라 낮은 온도 적응에 영향을 미칠 수 있는 특정 기능을가지고 있습니다. 따라서, 그것은 보다 효율적으로 운동 성 분석 생선 정자 분석을 위한 소프트웨어 및 하드웨어 구성 요소를 수정 하는 데 필요한입니다. 포유류 정자에 대 한 난방 격판덮개는 정 충의 최적의 온도 유지 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 일부 어 종에 대 한 그것은 유리를 사용 하 여 낮은 온도 때문에 정자 2 분 미만 대 한 활성 상태로 유지 운동의 기간을 연장. 따라서, 냉각 장치는 일정 온도에서 샘플 분석, 광학 현미경에 포함 하 여의 시간 동안 냉장 보관 하는 데 필요한. 이 프로토콜 물고기 정자 운동 성 정자 분석을 위한 소프트웨어를 사용 하 여 및 새로운 냉각 장치를 최적화 하는 결과의 분석을 설명 합니다.

서론

생식의 효능 두 gametes (계란과 정자)^1,2의 품질에 따라 달라 집니다. 이 성공적인 수정, 허용 가능한 자손^3,4의 개발에 기여 하는 주요 요소입니다. 배우자 품질의 편리한 평가 표본의 불 임 가능성을 정의 하기 위한 최고의 도구입니다.

여러 남성에서 정자를 혼합 많은 수생 상업 종⁴의 생산에 있는 관행 이다. 그러나, 남성 사이 정자 가변성 정자 경쟁으로 이어질 수 있습니다 그리고, 따라서, 모든 남성 동등에 기여 하는 유전자⁵. 이런이 의미에서 개별 정액/정 충 등의 기능 운동, 올바른 평가 잠재적인 개별 남성 불 임에 대 한 차별적인 정보를 얻기 위해 기본적 이다. 정자의 운동 성의 직접 관찰 시간과 경험, 일관성의 부족, 결과^6,7의 호환성 요구 하는 때 부정확 하 고 주관적인 데이터를 생성할 수 있습니다. 그러나, 믿을 수 있는 정자 품질 분석^2,4를 제공할 수 있는 많은 혁신적이 고 신속한 양적 기술이 있다.

컴퓨터 기반 정자 분석 정자 품질⁸에 대 한 정확한 데이터를 제공 하기 위해 개발 되었다. 이 기술은 위상 대비 현미경 정자 운동 성 평가 수와 관련 된 소프트웨어의 개발을 포함 합니다. 그러나, 운동 성 매개 변수의 제한 요소 비디오 카메라의 프레임 속도입니다. 개별 정 충 정 충을 기반으로하는 궤도 머리 중심 위치 연속 프레임에서 비디오 녹화의 flagellar 운동 패턴^3,,910, 와 상관 ¹¹. 주요 운동 매개 변수 측정은 직선 속도 (VSL), 곡선 속도 (VCL)와 평균 경로 속도 (VAP). VSL 시작과 끝점 시간으로 나눈 정 충에 의해 촬영 사이의 거리입니다. 소스는 정 충에 의해 정확한 궤적을 따라 실제 속도입니다. VAP 궤적의 파생된 매끄러운된 경로 따라 속도입니다. 이러한 매개 변수는 선형성 (린), 직진도 (STR), 동요 (WOB) 및 측면 머리 운동 (ALH)와 비트 크로스 주파수 (BCF)^4,10의 진폭 같은 박동 측정을 포함 한 추가 운동 정보를 수 있습니다.

정자 분석 시스템은 원래 포유류 종, 사용 되 고 시스템에 대 한 요구 사항 중 하나는 기증자 (약 37 ° C)의 온도에서 동작 하는 것입니다. 물고기 종;이 소프트웨어를 사용하실 수 있습니다. 비록, 그것은 정자 분석 결과의 오류를 줄이기 위해 몇 가지 적응을 만들 필요가 있다. Salmonids 등 장 어^8,12, 일부 어 종에 수정 낮은 온도 (약 4 ° C)^2,4에 발생합니다. 따라서, 냉각 장치 불편 한 작업 조건을 피하기 위해 개발 되어야 한다. 또한, 물고기 정 충은 정액에서 운동 하 고는 삼투성 충격 운동 성 활성화에 필요한. 담 수 종, 활성 매체 있어야 당뇨 osmolality 동안 해양 종 매체 고 해야 합니다. 그러나, 일부 종 salmonids로 이온 농도 또한 수 있습니다 중요 한^3,,49. 활성화 후 생선 정자 운동 성 (2 분 미만)^13,14 및 신뢰할 수 있는 데이터¹⁵를 최적의 프레임 속도 결정 하는 중요 한 되 고 높은 속도의 급속 한 감소에 의해 특징입니다.

