클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템 유전 공학에 대 한 유망한 도구를 제공 하 고 transgenes 대상된 통합의 가능성을 엽니다. (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝 설명-효율적인 DNA 비보에 통합 대상 및 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 치료를 대상으로 전략을 기반으로.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여
이 논문에서
정오 공지
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
요약
초록
유망한 게놈 편집 플랫폼으로 서 CRISPR/Cas9 시스템 특히 transgenes 대상된 통합에 대 한 효율적인 유전자 조작에 대 한 큰 잠재력이 있다. 그러나, 동종 재결합 (HR)의 낮은 효율과 비 동종 끝 결합 (NHEJ)의 다양 한 indel 돌연변이 때문-기반 전략 비 분할 셀, vivo에서 게놈 남아 편집에 큰 도전. 여기, 우리가 설명 (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝-정확한 타겟 통합 효율적인 vivo에서 CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로. 이 시스템에는 기증자와 타겟된 게놈 벡터 포함 하 상 동 팔 (~ 800 bp) 단일 가이드 RNA (sgRNA) 대상 시퀀스는 CRISPR/Cas9에 의해 죽 습에 의해 형벌. 이 HMEJ 기반 전략 마우스 zygotes, 뿐만 아니라 vivo에서hepatocytes에 효율적인 transgene 통합을 달성 한다. 또한, HMEJ 기반 전략은 hepatocytes에서 fumarylacetoacetate 가수분해 효소 (파) 돌연변이의 수정에 대 한 효율적인 접근 방식을 제공 하 고 파를 구출-결핍 유발 간부 쥐. 함께, 통합 대상에 초점을 맞추고,이 HMEJ 기반 전략 유전자 변형된 동물 모델 및 타겟된 유전자 치료의 세대를 포함 하는 응용 프로그램의 다양 한 유망 도구를 제공 합니다.
서론
정확 하 고 타겟 게놈 편집 하는 것은 종종 생산 하는 유전자 변형 동물 모델과 임상 치료 필요 합니다. 효율적인 타겟된 게놈 아연 손가락 nuclease (ZFN), 같은 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs), 편집에 대 한 다양 한 전략을 개발 하기 위해 많은 노력 했다 및 CRISPR/Cas9 시스템. 이러한 전략 타겟된 DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 게놈에서 만들고 동종 재결합 (HR)1,2, microhomology-중재 끝 결합 (MMEJ)3 등 본질적인 DNA 복구 시스템 , 4 , 5, 그리고 비 동종 끝 결합 (NHEJ)6,,78 transgenes1,9의 타겟된 통합을 유도 하 라. 시간 기반 전략은 현재 가장 일반적으로 사용 되는 셀 라인에 매우 효율적 이지만 비 분할 셀 후반 S/g 2 단계에서 제한 된 그것의 발생 때문에 쉽게 액세스할 수 없는 접근을 편집 하는 게놈. 따라서, 시간 기반 전략 vivo에서 게놈 편집에 대 한 적용 되지 않습니다. 최근, NHEJ 기반 전략에 대 한 효율적인 유전자 노크 마우스 조직8에서 개발 되었다. 그럼에도 불구 하 고, NHEJ 기반 방법 일반적으로 접합, 어렵게 정확한 게놈 편집, 프레임에 융합 유전자8를 구성 하려고 할 때 특히 생성에서 indels를 소개 합니다. MMEJ 기반 대상된 통합은 정확한 게놈 편집 가능 합니다. 그러나, 그것은 단지 겸손 하 게 이전 보고서5대상된 통합 효율성 증가. 따라서 vivo에서 정확한 타겟된 통합의 효율성 개선 시급히 필요 광범위 한 치료 응용 프로그램3합니다.
