세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축

Krista M. Armbruster; Timothy C. Meredith

doi:10.3791/56842

이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축

8.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56842

⸱

2018년 5월 21일

Krista M. Armbruster¹ , Timothy C. Meredith¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University

이 논문에서

요약

비 이온 계면 활성 제 단계 분할 메서드를 사용 하 여 세균성 단백질의 농축 TLR 분석 실험에 직접 사용 또는 다른 응용 프로그램에 대 한 설명 합니다. 추가 단계 구조 특성에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides를 준비 하는 질량 분석에 의해 자세히 나와 있습니다.

초록

지 단백질 세균성 세포 봉투의 중요 한 성분 이며 포유류 타고 난 면역 반응의 강력한 활성 제입니다. 세포 생리학과 면역학에 그들의 중요성에도 불구 하 고 많은 소설 지, 어떻게 그들은 합성은, 양식과 호스트 면역에 다양 한 형태의 효과 대 한 발견 되 고 남아 있다. 지 단백질에 대 한 철저 한 연구를 활성화 하려면이 프로토콜 세균 단백 농축 하는 방법에 설명 합니다 및 매트릭스 지원 레이저에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides의 준비 desorption 이온화 시간의 비행 질량 분석기 (MALDI TOF MS)입니다. 단백 추출 및 세균성 세포 막에서 농축 방법 분할 설립된 트리톤 X-114 단계에 확대, 프로토콜 단백 수확량 증가 비 지 오염 물질을 제거 하기 위한 추가 단계를 포함 하 고 순도입니다. 먼저 MALDI TOF 양 여기에 의해 N-터미널 구조 특성에 중요 한 단백질은 수용 체 통행세 같이 (TLR) 분석 실험 일반적으로 사용 됩니다, 이후, 메서드 N 맨끝에 농축 하는 집중된 소수 성 펩 티 드를 분리 하 여 lipopeptides 나트륨 라우릴 황산 염 폴 리 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분리 된 TOF MALDI MS/양 지 단백질에 의해 직접 분석에 적합 니트로 막 전송 현장에 와 소화 트립 신, 순차적으로 북극 tryptic 펩 티 드, 제거 하기 위하여 세척 그리고 클로 프롬-메탄올을 가진 마지막으로 eluted. 세척 솔루션에서 더 극 trypsinized 펩 티 드의 MS와 결합,이 메서드는 둘 다 식별 하는 단백 단일 실험에서의 N-말단의 특성 기능을 제공 합니다. 의도적인 나트륨 adduct 형성 더 구조적으로 유익한 조각화 스펙트럼을 홍보 하는 도구로 채택 될 수 있다. 궁극적으로, 단백질의 농축 및 그들의 N 맨끝 구조의 세균성 단백질의이 유비 쿼터 스 클래스에 더 광범위 한 연구 수 있도록 합니다.

서론

세균성 단백질을 보존된 N 맨끝 지질 수정 시스테인 그 앵커 세포 막 표면에 구형 단백질 도메인 특징입니다. 그들은 보편적으로 박테리아에 일반적인 게놈¹내의 모든 세포질 유전자의 2 ~ 5%를 구성 배포 됩니다. 지 단백질 등 양분 통풍 관, 신호 변환 세포질 과정의 광범위 한에 중요 한 역할 단백질 복합물의 및 유지 세포 봉투 구조적 무결성². 병원 성 박테리아, 단백질 독성 요인³^,⁴로 제공합니다. 감염, 동안 N 맨끝 lipopeptides 수용 체 통행세 같이 (TLR) 2에 의해의 인식 incites 침입 병원 체를 제거 하는 타고 난 면역 반응. N 맨끝 acylation 상태에 따라 단백질 대체 TLR2 heterodimeric 복합물에 의해 일반적으로 인식 된다. TLR2 TLR1 TLR2 TLR6 바인딩 무료 lipopeptide α-아미노 termini 동안 N-acylated lipopeptides를 인식합니다. 한 번 바운드, 신호 경로 proinflammatory cytokines³^,^4<....