수축 성 활동 유도 된 쥐 골격 근육 Phenotypic 적응 연구 만성 자극에의 응용

요약

이 프로토콜 쥐 hindlimb에 골격 근육 자극 유도 적응을 관찰 하는 운동의 만성 수축 성 활동 모델의 사용을 설명 합니다.

초록

골격 근육은 매우 적응할 수 있는 조직 응답 만성 운동으로 크게 변경 되는 생화학 및 생리 적 속성. 다양 한 근육 적응에 대해가지고 있는 내부 메커니즘을 조사, 디딜 방 아, 휠 실행, 그리고 수영 운동 등 운동 프로토콜의 여러 동물 연구에서 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 모델 운동 근육 각 색 한, 따라서 특정 근육 수축 유발 adaptations를 공부 하 고 응용 프로그램을 제한 하는 체액 또는 신경 요인에 의해 또한 통제 될 수 있는 달성 하기 위해 오랜 기간 필요. 간접 저주파 자극 (10 Hz) 만성 수축 성 활동 (CCA)를 유도 하기 위해 사용 되었습니다 대체 모델로 운동 훈련에 대 한 성공적으로 이끌어 낼 수 있다 근육 미토 콘 드 리아 적응 7 일 이내 조직 요인의 독립으로. 이 종이 광범위 한 응용 프로그램에서 미래 연구에 대 한 쥐의 골격 근에 CCA의 치료를 적용 하는 데 필요한 수술 기법을 자세히 설명 합니다.

서론

골격 근육은 생체에 물리적 구조¹변화를 통해 교육 운동에 적응할 수 있습니다. 지구력 훈련에 대 한 가져온 주요 변경 사항 중 하나는의 표현 뿐만 아니라 미토 콘 드리 아 구성 요소 (예: 시 토 크롬 c 산화 효소 [콕스] subunits)의 표현에 증가 하 여 평가할 수 있다 미토 콘 드리 아 속 transcriptional coactivator, PGC-1α². 연구의 증가 미토 콘 드 리아 회전율과 mitophagy를 포함 하 여 수많은 다른 요인, 근육 적응에 대 한 중요 한 또한 나타내 었 다. 그러나,는 급성 또는 만성 운동 메커니즘은 이러한 규제 골격 근육에서 프로세스는 여전히 명확 하지 않다.

운동 유도 된 근육 적응 조절 경로 윤곽을 그리 다, 다양 한 운동 모델 일반적으로 설치류 연구, 디딜 방 아, 휠, 실행 하 고 수영 운동에에서 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 프로토콜에는 4 ~ 12 주 phenotypic 변경^3,,45관찰 하는 데 필요한 몇 가지 한계를가지고. 대체 실험 방법으로 낮은-주파수 자극 유발 만성 수축 성 활동 (CCA) 효과적으로 사용 되었습니다로 근육 적응 실질적으로 짧은 기간에 발생할 수 있습니다 (즉, 최대 7 일)의 효과를 표시 비교, 또는 다른 운동 프로토콜 보다 더 큰 일. 또한, 호르몬⁶,⁷, 온도 및 신경 효과⁸ 의 존재 어려워질 수 있습니다 그것은 만성 운동 근육 특정 응답을 이해 하. 예를 들어 갑 상선 호르몬^9,10 와 인슐린 같은 성장 인자 (IGF)-1¹¹ 또한 골격에서 다른 신호 통로 조절 수 있습니다 훈련 유도 근육 적응을 중재 확인 되었습니다 근육입니다. 특히, CCA 유도 효과 최소한 골격 근육의 수축 성 활동에 직접 응답에 배치에 초점을 수 있도록 조직 요인에 의해 통제 된다.

CCA에 대 한 외부 단위 타일러와 라이트¹²에 의해 처음 도입 되었다 그리고 수정¹²와 함께 개발 되었습니다. 즉, 단위는 3 개의 주요 부분으로 구성: 켜고 적외선 빛, 펄스 발생기 및 펄스 표시기 (그림 1)에 노출에 의해 돌릴 수 있다 적외선 감지기. 자극 단위의 상세한 회로 설계 되었습니다¹³위에서 설명한. CCA의 상세 하 고 특정 기능에서 찾을 수 있습니다 큰 다양 한 검토에에서 깊이 기사^14,15,,1617. 간단 하 게, 자극 프로토콜은 낮은 주파수에 일반적인 비 골 신경 활성화 하도록 설계 되었습니다 (즉, 10 Hz), 그리고 innervated 근육 (tibialis 앞쪽 [TA] 신 근 digitorum longus [EDL] 근육)에 대 한 계약을 강요 하는 미리 정해진 시간 (예를 들어, 3-6 h). 시간이 지나면서,이 모 세관 밀도¹⁸ 에 미토 콘 드리 아 콘텐츠^19,,2021증가 의해 입증 더 에어로빅 형 전술 근육 이동 합니다. 따라서,이 방법은 쥐의 골격 근 내 주요 지구력 훈련 적응의 일부를 모방 하는 검증 된 모델 이다.