최근에 출판 된 작품에서 우리 시연 (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝-모든 보고 전략 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서10최고의 타겟된 통합 효율을 보여준 전략을 기반으로. 여기, 우리는 HMEJ 시스템의 설립을 위한 프로토콜을 설명 하 고 또한 관심과 기증자의 유전자를 대상으로 단일 가이드 RNA (sgRNA) 벡터의 벡터 은닉 sgRNA 대상 사이트와 ~ 800 bp 상 동 팔 (그림 1)의 . 이 프로토콜에서 우리 또한 vivo에서조직 대상된 통합에 대 한 DNA 노크에서 마우스와 간단한 단계의 세대에 대 한 자세한 내용은 설명합니다. 또한, HMEJ 기반 전략의 개념 증명 연구 Fah 돌연변이 수정 하 고 구조 파-/- 간 실패 마우스, 더 치료 잠재력을 공개 하는 기능을 설명 했다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
동물 주제를 포함 한 모든 절차 생물 과학 (CAS) 상하이 연구소에서 생물 의학 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.
1입니다. 기증자 플라스 미드의 디자인
-
SgRNA의 선택
- 온라인 CRISPR 디자인 도구를 사용 하 여 대상 지역11,12,13,,1415에 sgRNAs를 예측. Cdx2 로커 스에 대 한 6 개의 서로 다른 sgRNAs 디자인 (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) 주위에 정지 codon 높은 순위 및 더 낮은 잠재력으로 오프-대상 (그림 1A)16.
- BbsI 소화 (1 µ L BbsI의 20 µ L의 볼륨에서 1 U / µ L의 최종 농도에서 37 ° C에서 2 시간에 대 한)에 의해 Cas9-CMV-EGFP 식 벡터와 sgRNA의 2 µ g를 선형화. 다음 1 × 태 버퍼에 1 %agarose 젤 젤 정화 키트에 의해 제품을 정화.
- 믹스 한 쌍 sgRNA oligonucleotides 50 µ M. 최종 농도를 1 × T4 DNA 리가 버퍼의 10 µ L에서의 온도 변화 속도 5 ° C/5 분 (5 분 동안 95 ° C 95 ° C에서 25 ° C의 온도 기울기를 사용 하 여 올리고 솔루션을 품 어 5 분, 5 분, 등등을 위한 85 ° C에 대 한 다음 90 ° C.),이 oligos anneal 것입니다.
- 혼합 4 µ L의 제품, 1 × T4 DNA 리가 버퍼의 10 µ L에 T4 DNA 리가의 1 µ L로 선형화 벡터의 2 µ L을 단련 하 고 1-2 h (그림 1B) 22 ° C에서 선.
-
SgRNA의 측량 nuclease 분석 결과
참고: 노크에서 실험을 위해 사용 하는 sgRNA의 대상 효율 측량 nuclease 분석 결과 평가 (일컬어 T7 endonuclease 나 (T7EI) 분석 결과)17. 높은 DNA 분열 효율과 sgRNA 절단 사이트와 정지 codon 사이의 낮은 거리는 sgRNA를 선택 합니다.- Cas9-sgRNA-EGFP 식 벡터 N2a 셀 라인에 transfect DMEM 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청에서에서 교양, 1 %PSG, 그리고 1% 비 필수 아미노산은 transfection에 의해 키트 ( 재료의 표참조). 5% CO2에서 37 ° C에서 transfected 세포를 품 어.
- 외피의 48 h 후 수집 5000 transfected 셀 (GFP+) 형광 활성화 (FACS) 정렬 제어로 비 페 셀을 사용 하 여.
- 2-5 µ L oflysis 버퍼 (0.1% 트라이 톤 X-100, 0.1% 트윈 20, 및 100 µ g/mL 가수분해 K) 30 분 동안 56 ° C에서 수집 된 세포를 소화 하 고 십 분 동안 95 ° C에 K 성분을 비활성화.
- 중첩 된 PCR (표 1) 제조업체의 프로토콜을 사용 하 여 샘플을 증폭. PCR 제품의 크기는 300-500 bp로 설정 됩니다.
- DNA 중 합 효소와 sgRNA 대상 사이트 (0.1 µ M, 최종 농도) 시퀀스를 인식 하는 외부 뇌관의 쌍 세포 제품의 믹스 1 µ L (표 1), 20 µ L의 볼륨에서 기본 PCR을 수행 하 고.
- 5 분 동안 95 ° C에서 DNA 중 합 효소를 활성화 하 고 30 95 ° C에서 30 사이클에 대 한 기본 PCR을 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 24 72 ° C s (1 분/1 킬로바이트), 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장.
