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방법 논문

눈 기구학 생체 외에서 거북이에 두개골 신경의 자극에 의해 측정

7.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56864

⸱

2018년 6월 2일

 ,  ,  , 
1Department of Biology and Neuroscience Program, Lafayette College, 2Department of Information Technology, Computer Science, and Digital Media, Juniata College

이 논문에서

요약

이 프로토콜에는 그들의 눈 운동의 운동학을 측정 하는 체 외에서 고립 된 거북이 머리 준비를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 두개골에서 뇌의 제거 후, 두개골 신경 척도 회전 눈의 동 공 크기에 변화를 전류로 자극 수 있습니다.

초록

동물 안락사는 후 그들의 조직 죽을 시작 합니다. 거북 특히 온 혈 척추 동물에 비교 될 때 그들의 조직의 더 긴 생존 시간 때문에 이점을 제공 합니다. 이 때문에, 신경 신호를 조사 하는 시간의 연장된 기간 및 그들의 대상 작업의 제어에 대 한 거북에 생체 외에서 실험을 수행할 수 있습니다. 고립 된 머리 준비를 사용 하 여, 거북, 눈 운동의 운동학 측정 그리고 전기 신호에 의해 그들의 변조 두개골 신경에 의해 수행. 두뇌는 두개골에서 제거 되었다, 후 그대로 두개골 신경, 해 부 머리에에서 배치 했다 안구의 움직임을 보정 하려면 짐 벌. 유리 전극은 두개골 신경에 연결 된 (oculomotor, trochlear, 그리고 abducens) 안구의 움직임을 연상 하는 전류와 자극. 우리는 적외선 비디오 추적 시스템 및 눈의 계량된 회전 안구의 움직임을 모니터링. 전류 펄스의 진폭, 주파수, 범위 그리고 기차 기간 응답에 미치는 영향을 관찰 하는 데 사용 했다. 준비는 뇌에서 분리 하기 때문에 근육 대상에가 하는 원심 성 통로 중앙 처리 감각 정보의 부재에서 신경 신호를 조사 하는 절연에서 시험 수 있다.

서론

빨간 귀 슬라이더 거북 Electrophysiological 실험에 사용 하기 위한 근거:

빨간 귀 슬라이더 거북 (Trachemys scripta 선 충), 세계 최악의 침략 종1 중 하나 간주 됩니다 하 고 생태계 문제 임을 나타낼 수 있습니다. 왜 빨간 귀 슬라이더 거북은 그래서 성공 하는 이유는 제대로 이해 하지만 일부 했기 때문일 수도 있습니다 그들의 관용 생리학과 신경 조직의 hypoxic 조건2,3,4에서 살아남을 수 있는 소유 물 . 실험 그들의 숫자를 위협 하지 않습니다에 대 한 최소한의 노력으로 electrophysiological 준비 남아 있을 수 있는 실행 가능한 만큼 18 시간5,6연장된 기간 동안 그들을 사용 합니다. 혜택 또한 산소8의 낮은 레벨을 견딜 수 있는 대7, 같은 무척 추 동물 동물을 사용 하는 장점은 비슷합니다.

안구의 움직임을 측정 하기 위한 기법.

정면 eyed 동물 비 인간 영장류를 사용 하 여 안구의 움직임을 측정 하는 방법 잘 개발 된9되었습니다. 눈 회전 궤도 있는 3 개의 축: 수평, 수직, 및 비틀림. 마그네틱 검색 코일 방법 일반적으로 측정 회전에 대 한 가장 신뢰할 수 있는 것으로 간주 하지만 침략, 동물10,11의 scleras에 삽입 하려면 작은 코일을 요구. 비디오 기반 시스템도 수 측정 회전 하 고 비-침략 적 되 고의 이점이 있다. 혁신적인 이미지 처리 함께 더 나은 카메라의 개발 비디오 기반 시스템12,,1314를 고려 하는 매력적인 대안을 만드는 그들의 기능을 강화 했습니다.