이 연구의 목표는 디자인 생선 정자 샘플에 대 한 냉각 시스템을 적용 하는. 또한,이 프로토콜에는 종에 따라 표준 프로토콜의 설립에 대 한 최적의 프레임 속도 확인 하는 방법을 정의 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 모델로 유럽 장 어를 사용 하 여 물고기 정액 평가의 맥락에서 새로운 문을 엽니다.

프로토콜

절차와 관련 된 동물 주제 되었습니다 승인 (2015/VSC/완두콩/00064) 농업 생산 및 가축 Universitat Politècnica de València에서의 일반적인 방향으로.

1. 포로에서 성숙한 유럽 뱀장어에서 정자 수집

참고: 사용 유럽 장 어 남성 해 수와 일정 온도 (20 ° C)에서 재순환 시스템 탱크에서 유지. (인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG), 물고기 몸 무게의 g 당 1.5 IU) 주간 복 주사를 통해 호르몬 치료. 해 수와 교체 뒤 점차 시작 3 일 민물 물고기 순응 (탱크에서 총 수의 1/3) 37.0 g/mL의 염 분을 도달할 때까지 매 2 일.

1. 더 나은 품질의 정자 샘플을 얻기 위해 호르몬 주사 후 24 h 장 어를 anesthetize.
   1. 사전에 마 취 준비: 70% 에탄올 100ml에 benzocaine의 300 밀리 그램을 추가. 잘 혼합 하 고 4 ° c.에 저장
   2. 60 mg/L의 최종 농도 고 제대로 혼합 시스템 물 5 l 유연한 버킷에서 benzocaine를 희석.
   3. Benzocaine와 시스템 물 양동이에 물고기를 전송 합니다. 물고기는 진정 될 때까지 몇 분 정도 기다립니다.
2. 물으로 음부를 선택을 취소 하 고 정자 샘플 대변, 소변 또는 바닷물의 오염을 피하기 위하여 흡수 성 종이 함께 건조.
3. 복 부 지역에 부드러운 압력을 적용 하 고 15 mL 플라스틱 튜브 진공 펌프를 사용 하 여 정자 샘플을 수집. 정자 볼륨 남성에 따라 최대 6-7 mL.
4. 운동 성 분석 실시 될 때까지 적어도 1 시간에 4 ° C에서 정자 샘플을 유지.

2. 냉동 및 정자 샘플을 희석

1. Diluter 솔루션을 미리 준비 합니다.
   참고: 각 종족에 대 한 특정 extender 솔루션 정자 샘플을 희석 한다.
   1. 장 어 정자 샘플 (P1 매체)에 대 한 비-활성 제 매체를 준비 합니다. 나트륨 중 탄산염, 염화 나트륨, 염화 마그네슘, 염화 칼륨 및 증류수 250 mL를 염화 칼슘의 0.037 g 0.56 g의 0.127 g의 1.828 g의 0.42 g을 추가 합니다. 믹스 잘 분해 하. 4 ° c.에 게
2. 일정 한 온도에서 샘플을 유지 하기 위해 4 ° C에서 쿨러 블록을 설정 합니다. 온도 안정화 될 때까지 기다립니다.
3. 사용 하 여 각 종족에 대 한 diluter 솔루션 특정 정자 샘플을 희석.
   참고: 희석 비율 특정 종족 이며, 표준화 프로토콜을 정의 합니다. 첫째, 정자 농도 3, 4 단계에 설명 된 대로 소프트웨어를 사용 하 여 운동 성의 사전 분석에서 얻은 농도에 따라 예상 됩니다. 이 분석, 그것은 또한 운동 성의 비율에 따라 최고의 정자 샘플을 선택할 수입니다. 이 후, 연구원 최고의 샘플을 사용 하 여 정확한 농도와 실험에 대 한 데이터 수집을 시작할 수 있습니다.
   1. 1시 50분의 비율로 P1 매체에서 장 어 정자 샘플을 희석. 500 µ L 희석 장 어 정자의 준비, 신선한 정자 샘플의 50 µ L과 p 1의 450 µ L를 추가 합니다. 잘 믹스.