- 1 µ L 기본 PCR 제품의 중첩 된 내부 뇌관의 쌍을 사용 하 여 2 차 PCR을 수행 합니다.
- 변성 고 다시 1 × T7EI 반응 버퍼 (50 m m NaCl, 10 mM Tris HCl, 10 m m MgCl2, 1mm DTT pH 7.9)의 20 µ L에서 순화 된 PCR 제품의 300-600 기 anneal 속도/5 분의 5 ° C 95 ° C에서 25 ° C의 온도의 그라디언트를 사용 하 여.
- 단련 된 PCR 제품 및 다이제스트 2 h 37 ° C에서 T7EI 효소의 1 µ L를 추가 합니다. 파편 ( 재료의 표참조) 분리 될 때까지 다음 1 × 태 buffer 120 V 40 분 2 %agarose 젤에 소화 제품을 실행 합니다.
- ImageJ를 사용 하 여 잘라내기 및 포경된 DNA의 밴드 농도 결정. 메서드를 사용 하 여 이전 indel 빈도 보고9 (그림 1C)를 계산 합니다.
-
기증자 벡터의 건설
참고: Cdx2 유전자에 대 한 HMEJ 기증자 벡터를 생성 하려면 구성 DNA 기증자 (800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp 하겠다) 23 형벌 nt Cdx2 sgRNAs 타겟팅 (D 그림 1및 그림 1E) 양쪽에서 시퀀스. 대상 시퀀스의 PAM 동종 팔의 끝에 인접 했다. 깁슨 어셈블리 HMEJ 기증자 복제에 대 한 것이 좋습니다.- 앞으로 뇌관-1 층으로 800 bp 왼쪽된 상 동 팔 (HAL)을 증폭 (벡터, 23에서에서 15-20 nt 중첩 시퀀스가 포함 된 nt Cdx2 sgRNA 대상 시퀀스, 그리고 HAL에서 약 20 nt 시퀀스) 및 뇌관-1 라운드 (15-20 bp 겹침 순서에서 포함 된 역 p2A mCherry와 HAL에서 약 20 nt 시퀀스) 0.1 µ M 최종 농도 200 ng / µ L (D그림 1, 표 1)에서 마우스 게놈 DNA를 사용 하 여에서.
- 앞으로 뇌관-2 층 (HAL에서 15-20 nt 겹침 순서와 삽입 부분에서 약 20 nt 시퀀스를 포함 하는)와 p2A mCherry 삽입 단편 증폭 하 고 뇌관-2R (포함 된 무기에서 15-20 nt 중첩 시퀀스에서 약 20 nt 순서 반전 삽입 부분)에서 0.1 µ M 최종 농도가 100 ng / µ L 또는 30 ng / µ L (D그림 1, 표 1)에서 기자 시퀀스 게놈 DNA 또는 플라스 미드를 사용 하 여.
- 앞으로 뇌관-3 층으로 800 bp 오른쪽 상 동 팔 (무기)를 증폭 (벡터, 23에서에서 15-20 nt 중첩 시퀀스가 포함 된 nt Cdx2 sgRNA 대상 시퀀스, 그리고 무기에서 약 20 nt 시퀀스) 반전 뇌관-3R (15-20에서 nt 중복 시퀀스를 포함 하 고 p2A mCherry 및 무기에서 약 20 nt 시퀀스) 0.1 µ M 최종 농도 200 ng / µ L (D그림 1, 표 1)에서 마우스 게놈 DNA를 사용 하 여에서.
- 1 × 태 버퍼에 1 %agarose 젤에 PCR 제품을 실행 하 고 제조업체의 지침 (표 1)에 따라 젤 추출 키트에 의해 예상 되는 크기의 PCR 제품을 정화.
- KpnI 및 XbaI 구조 벡터의 50-100 ng을 소화. 믹스 2 µ L 3 PCR와 30-40 ng / µ L에서 선형화 벡터의 깁슨 믹스 x 2에서 조각 (각, 100-200 ng / µ L에 대 한 1 µ L)를 증폭. H2O 10 µL.Incubate 60 분 50 ° C에서 믹스를 최종 볼륨 조절 추가.