Nonmammals에서 안구의 움직임을 측정 하기 위한 개발 기술을 훨씬 덜 중요 한 되었습니다. 측정 중 낮은 해상도 또는 회전15,16,,1718의 일부 설명. 개발의 부족 시각적 대상에 따라 훈련 nonmammals에 어려움에 부분적으로 비난 받을 수 있다. 비록 눈 움직임 잘 빨간 귀 슬라이더 거북19,20,21,22,23,,2425 에서 연구 26,,2728,29,30, 대상 추적 훈련 동물에서 도전 때문에 그들의 눈 움직임의 정확한 운동학은 저조한 이해.

빨간 귀 슬라이더 거북은 일반적으로 척추 옆 눈 간주 됩니다 하지만 그들은 완전히 그들의 셸31에 그들의 머리를 철회 수, 때문에 등 딱지에 의해 측면 시각 필드의 중요 한 폐색 발생32. 결과 그들의 시각 가시 더 정면 눈 포유류 처럼 행동 그들 앞쪽 강제로. 따라서, 안구의 움직임을 측정 하기 위한 접근 방법을 개발 하기 위한 모델 사용은 또한 독특한 진화 관점을 제공 합니다.

이 작품에서 설명 하는 프로토콜 빨간 귀 슬라이더 거북의 눈 운동의 운동학을 식별 하는 생체 외에서 고립 된 머리 준비를 사용 합니다. 두뇌는 두개골 신경 그대로 두개골에서 해 부. 머리는 눈 근육 innervating 두개골 신경의 전기 자극에 의해 안구의 움직임을 보정 하 여 반응을 짐 벌에 배치 됩니다. 조치는 눈에 의해 회전의 어두운 눈동자와 아이리스의 표시를 추적 하는 소프트웨어 알고리즘을 사용 하는 비디오 기반 시스템에 의해 수행 됩니다. 운동학 extraocular 모두 (즉, 수평, 수직, 및 비틀림 회전)을 측정 하 기회를 제공 하는 준비32 및 안 구내 (즉, 눈동자 변화)33 움직임.

원심 성 신경 경로의 분석을 위한 모델 시스템:

접근 기회 공부 어떻게 원심 성 신경 신호를 생성 눈 움직임 근육 뇌32에 의해 처리 된 통합 감각 정보의 부재와 그들의 편안한 상태에서 시작 하는 조사를 제공 하는 더 일반적으로, 33. 따라서, 눈 운동학 있는 그들은 전적으로 원심 성 신경 통로 떠나 뇌와 근육에 synapsing에 의해 처리 되는 모델 시스템에서 시험 될 수 있다.

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프로토콜

참고: 빨간 귀 슬라이더 거북, 둘 다 남성과 여성, 공급 업체 로부터 구입 했다. 거북이 따뜻한 동물 제품군 250 W 적외선 조명 아래 sunning 벽돌 제도 완비 두 60 갤런 통에에서 보관 되어 있었다. 환경 물 온도 22 ° c.에 14/10-h 명암 주기 유지 되었다 조명 오전 6시 켜져 있었고 오후 8시. 필터링 시스템 갖춘 탱크 매주 청소 했다 그리고 거북이 매일 광고 libitum 지 루 했다. 빨간 귀 슬라이더의 거북 그리고 다음 실험 절차 설명된 여기32,33 의 모든 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 라파예트 대학에 의해 승인 했다.