이 종이 연구원은 그들의 운동 연구에서이 모델을 적용할 수 있도록 CCA 유도 전극 이식 수술의 자세한 절차를 제공 합니다. CCA 운동 훈련의 다음 모두 초기 및 나중 시간 포인트에서 다양 한 분자 및 신호 이벤트의 수사를 위한 효과적인 도구를 제공 하는 따라서 근육 적응의 시간 과정 공부에 대 한 우수한 모델입니다.

프로토콜

모든 동물 관련 절차 검토 및 뉴욕 대학 동물 관리 위원회에 의해 승인 했다. 뉴욕 대학에서 동물 시설에 도착, 모든 쥐 제공 음식 광고 libitum와 수술 전에 그들의 환경에 순응을 최소 5 일을 주어졌다. 이 프로토콜은 이전을 적용 된 다른 종^15,,1722현재 종이 Pette과 동료²³ 의 선구적인 작품에 및 쥐 모델에 특히 초점을 맞추고.

1입니다. 만성 수축 성 활동 단위의 준비

1. 전압계를 사용 하 여 동전 리튬 배터리의 잠재력을 확인 하십시오.
   참고: 각 배터리의 잠재력 3.0 ± 0.10 V 이어야 한다.
2. 총 잠재력은 6-9 V 장치의 슬롯에 2 개 또는 3 개의 배터리를 삽입 합니다.
   참고:이 (6 또는 9 V)을 유지 하기 위해 얼마나 많은 가능성을 고려 하는 연구자의 재량까지 전체 실험 절차 동안. 연구 설계 및 자극의 원하는 강도 따라 2 또는 3 배터리를 사용할 수 있습니다.
3. 장치는 제대로 작동 하는지 펄스 표시기를 통해 휴대용 적외선 스트로브 빛 방출 1 펄스를 노출 하 여 확인 합니다.

2. 만성 수축 성 활동의 수술

참고: 수술 전에 모든 수술 도구를 소독. 중과 수술 직후, 쥐의 체온 생리대에 의해 유지 됩니다. 외과 용 드 레이프에서 수술 절차를 수행 하는 것이 바람직합니다. 외과 의사는 깨끗 한 실험실 코트로 서 불 임 수술 장갑을 착용 해야 한다. 필요한 경우, 일회용 인공 호흡기 마스크를 착용 하는 것이 좋습니다.