- 유능한 대장균 을 변형 모든 조립된 제품 및 플라스 미드 DNA 추출 키트 제조업체의 지침에 따라 하 여 구성 하는 추출 셀. DNA 시퀀싱에 의해 HMEJ 기증자를 확인 합니다.
2. 게놈 HMEJ 기반 메서드를 사용 하 여 마우스 배아에서 편집
-
Cas9 mRNA의 생산
- Cas9 mRNA 준비, T7 발기인 순서는 Cas9 표 1에 나열 된 적절 한 뇌관 쌍을 사용 하 여 PCR 증폭에 의해 지역 코딩을 추가 합니다. 0.1 µ M의 최종 농도 20에서 뇌관 Cas9 F/R 추가 1 × 고 충실도 DNA 중 합 효소 혼합에 벡터를 표현 하는 Cas9의 ng. H2o. 50 µ L 최종 볼륨을 조정
- 5 분 동안 95 ° C에서 DNA 중 합 효소를 활성화 하 고 30 95 ° C에서 36 사이클에 대 한 PCR을 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 4 분 (1 분/1 킬로바이트), 10 분 동안 68 ° C에서 최종 확장명이 68 ° C.
- 생체 외에서 전송 (IVT), T7 Cas9 PCR 제품을 정화 하 고 다음 녹음 0.5-1 µ g의 DNA mRNA 전사 키트 제조업체의 지침에 따라 20 µ L의 전체 볼륨에 8 h 37 ° C에 의해 ( 재료의 표참조).
- 15 분 추가 폴 리 A 꼬리 37 ° C에서 45 분 동안 37 ° C에서 DNA 템플렛을 제거 하 고 제조업체의 지침에 따라 RNA 정화 키트, 여 Cas9 mRNA를 복구 하는 혼합물에 DNase의 1 µ L를 추가 ( 재료의 표참조).
-
SgRNA의 생산
- 고 충실도 DNA 중 합 효소로 위에 T7 발기인에 의해 구동 sgRNA 서식 파일을 생성 합니다. 템플릿으로 벡터를 포함 하는 sgRNA 비 계를 선택 합니다. 사용 하는 뇌관은 표 1에 나열 됩니다.
- T7 sgRNA PCR 제품을 정화 하 고 0.5-1을 사용 하 여 µ g sgRNA 짧은 RNA 전사 키트를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 20 µ L의 전체 볼륨에 6 h를 37 ° C에서의 녹음 방송 생체 외에서 에 대 한 템플릿으로 DNA ( 테이블의 자료를 참조 하십시오 < / c11 >).
- 1 µ L DNase의 혼합물에 추가 하 고 DNA 템플렛을 제거 하려면 15 분 동안 37 ° C에는 부 화를 계속. sgRNAs RNA 정화 키트에 의해 정화 ( 재료의 표참조) 이상으로.
- RNase 무료 물에 500 ng / µ L을 sgRNA를 희석 하 고 최대 3 개월까지 −80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
참고: CRISPR ribonucleoproteins (RNPs)는 더 나은 절단 효율성18,,1920대체 대체 됩니다.
-
배아 컬렉션, microinjection 및 생체 외에서 문화
- 여성 B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) 쥐 (7-8 주 이전) 임신 암 말 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG)에 의해 뒤에 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 48 h 후 superovulate HCG 주사 후 집 여성 B6D2F1 남성과 하룻밤.
- CO2 마 취, hCG 주사 후 24 h에 의해 여성을 희생. M2 매체에서 (30-50 배아 각 여성에 대 한)와 그들의 oviducts에서 수정 된 배아를 수집 합니다.
- 장소 KSOM 중간에 수정 된 배아 (약 300 달걀 1 일 주입에 대 한) (5.55 g/L NaCl, KCl, 0.05 g/L KH2포4, 0.05 g/L MgSO4•7H2O, 0.04 g/L 포도 당, 1.12 g/L 나트륨 0.19 g/L 젖이 나올, 2.1 g/L NaHCO3 , 0.02 g/L 나트륨 pyruvate, 0.25 g/L CaCl2•2H2O, 0.004 g/L EDTA, 0.146 g/L L-글루타민, 및 1 g/L 소 혈 청 알 부 민) 5% CO2배양 기에서 37 ° C에서.