1. 장비 설치

  1. 터틀 벨의 솔루션을 준비 합니다. 이 순서 대로 증류수에 다음을 추가: 염화 나트륨 96.5 m m (58.44 g/mol), 2.6 m m (74.56 g/mol), 염화 칼륨 염화 마그네슘 2.0 m m (203.31 g/mol), 나트륨 중 탄산염 31.5 m m (84.01 g/mol), 포도 당 20.0 mM (180.16 g/mol), 집중 7.51, 및 염화 칼슘 4.0 m m (110.98 g/mol)에 pH를 조정 하는 염 산 ( 재료의 표참조). 각 솔트를 추가 하는 동안 솔루션을 믹스.
    주의: 집중된 HCl은 위험한 (피부, 눈, 흡입 및 섭취 위험).
  2. 5 cm 긴 모 세관에서 흡입 전극에 대 한 팁을 확인 하기 위해 다양 한 두께의 두개골 신경 내부 직경의 다른 크기에 화재 연마 하 여 ( 재료의 표참조)을 유리.
    1. 작은 파일을 사용 하 여 모 세관 유리의 조각에 걸쳐 선 엣지. 티슈 페이퍼에 놓고 반으로 휴식.
    2. 롤 천천히 분 젠 버너의 불꽃으로 유리 모 세관의 끝 중 하나를. 크기, 부드럽게, 그리고는 해 부를 사용 하 여 대칭에 대 한 팁을 주기적으로 검사 범위와 섬유 광섬유 빛 소스 ( 재료의 표참조).
      참고: 20 그리고 30 밀리미터 사이 머리 폭 거북이, 최적의 피팅 내경 크기 일반적으로 0.4 oculomotor 신경 (nIII), 0.8 m m에 이르기까지 trochlear 신경 (nIV), 0.3에서 0.6 m m와 0.2에서 0.4 m m abducens 신경 (nVI)에 대 한.
  3. 깨끗 하 고 정리 Rongeurs, 무딘 해 부 조사, microscissors, 괜 찮 아 요 집게, 곡선된 겸 자, 그리고 메스 핸들 블레이드 ( 재료의 표참조) 해 부.
    참고: 살 균 계기의 선택 사항입니다.

2. 마 취와 안락사

  1. 장소는 얼음에 거북이 양동이 cryoanesthetize 60 분 그것.
  2. 잘린 작은 동물 단두대를 사용 하 여 거북이 안락사 ( 재료의 표참조).
    1. 부드럽게 놀 리 려는 동물의 턱 작은 무게 주걱으로 후크를 삽입 하 고 위 턱의 끝 아래에 맞게 설정 수 있습니다.
    2. 단두대를 통해 동물의 머리를 연장 하는 꾸준한 압력 당겨. 신속 하 게 동물을 목을 벨.
  3. 거북이 머리를 해 부 접시에 놓습니다. 한편 관개 조직에 충분 한 거북이 벨의 해결책이. Oxygenize 95/5 O2/CO2 솔루션 ( 재료의 표참조).
  4. 얼음 접시의 외부 주위에 배치 하 여 4 ° C에서 조직을 유지 합니다.

3입니다. 해 부

  1. 섬유 광섬유 광원 절 개 범위를 사용 하 여 해 부를 수행.
  2. 아래 턱을 제거 합니다. 머리의 쉽게 처리를 제공할 것 입 통해 무딘 해 부 프로브를 배치 합니다. 메스와 두개골에 dentary 뼈 연결 관절을 잘라. 아래 턱은 두개골에서 뽑아 rongeurs를 사용 합니다. Rongeurs를 사용 하 여 두개골의 등 쪽과 측면 지역에서 피부와 근육이 그들의 첨부 파일에서 해 내.
  3. 척추 열을 제거 합니다.
    1. 두개골의 꼬리 끝에 척추 열을 식별 합니다. 척수를 ventrally 척추 열을 구 부. Microscissors를 사용 하 여 척수를 싹 둑. Rongeurs를 사용 하 여 caudally 당겨는 두개골에서 다른 조직과 척추 열을 제거 하.
  4. 두개골 신경 절단 후는 두개골에서 뇌를 제거 합니다.
    1. 구멍 매그넘에서 시작, 등 두개골에 두 개의 절 개를 잘라 rongeurs를 사용해. 상처 표면 아래 뇌의 손상을 방지 하려면 확인 합니다.
    2. Rongeurs를 사용 하 여 조심 스럽게 등 두개골 해 내. Microscissors를 사용 하 여 두뇌의 나머지 부분을 노출 meninx 제거. 후 각 전구 앞쪽 두개골 구멍에서 확인할 수 있습니다 때까지 충분 한 meninx 제거 ( 그림 1A참조). 터틀 벨의 솔루션을 필요에 따라 뇌를 관개를 계속 합니다.
    3. 굽은 집게를 사용 하 여 부드럽게 뇌 caudally 고 두개골 신경에 약간의 긴장을 생산. 신중 하 게 멀리 잘라 고 곡선된 겸 자와 후 각 전구 및 뇌를 제거 합니다.
    4. Microscissors를 사용 하 여 부드럽게 midbrain 두개골 신경; 폭로 중간 선 쪽으로 밀어 nIII, 약 0.6 m m, 이니라, 앞에서 볼 수 있다 그리고 직경 이니라의 약간 nIII 보다는 더 적은 있을 것입니다. 그들은 midbrain 연결할 이니라 nIII을 잘라 ( 그림 1B를 참조). 다른 측면에서이 반복 합니다.
    5. 왼쪽 및 오른쪽 시 신경 (nII)와 microscissors 잘라. 그런 다음 한쪽 brainstem 기울기. NVI는 폰 스 및 모 수의 교차점 근처 복 부 표면에서 신흥 관찰 ( 그림 1C참조). nVI의 직경은 작은 고 약 0.3 m m. 잘라내기 모두 왼쪽과 오른쪽 nVI.
    6. 좋은 집게와 microscissors 거북이에서 brainstem의 나머지 부분을 제거 합니다. 일단은 두개골에 두개골 구멍 바닥을 검사 합니다. NIII, nIV, 및 nVI를 식별 합니다.
  5. 위와 더 낮은 눈-뚜껑 미세 집게와 microscissors를 제거 합니다.