1. Anesthetize 쥐 1-3% 미만 isoflurane 흡입 산소, 가스 기화 기 시스템에 의해 운영 되는. 동물 hindlimb 발가락 핀치를 선택 하 여 및 호흡의 깊이 속도 관찰 하 여 진정 완벽 하 게는 확인 합니다. 건조를 피하기 위해 눈에 눈 윤 활 유를 적용 합니다. 2 mg/kg에서 Meloxicam (0.5 mg/mL)의 피하 주사를 적용 합니다.
   참고: 그것은 또한 동안에 그리고 수술 후 통증을 최소화 하기 위해 (예: Meloxicam 플러스 lidocaine) 진통의 멀티 모달 응용 프로그램을 권장.
2. 부드럽게 면도 목의 뒤쪽에서 몸통 주위 스트립으로 왼쪽된 hindlimb 약 뒤에 앞 발을 앞쪽 흉부에 걸쳐. 부드럽게 요오드와 에틸 알코올 소독 면도 영역을 닦으십시오.
3. 동물의 뱃속에 누워, 면도 지역 (양 어깨 사이 만져 서 지역)의 중심에서 목의 뒤에 작은 절 개 (~0.5 cm) 게 메스 (No. 10 블레이드)를 사용 하 여.
4. 일반적인 비 골 신경을 찾습니다.
   1. 동물의 오른쪽 면에 롤 하 고 ~ 2-3 cm-긴 왼쪽된 hindlimb의 피부에 잘라. 무릎 관절의 보조 개는 꼬리의 가까이 다시 사이 landmarked는 위쪽 허벅지 근육 그룹 주변 절 개 지역 대상.
      참고: 수 시체의 위치를 변경할 때 첫 번째 절 개 영역을 오염 하지 않도록 주의 하십시오.
   2. 무뚝뚝한 끝을 사용 하 여 곡선 수술가 위, 피하 영역을 널리 해 부 ~3.5-4 cm, 열린된 피부와 기본 근육 사이 주머니를 만들기 위해 기본 근육에서 피부를 분리. 피부 절 개 (~1.5 c m²)의 전체 둘레 기본 조직에서 엽니다.
   3. 수술가 위,가 위 팁은 근육을 통해 직접 다운 절단 보장 femoris 팔 뚝 근육에 작은 절 개 (미만 0.5 c m)를 확인 합니다.
   4. 내부 근육 그룹 및 일반적인 비 골 신경 표시 될 때까지 부드럽게 잘라 영역을 열고 (외부 근육 조직 (즉, 팔 뚝 femoris)의 깊이 ~0.5 cm 주변). 집게를 사용 하 여, 부드럽게 터치/핀치 보이는 신경 그리고 일반적인 비 골 신경 분리 되는지 확인 하는 대상 근육 그룹 (예를 들어, TA 근육) 및 발가락 (보이는 dorsiflexion)의 응답을 관찰.
      참고:이 단계는 절단 또는 신경 손상 방지 하려면 극단주의 함께 행해져야 한다.
   5. 윈도우의 크기는 ~1.5 cm² 윈도우의 중앙에 누워 비 골 신경 금속 견인 기도 당겨 창 수정. 스트랩 또는 테이블 표면 (또는 수술 보드)에 고정은 고무 줄에 연결 된 작은 금속 후크를 사용 하 여 (그림 2A).
5. 신경의 양쪽에 와이어를 연결 합니다.
   1. 소계 (PTFE)의 50-60 cm를 준비-고급 스테인레스 스틸 와이어 코팅 하 고 반으로 접어.
      참고: 수술 전에 자외선 아래 PTFA 코팅 와이어를 노출 하는 데 도움이 수 있습니다.
   2. 30 cm 긴 스테인리스 막대의 슬릿을 와이어의 접힌된 부분을 후크. L 자형 패턴 다리 및 뒤의 중앙에 따라 로드, 와이어, 피하의 작은 절 개 영역, 목 뒤쪽을 향해 hindlimb 오픈 포켓에서에서 함께 전달 합니다.
   3. hindlimb에 철사의 2 개의 끝을 찾아. 이후 모든 전선은 PTFE 절연 전선을 스트립. ~1.5 cm에 의해 철사의 끝을 스트립 신중 하 게 메스를 사용 하 여. 와이어 마모 될 경우 그들을 잘라 고 다시 스트립. 랩 무딘된 21 G 바늘 주위 벗겨진된 철사 끝 (5 회), 코일을 만들기. 일단 코일은 제대로, 그들 로부터 바늘을 놓습니다.
   4. 6-0 수술 실크는 크기를 사용 하 여, 일반적인 비 골 신경 (그림 2A)의 양쪽에 코일의 각 보안.
      1. 코일의 끝에 매듭을 만들고 신경의 왼쪽에 봉합. 코일은 신경에서 1.5-2.5 m m 인지 확인 합니다.
      2. 확보 하기 위해 코일, 코일을 따라 2 개 또는 3 개의 추가 봉합을 적용 합니다.
      3. 신경의 오른쪽 측면에서이 단계를 반복 합니다.
   5. 항 생 (암 피 실린 염 분에; 132 mg/mL), 2-3 방울을 적용 하 고 신중 하 게 봉합 크기 5-0 실크를 사용 하 여 창 (즉, 팔 뚝 femoris 근육 조직).
6. 느슨하게 (검지 손가락의 지름)에 대해 와이어 및 팔 뚝 femoris 근육 (엉덩이) 위 약의 sutured 절 개 위에 피하 포켓에 밀어의 나머지 여유 바람.
7. 다시 항생제 솔루션 (암 피 실린 염 분에; 132 mg/mL) 2-3 방울을 적용 합니다. 스테이플링 열린된 피부를 닫습니다.
8. CCA 자극을 (목의 절 개 면 나오는) 와이어를 연결 합니다.
   1. 와이어 핀 소켓에 연결 합니다.
      1. 2 와이어 끝 (비 골 신경의 양쪽을 봉합 하는 코일에 이러한 리드)를 만드는 목의 상단에 절 개를 나오는 와이어 루프를 잘라.
      2. 있는 경우 메스, ~0.5 cm. 컷 닳은 전선에서 전선의 끝에서 스트립을 사용 합니다.
      3. 천천히 핀 소켓의 구멍에 철사의 벗겨진된 부분을 밀어 하 고 핀 소켓에 철사를 납땜 납땜을 사용 하 여.
   2. 필요한 경우 전선의 연결을 확인 합니다.
      1. 악어 클립을 통해 큰 벤치탑 자극 단위에 핀을 연결 합니다.
      2. 단일 펄스를 9 V (0.1 ms, 10 Hz) TA 근육 계약 및 왼쪽 발 dorsiflexes 확인을 제공 합니다.
   3. 핀 연결 와이어 끝 ~ 4 c m x 4cm 멸 균 거 즈 패드를 통해 전달 합니다.
   4. CCA 자극 단위에 핀을 연결 합니다.
      1. 자극 기 상자 밑면에 있는 구멍에 전선을 통과.
         참고:이 상자는 CCA 자극 단위에 대 한 집에서 만든 챔버 이며 3.5 c m × 3.5 c m × 2.5 c m¹³.
      2. CCA 단위에 연결 소켓에 핀을 삽입 합니다. 실로 CCA 단위를 넣어 부드럽게. 끈적끈적한 압정을 사용 하 여 챔버의 하단에 CCA 단위 보안.
   5. Using 운동 테이프 또는 다공성 외과 테이프, 면도 몸통 주위 테이프로 챔버를 수정 합니다. 녹화의 세 가지 레이어와 챔버의 상단 닫고 테이프 상자 (그림 2B)를 확보 하기 위해 자극 상자의 측의 주위에 포장 하 여 완료 합니다.
9. CCA 적외선 빛의 단일 펄스를 제공 하 여 작동 하는지 확인 (파장 스펙트럼 > 770 nm)는 휴대용 적외선 스트로브 빛으로 방출 된다.
   참고: CCA 올바르게 작동 하는 경우 연구원은 됩니다 (즉, TA) hindlimb 근육 응답 적외선 빛으로 계약 하 고 있다 볼 수 있습니다.
10. 쥐를 관찰 하 고 그것은 완전히 의식이 회복 될 때까지 그것의 온도 모니터링. 그것은 다른 동물에서 어떤 해 든 지 방지 하기 위해 단일 탑승자에에서 하며 자극 단위 또는 동물에 손상의 위험을 완화 하는 연구의 나머지 부분에 대 한 장에 어떤 터널 또는 플라스틱 개체를 떠나 지 마. Amoxicillin 포함 물 병 (0.5 mg/mL)와 함께 제공 합니다.
11. 피하 1 mg/kg 복용량 Meloxicam의 모든 24 h 72 h에 대 한 적어도 계속 수술을 적용 합니다.