- 혼합 Cas9 mRNA (100 ng / µ L), sgRNA (50 ng / µ L), 그리고 HMEJ 기증자 벡터 (100 ng / µ L), H2O 10 µ L. 최종 볼륨을 조정 하는 얼음에 혼합물을 넣어 추가.
- 모 세관 바늘 (외부 직경 1.0 m m, 내경 필 라 멘 트와 0.78 m m)를 당겨 Micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 (매개 변수: 열, 74, 풀, 60, 속도, 80, 200 시간/지연, 압력, 300. 재료의 표참조). 상업적인 바늘은 microinjection에 대 한 대체 대체 될 것 이다.
- HEPES CZB 매체 포함 하는 5 µ g/mL cytochalasin 상수는 microinjector를 사용 하 여 B의 물방울에 잘 정의 된 pronuclei와 혼합물의 가능성이 볼륨 zygotes의 세포질으로 주입 흐름 설정 (그림 2A) (참조 재료의 표)21.
참고: 각 그룹 zygotes의 주입 한다 20-30 분 내 Cytochalasin B는 주사 후 마우스 zygote의 생존 능력을 증대 시킬 수. 또는, microinjection22위에서 설명한 대로 피에 조 시스템으로 동작할 수 있습니다. - 37 ° C 미만 5% CO2 는 blastocyst까지 형광 관찰 (그림 2B , 2C)에 대 한 일 후 무대에서 KSOM 중간에 삽입 된 zygotes 문화.
-
배아 전송 및 쥐의 생성
- 주입으로 같은 날에 vasectomized ICR 남성 마우스 estrous ICR 여성 쥐를 친구.
- 5% CO2, 그리고 0.5 하루 게시물 coitum (dpc)에서 pseudopregnant ICR 여성의 oviducts로 전송 25-30 2 셀 배아에서 37 ° C에서 2 셀 단계에 주입된 zygotes 문화. 받는 사람 어머니 19.5 dpc에서 새끼를 제공합니다.
-
마우스 유전형
- 제조업체의 지침에 따라 DNA 추출 키트를 사용 하 여 발가락 또는 꼬리 샘플에서 마우스 게놈 DNA를 추출 ( 재료의 표참조).
- 5'과 3' 접합 PCR amplification를 수행 하기 위해 템플릿으로 UV/vis 분 광 분석에 의해 측정 하는 genomic DNA의 200-400 ng를 사용 하 여 노크에서 이벤트를 식별 합니다.
- 5 분 동안 95 ° C에서 DNA 중 합 효소를 활성화 하 고 30 95 ° C에서 38 사이클에 대 한 PCR을 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장으로 1 분 (1 분/1 킬로바이트), 72 ° C. 5' 접합, 노크-조각 (p2A-mCherry)에 반대 한 HAL의 업스트림에서 앞으로 뇌관을 사용 합니다. 3' 접합로 노크-조각 (p2A-mCherry)에 앞으로 뇌관을 사용 하 여 무기 (표 1)의 하류에 반대 하나.
- 1 × 태 버퍼 및 예상된 조각 크기에 대 한 확인에 1 %agarose 젤에 PCR 제품의 6 µ L를 실행 합니다. 다음 DNA 시퀀싱 (그림 2D)으로 그들을 확인 합니다.
3. HMEJ-기반 Vivo에서 게놈 Hepatocytes에서 편집
- 금지 장치에 받는 사람 C57BL/6J 마우스 (8 주)를 배치 하 고 슬릿을 통해 꼬리를 넣어.
- HMEJ 기증자 벡터 (30 µ g)과 spCas9 식 벡터 (30 µ g) 염의 2 개 mL에 혼합. 제어 실험에 대 한 염 (그림 3A)의 2 ml HMEJ 기증자 벡터 (30 µ g)을 일시 중단 합니다.
- 70% 에탄올과 마우스 꼬리를 청소. 삽입 꼬리에 바늘 정 맥 및 플라스 미드 DNA 솔루션 5-7 미에서 주사 바늘을 제거 하 고 억제 장치에서 마우스를 놓습니다.