4입니다. 눈 움직임의 교정

  1. 딱딱한 테이블을 사용 하 여 ( 재료의 표참조)는 짐 벌 및 다른 계기의 배치를 지원 하기 위해. 머리의 등 쪽 표면 두개골에 걸쳐 작은 거품 수준 휴식을 사용 하 여 수평선에 평행 되도록 짐 벌 척으로 거북이 머리를 놓습니다. 대략 눈 중 하나을 짐 벌의 수평 및 수직 회전의 중심에 위치.
  2. 적외선 카메라는 적외선 발광 다이오드 (LED), 비디오 기반 눈 추적 시스템의 일부인 장착 장소 ( 테이블의 자료를 참조), 거북의 눈에서 약 12 cm의 보기 거리에.
    1. 카메라 눈의 시력의 라인 위에 45도 각도. 카메라 렌즈를 보면 LED 11 시 위치에 있어야 합니다. 눈의 광 축 센터 LED. 카메라는 (로 눈 위에서 본) 축에서 약간 있을 것입니다.
    2. 안구에 의해 극대로 채워진 카메라 보기는 눈에서 카메라의 거리를 조정 합니다. 가로 보기의 가장자리에 눈 (canthi)의 모서리를 확인 합니다.
  3. 추적 데이터를 처리 하는 시스템 비디오 기반 눈에 카메라를 연결 합니다. 원시 비디오를 캡처할 DVD 레코더에 신호를 분할. 눈의 깨끗 한 이미지를 카메라의 초점을 맞춥니다. 벌금-위치 (x, y, z) 선형 조정의 3도 사용 하 여 카메라 보기의 중심에 아이 짐 벌 제공 주의.
  4. 임계값 및 비디오 기반 눈 추적 시스템으로 제공 하는 프로그램을 사용 하 여 적절 하 게 대비를 설정 하 여 어두운 눈동자를 감지 합니다.
    1. 마우스를 사용 하 여 "비디오" 메뉴에서 클릭 하 고 "모드"에서 "높은 정밀도" 30 Hz (640 픽셀 x 480 라인의 해상도)의 샘플링 레이트에서 이미지를 선택. 또한 "비디오"에서 "학생 세분화 하는 방법"에 대 한 "눈동자 유형" 및 "타원 (회전된 타원)"에 대 한 "어두운 눈동자"를 선택 합니다.
    2. "EyeCamera" 창에서 "학생 검색 영역 조정" 아이콘 (가운데에 점이 작은 수직 사각형)를 클릭 합니다. 눈동자 주위 영역을 제한 하는 사각형 밖으로 드래그 하는 마우스를 사용 합니다. 눈동자와 혼동 될 수 있는 어두운 부분을 하지 마십시오.
    3. "컨트롤" 창에서 "자동 이미지"와 "긍정적인 잠금 임계값-추적" 상자 검사 됩니다 확인 합니다. "자동-임계값" 스캔의 밀도 최적화 하는 어두운 눈동자 녹색 점으로 표시 됩니다를 클릭 하십시오.
  5. 비디오 기반 눈 추적 프로그램 짐 벌 (+) 12.5 °의 회전을 수평 축을 중심 수직 축 중심 (+) 10 °의 비디오 디스플레이 보정.
    1. "컨트롤" 창에서 "디스플레이"를 클릭 합니다. "시선", "Calib 지역", 및 "기 표"에 대 한 "시선" 및 "Stim" 확인란. "기 표" 아래의 박스를 체크 후 창이 팝업 되며 말, "자극 디스플레이 형상을 해야 합니다 측정 전에 형상 그리드 표시 될 수 있습니다. 하 시겠습니까 지금 이렇게 "? 대 한 예 "Y"를 선택 합니다.
    2. 마우스를 사용 하 여 "창" 메뉴에서 클릭 하 고 "자극"을 선택 합니다. "자극" 창이 디스플레이의 중심에 수직 및 수평 교차점을 보여주는 열립니다. "자극" 윈도우를 종료 하려면 키보드에 가까운 m m. 보도 "Esc" 라인의 길이 측정 합니다.
    3. 마우스를 사용 하 여 "자극" 메뉴에서 클릭 하 고 "형상을 설치"를 선택 합니다. 그냥 측정 하는 줄의 길이 입력 합니다. 도/라인 25 ° 수평 라인 및 20 ° 수직 라인에 대 한 동등한 시 거리를 조정 합니다. "저장" 버튼 클릭 하 고 창을 닫습니다.
    4. "EyeSpace" 창에서 교정 "9"를 "데이터 요소"로 선택 합니다. 거북이 눈 중앙에 위치, 클릭 센터 데이터 가리키고 "다시 제시" 버튼을 클릭 합니다.
      참고: "자극" 창이 나타납니다, 그리고 "준비" 화면 중앙에 표시 됩니다. 상자 중심 위치에 표시 되며 다음 사라집니다. 그것의 실종에 "자극" 창이 닫힙니다. 센터 위치 이제 보정 한다.
    5. 수평 유지 장치가 문제인 오른쪽/왼쪽, 12.5 ° /-12.5 °, 회전 및 업/다운 + 10 ° /-10 ° 나머지 데이터 요소를 보정 하는 절차를 반복 합니다.
  6. 비틀림 회전 보정, 피팅 알고리즘 프로그램 추적 비디오 기반 아이 함께 제공 된 템플릿을 사용 합니다. 알고리즘의 표시에 따라 제로 위치를 설정 하 고 표시는 눈동자의 중심에서 상쇄 될 때 회전의 각도 계산.
    1. 마우스 포인터를 사용 하 여 "창" 메뉴에서 클릭 하 고 "염력"를 선택 합니다. "염력" 창에서 "시작" 버튼을 클릭 합니다. "EyeCamera" 창 호 눈의 이미지 위에 나타납니다.
    2. 반경, 각도, 그리고 불규칙 한 표 하기는 조리개에 존재 하는 위치에 있는 슬라이더를 사용 하 여 아크의 길이 조정 합니다. "실시간 그래픽"과 "후 자동 설정 조정"에 대 한 확인란을 선택. 필요한 경우 밝기를 조정 하 고 컨트롤 창에 다시 임계값 어두운 눈동자 대조 (4 단계 참조). "설정 서식 파일" 버튼을 클릭 합니다.
  7. 눈동자와 같은 초점 평면에 통치자를 놓고 전체 카메라 보기의 너비를 기록 합니다. 눈동자의 실제 너비를 결정 하는 값 나중 사용 됩니다.