3. 만성 수축 성 활동

1. 수술 후, 절 개 및 봉합에 / 주변 지역 골격 근육의 전체 복구를 위해 적어도 5-7 일 수 있습니다.
   참고: 동안 CCA 절차 후, 철저 하 게 확인 각 동물의 상태 (예: 식사, 음주, 또는 이동) 그들의 행동을 관찰 하 여. 또한, CCA 절차 전후 몸 무게의 변화를 확인 하 여 어떤 심한 스트레스 또는 부작용을 결정 합니다.
2. CCA 자극의 날, CCA에 자극 장치 적외선의 단일 펄스를 제공 하 여 설정 (파장 범위 > 770 nm) 휴대용 적외선 스트로브 빛.
3. 10 Hz CCA 자극의 3 또는 6 h를 적용 합니다.
   참고: 자극에 대 한 시간 프레임 연구원까지입니다. 이 실험에서 자극의 주파수 변경 되었습니다 결코 고 미토 콘 드리 아 적응에만 매우 겸손 기능 향상 자극 3에서 6 h/일, 우리의 경험을 확장 하 여 관찰 되었습니다. 만약에 가능 하다 면, 자극 및 동물 30-60 분 마다 확인 합니다.
4. 원하는 CCA 기간에 따라 적외선 빛 노출 (단위에 동일한 절차) 통해 CCA 장치를 해제 합니다.
5. 여러 날 경우, 3.2 단계를 반복 합니다. 3.4.
6. 조직 컬렉션의 타이밍을 결정 합니다. 예를 들어 CCA CCA 수술 동안 마 취에서 실시 되는 (즉, 6 h의 마지막 CCA 자극 후 18 h)의 마지막 시 합 개시 후 조직 24 h를 수집 합니다. 수집 후 즉시 모든 조직, 동물 마 취의 밑에 아직도 있는 동안 마음을 절 개 하 여 동물을 안락사.