3. 평가 정자 운동 성 매개 변수

1. 설정 소프트웨어의 운동 성 모듈
   1. 4 ° C에서 쿨러 무대를 설정 하 고 안정 될 때까지 기다립니다.
   2. 소프트웨어를 오픈 하 고 운동 성 모듈을 선택 합니다. 필요한 경우 사용자 이름 및 암호를 만듭니다.
   3. 속성 을 선택 하 고 정자 분석을 시작 하기 전에 원하는 매개 변수를 선택 합니다.
      1. 종 클릭 | 물고기.
      2. 각 종족에 대 한 최고의 기술 조건에 따라 초당 프레임 및 이미지 번호를선택 합니다. 초당 120 이미지에서 두 옵션을 설정 합니다.
      3. 네거티브 대비를 선택 합니다. 그것은 정 충 궤도¹⁶의 정확한 개조에 대 한 필수입니다.
      4. 해당 계산 챔버 와 비디오 카메라의 규모 를 선택 합니다. 실험에 사용 된 확대 렌즈에 대 한 비디오 카메라를 보정. 세 실으로 SpermTrack10 및 10 X 규모를 설정 합니다.
         참고: 일반적으로, 세 실에서 10 µ m의 깊이 10 X의 확대 렌즈는 권장된 조건 때문에 그들은 모든 정 충의 더 나은 초점을 제공 하 고 세포의 가장 높은 번호를 캡처. 그러나, 각 종족의 운동 성 분석에 대 한 최적의 조건의 이전 연구를 확인 하는 것이 좋습니다.
      5. 각 종족에 대 한 입자 영역 및 연결 을 조정 합니다. 2 µ m² 와 7 µ m에서 연결 최소 입자 영역을 설정 합니다.
         참고: 물고기, 2-5 µ m, 연결 사이 입자 영역 범위의 최소 값에 따라 다릅니다 정 충 속도 및 프레임 속도.
      6. 설정을 저장 합니다.
   4. 캡처를 선택 합니다.
2. 소프트웨어와 함께 유럽 장 어 정자를 분석
   1. 25 ml 증류수 2 %BSA 상업 소금 0.946 g를 추가 하 여 활성 솔루션 (인공 해 수)를 준비 합니다.
   2. 활성 솔루션 (인공 해 수)의 500 mL 고 쿨러 블록에.
      참고: 일반적으로, 생선 정자 활성화 됩니다 삼투성 충격 이벤트, 일부 수 종에 대 한 이온 농도 또한 중요할 수 있지만. 담 수 종, 활성 매체 있어야 당뇨 osmolality 동안 해양 종 매체 고 해야 합니다.
   3. 냉각 단계 아래 세 챔버를 넣고 온도 4 ° c.에 안정화 될 때까지 기다립니다
   4. 활성 제와 희석된 정자 정 충을 활성화 하 고 운동 성 비디오 활성화 후 5-10 s 사이 녹화 시작을 섞는다.
      1. 세 실에서 활성 솔루션 및 장소 4 µ L를 가져가 라.
      2. 부드럽게 정 충 세포에 손상을 방지 하는 microcentrifuge 3 번 흔들어 희석된 정자 균질.
      3. 희석의 0.5 µ L를가지고, 활성기를 함께 혼합 하 고 신속 하 게 계산 챔버에 커버를 넣어.
         참고:이 단계 5 개 이상 걸리지 않을 겁니다 최대한 빨리 분석을 시작 하는 s.
      4. 정 충 세포에 집중 하 고 최고의 시각적 영역, 정 충 (150 ~ 200 셀)을 피하기 위해 셀 (보충 그림 1A) 사이의 차단의 낮은 수에 의해 정의 됩니다. 속도 따라 구분 되는 정 충 트랙을 캡처 비디오 를 선택 합니다.
      5. 결과에서 낮은 변화 하기 전에 진행 하는 최적의 간격을 3 ~ 7 필드를 캡처 를 선택 합니다. 세 실의 표지에 응축을 피하기 위하여 120 s 후 정품 인증까지 기록 영화.
      6. 출구 는 모든 분야의 일반적인 보기를 선택 합니다.