- 주입 후 5-9 일 후 CO2 마 취에 의해 쥐를 희생. 0.9% 식 염 수와 쥐 transcardially perfuse, 4 %paraformaldehyde 연동 펌프를 사용 하 여 및 4 ° c.에 하룻밤 간 수정
- 하룻밤, 튜브의 바닥에 싱크 될 때까지 30% 자당을 사용 하 여 조직을 탈수.
- 섹션 간 샘플 10 µ m의 두께에 냉동된 조직.
- 0.1 M 인산 버퍼 (PB)에 세 번 섹션 린스와 1 차 항 체로 그들을 품 어: 안티-mCherry 토끼 (5%에 희석 NGS) 4 ° c.에서 하룻밤
- 세 번에 PB, 섹션을 세척 하 고 다음 2 차 항 체로 그들을 품 어: Cy3-AffiniPure 염소-토끼 IgG 궤도 셰이 커에 실 온에서 2 h에 대 한.
- 20 분 동안 DAPI와 섹션 및 형광 관찰 (그림 3B)에 대 한 유리 슬라이드에 글 리세 린과 산 counterstain.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
HMEJ 기반 게놈 마우스 배아에서 편집: 마우스 zygotes에서 노크에 HMEJ 기반 방법의 효율성을 정의 우리 Cas9 mRNA, Cdx2 의 마지막 codon에 p2A mCherry 취재 원 유전자를 융합 설계 되었습니다 sgRNA 마우스 zygotes에 HMEJ 기증자와 Cdx2 유전자를 대상으로 전달 유전자 (그림 2A). 주입 된 zygotes blastocysts 문화에로 발전. 노크에 효율성을 평가 하 우리는 형광 현미경으로 mCherry 형광을 분석 하 고 우리는 HMEJ 기증자를 받는 blastocysts의 12.9%는 trophectoderm에서 엄격 하 게 표현 되었다 mCherry에 대 한 긍정적인 발견 (그림 2B 2 C). PCR 긍정적인 쥐, 시퀀싱에 의해 우리는 또...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
HMEJ 기증자 플라스 미드의 건축에서 가장 중요 한 단계는: (1) 높은 DNA 분열 효율과 낮은 거리 sgRNA 절단 사이트와 정지 codon, 및 (2) 적절 한 건설 HMEJ 기증자의 간의 sgRNA의 선택. CRISPR/Cas9-중재 분열 (sgRNA 대상 사이트와 ~ 800 bp 상 동 팔 포함) 모두 transgene 기증자 벡터에 타겟된 게놈은 효율적이 고 정확한 타겟된 통합에 필요한 vivo에서. HMEJ 기반 방법을 사용 하 여 노크에서 쥐의 세대의 가장 중요 한 단계는: Cas9 mRNA와 sgRNA (Cas9 mRNA와 sgRNA에 존재 하는 아무 변성), 높은 품질의 준비 (1) 및 (2) 높은 품질 HMEJ 기증자 플라스 미드의 준비. 플라스 미드는 배아 발달에 아무 독성 효과 보여줍니다.
최근, NHEJ 기반 방법 또한 효율적인 vivo에서 게놈8편집에 대 한 보고 왔다. 그럼에...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 CAS 전략적 우선 순위 연구 프로그램 (XDB02050007, XDA01010409), 국가 하이테크 R & D 프로그램 (863 프로그램; 2015AA020307), 중국의 국가 자연과학 기초에 의해 지원 되었다 (NSFC 부여 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), 중국 청소년 천 재능 프로그램 (HY), 휴식 프로젝트를 통해 중국 과학 아카데미의, 상하이 시 위원회의 과학 기술 프로젝트 (HY에 16JC1420202), 과학과 기술의 중국 (대부분; 2016YFA0100500).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | EFs promoter AAV_Actb 의해 구동되는 human codon-optimized SpCas9 인코딩을 위한 AAV 벡터 |
| donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | HMEJ Addgene | 97308 | p2A-mCherry 리포터를 마우스 Actb에 융합한 HMEJ 기증자. Actb를 표적으로 하는 EF1a promoter 및 U6 driven sgRNAs에 의해 구동되는 EGFP입니다. AAV 백본. |
| AAV_Cdx2 HMEJ 기증자 | Addgene | 97319 | HMEJ 기증자는 p2A-mCherry 리포터를 마우스 Cdx2에 융합했습니다. |
| Lipofectamine 3000 형질주입 시약 | 생명 기술 | L3000015 | |
| 뉴클레아제가 없는 물 | 생명 기술 | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB 버퍼 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 마스터 믹스 | New England Biolabs | E2621L | |
| 플라스미드 EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러 | 셔터 기기 | P-97 | 마이크로피펫 풀러 (매개변수: 열, 74; 당기기, 60; 속도, 80; 시간/지연, 200; 압력, 300) |
| 붕규산 유리 | 셔터 기기 | B100-78-10 | 모세관 유형 (외경 1.0 mm, 필라멘트 포함 내경 0.78 mm) |
| FemtoJet 마이크로인젝터 | Eppendorf | ||
| 냉동 마이크로톰 | Leica | CM1950-Cryostat | 두께 의 40 &뮤; 엠 에 대한 뇌, 10 &뮤; 엠 에 대한 간 |
| 토끼, 안티-m체리 | , 유전자, Tex, | ||
| Cy3-Affini, 순수 염소, 안티-토끼, IgG | , 잭슨, 면역연구 | ||
| DMEM | Gibco | , 11965092 | |
| FBS, | Gibco | , 10099141 | |
| NEAA, | Gibco | 11140050 | |
| , 스트렙, 글루타민, Gibco | 10378016 | ||
| 겔 추출 키트 | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | 닝보 Sansheng 의학 | S141004 | |
| HCG | 닝보 Sansheng 의학 | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 매체 with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| 미네랄 오일 | 시그마 |
참고문헌
- Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Nakade, S., et al. Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9. Nature Communications. 5, 5560(2014).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841(2015).