5. 안구의 움직임을 연상 두개골 신경에 흡입 전극의 위치

  1. 신중 하 게 머리에 남아 있는 결합 또는 근육 조직으로 핀 참조 전극 장소.
  2. 흡입 전극 배치 ( 재료의 표참조) 두개골 신경에 호황에 탑재 micromanipulator 및 절 개 범위를 사용 하 여. 섬유 광섬유 광원을 사용 하 여 확인 하 고 위치 안내.
    1. 유리 모 세관 팁에 신경의 크기와 일치. 시행 착오는 최적 신경의 직경 주위를 얻기 위해 필요한 (크기 권장 사항에 대 한 1.2 단계 참조). 흡입 전극에 유리 팁을 놓습니다. 흡입 전극 벨의 솔루션 작성 및 약 주사기 내 볼륨을 조정 용량의 절반.
    2. 신중 하 게 선택 된 신경의 절단 끝 위에 위치 하는 micromanipulator를 사용 하 여 전극의 유리 팁을 이동 합니다. 벨의 솔루션 채우고는 두개골 표면 아래 팁은 확인 합니다. 필요한 경우 모델링 점토를 사용 하 여 위치 벨의 솔루션은 두개골 밖으로 새는 댐.
    3. 다시 주사기의 플런저를 당겨.
      참고: 진공 모 세관 팁의 끝에 신경을 그릴 것입니다. 잘 맞는 거의 비슷하게 추가 진공 적용 팁 내 남아 있는 신경으로 표시 됩니다.