결과

우리는 만성 수축 성 활동 (CCA) 골격 근육 내 유리한 미토 콘 드리 아 적응을 유도 하는 효과적인 도구입니다 나타났습니다. CCA (하루 6 h)의 7 일 대상이 쥐 unstimulated contralateral (제어) hindlimb에 비해 자극된 근육에서 향상 된 미토 콘 드리 아 속을 표시 됩니다. 미토 콘 드리 아 속에 있는이 증가 다른 키 미토 콘 드리 아 단백질 콕스의 고도가 함께 미토 콘 드리 아 속의 마스터 레 귤 레이 터를 간주 PGC-1α (그림 3A)의 증가 단백질 표정으로 표시 됩니다-난 및 콕스-IV, 이 전자 전송 체인의 중요 한 요소입니다. 또한, 시 토 크롬 c 산화 효소 (콕스) 효소 활동, 미토 콘 드 리아 콘텐츠의 유용한 표시기는 CCA (그림 3B)의 7 일 다음 약 30% 증가. 미토 콘 드리 아 호흡 능력을 측정 하 ...

토론

저주파 근육 자극에서 vivo에서,을 통해 운동, 만성 수축 성 활동 (CCA) 모델은^13,,2425 운동 근육 phenotypic 적응 공부에 대 한 우수한 모델 ^{, 26}. 같이 이전 연구^20,27, CCA는 효과적인 도구는 연구원의 훈련 볼륨과 주파수 (즉, 시간 및 일)를 제어할 수 있고 다양 한 생 화 학적 및 분자를 조사 수축 성 활동의 반복된 관찰 과정 이벤트. 이 모델의 가장 큰 특징 중 하나는 근육 contralateral hindlimb의 내부 제어, 동물 사이 가변성을 최소화 하는 데 도움이로 사용 됩니다. 또한, 10 년 이상 우리의 수많은 실험 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Sprague Dawley Rat	Charles River	Strain 400
Chronic contractile activity unit	집에서 만든	n/a
CCA 장치 보호 상자(3.5 x 3.5 x 2.5cm)	집에서 만든	n/a	상자는 불투명한 재료로 만들거나 opague 테이프로 덮어야 합니다.
코인 리튬 이온 배터리(3V)	Panasonic	CR2016
Medwire	Leico 산업	316SS7/44T
솔더 핀(소켓)	Digi-Key	ED6218-ND
Zonas 다공성 테이프	Johnson & Johnson	5104
봉합사 실크 (사이즈 5)	Ethicon	640G
봉합사 실크 (사이즈 6)	Ethicon	706G
곡선 무딘 가위 (길이 11.5cm)	F.S.T.	14075-11
곡선 무딘 가위 (길이 15cm)	FST	14111-15
섬세한 지혈 겸자 (길이 16cm)	로튼	06-0230
메스	깃털	3
곡선 집게	F.S.T.	11052-10
스테인리스 스틸 막대 (30cm, 직경 7mm)	집에서 만든	막대	한쪽 끝에 5mm 슬릿이 있어야하며 피부 아래 터널링을위한 와이어를 고정해야합니다
클립 집게 적용	KLS Martin	20-916-12
스테이플 (클립)	Bbraun	BN507R
금속 후크 / 견인	집에서 만든	n/a
포비돈 요오드 (500 mL)	Rougier	#NPN00172944
Ampicillin 나트륨	Novopharm	#DIN00872644
Metacam	Boehringer	#DIN02240463
디지털 멀티 미터 (전압계)	Soar Corporation	ME-501
LED 디지털 스트로보 스코프	Lutron Electronic Enterprise	DT-2269