4. 운동 데이터를 얻기

1. 필드를 선택 | 부분 | 저장 파일 이름을 선택 하 고. 저장을 클릭 합니다.
   참고: 스프레드시트 부분 데이터, 차트 및 정 충 트랙의 이미지의 평균값을 제공합니다.
2. 일반 데이터 선택 | 파일 이름 | 저장.
   참고: 데이터를 개별 정 충의 모든 필드에 대 한 운동 값을 제공합니다.

결과

정자의 운동 성에 시간 효과의 분석

유럽 장 어의 경우 정적 정 충의 비율 15에서 증가 120 s s 후 활성화 (24.4%에서 40.7%), 그리고 모바일 진보적인 정 충의 비율 감소 (36.9%에서 20.9%) (그림 1A 그리고 1B). 속도에 따라, 정 충 세포 감소 (그림 1C 및 1d) 시간이 지남에 속도 감소를 보였다. 빠른 속도와 정 충의 비율 (26.6% 49.4%)에서 약 23% 감소 하 고 정 충 중간 속도 비율이 약 7% 증가.

토론

이 프로토콜에서 사용 하는 정자 분석 소프트웨어 사용 되었습니다 연구자에 의해 전세계 물고기를 포함 하 여 다른 종족에 대 한. 그러나, 생선 몇 가지 특정 기능을 정자 평가 영향을 미칠 수 있다. 물고기 정 충 신속 하 게 거부 하 고 활성화 후 운동 성의 짧은 시간에 지도 활성화의 순간에 높은 속도 보여주었다. 게다가, 재생산의 온도 종 종속적 이며, 어떤 경우에 약 4 ° C^2,4,,812수 있습니다. 따라서, 그것은 생선 정자 분석을 위한 컴퓨터 시스템의 효율성을 개선 하기 위해 몇 가지 적응을 만들 필요가 있다. 운동 성 매개 변수의 기본 원리 수집 및 운동 정 충의 연속 이미지의 분석 이다. 대부분의 시스템 하드웨어 및 소프트웨어^17,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인간 융모성 성선 자극 호르몬	Argent Chemical Laboratories	hCG	호르몬
Benzocaine	Merck	E1501 시그마	취
중탄산 나트륨	Merck	S5761 Sigma	P1 미디엄
나트륨 염화	Merck	1.06406 EMD Millipore	P1 중간
마그네슘 염화	Merck	1374248 USP	P1 중간
칼륨 염화	Merck	P3911-500G	P1 중간
칼슘 염화	Merck	C7902-500G	P1 중간
상업용 소금	Aqua Medic	Meersalz	액티베이터 솔루션
BSA	Merck	05470 시그마	액티베이터 솔루션
Falcon 튜브 15 ml	Merck	T1943-1000EA
Falcon 튜브	Merck	R5651-5EA
Eppendorfs	Merck	T9661-1000EA
Micropipet 20 µ를 지원합니다; l	길슨	PIPETMAN® 클래식
마이크로피펫 10 &마이크로; l	Merck	Z683787-1EA
마이크로피펫 20 &마이크로용 팁; l	Merck	Z740030-1000EA
마이크로피펫 10 µ를 위한 팁; l	Merck	Z740028-2000EA
Spermtrack	PROiSER	카운팅 챔버
TruMorph	PROiSER	TruMorph
현미경 UB 200i 시리즈	PROiSER	현미경
쿨러 플레이트	PROiSER		프로토 타입
쿨러 블록	PROiSER		프로토 타입
ISAS v1	PROiSER	ISAS	소프트웨어