6. 자극의 두개골 신경 및 눈 운동의 분석

  1. 범용 신경/근육 자극 기를 사용 하 여 현재 격리 장치 ( 재료의 표참조) 흡입 전극을 통해 뇌신경을 자극 하.
    1. 흡입 전극 케이블을 사용 하 여 현재 격리 장치에 연결 합니다. 절연 장치의 접지 연결에 핀 참조 전극에서 리드를 연결 합니다.
    2. 선택 매개 변수는 다이얼을 사용 하 여 전류 자극 기 및 절연 장치에 전환 하 고. 1에서 100 µ A 전류 범위를 사용 하 여 10 400 Hz. 1 또는 2 ms 사용 열차 100, 500 또는 1000 ms 지속에 펄스의 주파수.
  2. Stimulations의 타이밍을 기록 합니다.
    참고: 트랜지스터-트랜지스터 논리 (TTL) 펄스는 자극에서 해류의 배달와 동기화와 통신 케이블 비디오 기반 눈 추적 시스템의 입력된 채널을 통해 실시간으로. 비디오 기반 안구 추적 프로그램 제어 통신 소프트웨어 모듈 제공.
    1. 현재 응용 프로그램 및 눈 움직임에 그들 영향의 타이밍을 시각화 하려면 "PenPlots" 메뉴를 클릭 합니다. 선택 "X 시선 위치", "Y 시선 위치", "염력"와 "눈동자 너비" X 및 Y 위치, 비틀림, 및 학생 폭을 눈에 대 한 실시간으로 원시 데이터 플롯을 표시. 또한 타이밍 음모 1 s 간격에 표시 되는 눈금 표시를 표시 하려면 "PenPlots" 메뉴에서 "초 & 마커"를 선택 합니다.
      참고: 대문자 "T" TTL 펄스, 동시에 발생 하는 현재 응용 프로그램의 개시를 표시 나타납니다.
    2. 전류에 의해 갖는 눈 움직임의 데이터를 저장 하려면 "파일" 메뉴에서 클릭 하 고 "데이터" 아래 "새 데이터 파일"을 선택 합니다. 파일 이름을 입력 하 고 "Enter" 키를 누릅니다. 저장 데이터는 일시 중지 될 수 있습니다 하 고 키 명령, "Ctrl" + "p"의 조합을 사용 하 여 다시 시작. 실험적인 세션이 완료 되 면 "데이터" 아래에서 "파일" 메뉴에서 "닫기 데이터 파일"을 선택 합니다.
    3. 적용의 종류의 추적을 유지 하기 위해, "창" 메뉴에서 클릭 하 고 "데이터 패드"를 선택 합니다. "키패드/DataMarker" 창이 나타납니다. 편지 또는 신경에 전달 되 고 현재 stimulations의 매개 변수를 식별 하는 번호를 클릭 하십시오.
      참고: 예를 들어, "X" 수 서 10 µ A. 클릭 "X"에 특별 게시물 분석을 위한 실시간으로 데이터 파일에 항목을 저장. 그것은 지속적인 관찰에 대 한 "초 & 마커"에 대 한 "PenPlot"에 나타납니다.
  3. 눈 추적 시스템에서 데이터를 분석 합니다.
    1. 데이터를 정리 하 고 통계 분석을 수행 하는 선택의 스프레드 시트 프로그램으로 구분 된 텍스트 형식에 있는 저장 된 데이터 파일을 엽니다.
      1. Mm에서 실제 크기를 파일에 저장 된 눈동자 너비 값을 변환 합니다.