- Yao, X., et al. Cas9 - Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBioMedicine. , (2017).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yao, X., et al. Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells. Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).
- Han, D. W., et al. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors. Cell Stem Cell. , (2012).
- Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
- Sparman, M., et al. Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates. Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).
- Schatten, G., Mitalipov, S. Developmental biology: Transgenic primate offspring. Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92(2017).
- Park, K. E., et al. Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins. International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).
- Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Grompe, M., et al. Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice. Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).
- Paulk, N. K., et al. Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo. Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy
Posted by JoVE Editors on 3/10/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Studying TGF-β Signaling and TGF-β-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells. The phrases "surveyor assay" and "Surveyor Nuclease" have been updated to "T7E1 assay" to " T7 endonuclease I" respectively.
Step 1.2 in the Protocol has been updated from:
- Surveyor nuclease assay of sgRNA
NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by surveyor nuclease assay (also known as T7 endonuclease I (T7EI) assay)17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.
to:
- T7 endonuclease assay of sgRNA
NOTE: The targeting efficiency of the sgRNA used for the knock-in experiment is evaluated by T7 endonuclease (T7EI) assay17. Select the sgRNA with high DNA cleavage efficiency and a low distance between the sgRNA cutting site and the stop codon.
Figure 1 in the Representative Results has been updated from:
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for surveyor assay. (C) Surveyor assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for surveyor assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: HMEJ-mediated targeted integration in vitro.
(A) Experimental scheme for selection of sgRNAs: Six different sgRNAs (Cdx2-sgRNA1~Cdx2-sgRNA6) around the stop codon of the Cdx2 locus with a higher rank and off-target potential were chosen based on online CRISPR design tool. The protospacer adjacent motif (PAM) sequence is in red. (B) Experimental design: The Cas9-CMV-GFP expression plasmids expressing sgRNA, Cas9, and GFP were introduced into N2a cells. GFP+ cells were sorted at day 3 for T7EI assay. (C) T7EI assay for Cdx2 targeting: 6 different sgRNAs were designed for T7EI assay. Normal N2a cell genomic DNA serves as control. *, the sgRNA used for Cdx2-2A-mCherry knock-in experiment. (D) Schematic overview of construction of HMEJ donors using Gibson assembly. (E) Schematic overview of HMEJ-mediated gene targeting strategy at Cdx2 locus. HAL/HAR, left/right homology arm; triangles, sgRNA target sites; OF/OR, outer forward/reverse primer; IF/IR, inner forward/reverse primer. Figure modified from previous report10. Please click here to view a larger version of this figure.