      2. X의 값을 변환 및 Y 위치와 정도의 단위에 torsions 눈 및 눈 움직임;을 설명 하기 위한 규칙을 사용 하 여 따라서, 회전의 긍정적인 방향: intorsion, 고도, 고 예증; 그리고 부정적인 회전의 방향: extorsion, 우울증, 그리고 납치.
    2. 헤더 정보를 새 워크시트에 복사 합니다. 이 화면 크기 (폭 및 높이)와 시 거리에 대 한 값을 포함 됩니다. 30 Hz의 속도로 수집 된 데이터의 8 열 머리글 정보 아래 따를 것 이다.
    3. 다시 원시 데이터가 포함 된 워크시트를 이동 합니다. "T", 현재 자극의 시작을 표시의 찾기 발생률 자극 10 µ A. 적용 된 찾을 "마커" 라는 마지막 열에 "X"에 대 한 "찾기"를 할. 15 행 복사 (0.5 s) 후에 "T" "T"와 90 프레임 전에 발생 하는 데이터 (3.0 s); 즉, 3.5 s 총입니다. 머리글 정보 아래 새 워크시트에 데이터를 붙여 넣습니다.
    4. "PupilWidth" 다음 빈 열을 삽입 합니다. 빈 열에서 mm에서 보정된 치수 변환:
      수평 눈동자 직경 = "PupilWidth" × 카메라 보기 폭의 치수
    5. "X_Gaze"와 "Y_Gaze" 다음 2 빈 열을 삽입 합니다. 위치 보기 스크린의 크기를 표준화: 좌표 (0, 0) 상단에 왼쪽에 화면 확장 (1, 1) 오른쪽 하단에. 첫 번째 빈 열에 데 좌표계 위치 변환 (0, 0)는 스크린의 센터에서. 스크린의 크기를 변환 m m에 포함:
      X = (0.5 × 폭)-("X_Gaze" × 폭); Y = (0.5 × 높이)-("Y_Gaze" × 높이)
      참고: 왼쪽된 눈에 대 한 작업의 시퀀스가입니다. 순서는 오른쪽 눈에 대 한 납치에 대 한 부정과 예증에 대 한 양성의 규칙에 따라 위해 되돌릴 수 필요 합니다.
    6. 두 번째 열에서 삼각 함수를 사용 하 여 회전의 각도 (°)로 변환:
      수평 회전 = arctan (X/viewing 거리); 수직 회전 = arctan (Y/viewing 거리)
    7. 비틀림 각도의 단위로 이미 표시 됩니다 하지만 왼쪽된 눈에 이루어집니다 측정 하는 경우에 intorsion에 대 한 양성의 규칙을 준수, 곱합니다-1. 오른쪽 눈에 대 한 아무 곱셈은 필요 합니다. 프로그램 코드 긍정적으로 시계 방향으로 회전 합니다.
    8. 시간의 기능으로 눈동자 직경 및 회전을 플롯 합니다.

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결과

그림 1 에서는 해 부를 설명 하는 비디오에서 촬영 한 이미지의 스틸. 이미지는 두뇌에서 절단 전에 신경의 일반적인 위치를 제공합니다.

figure-results-1
그림 1: 시 신경 (nII), oculomotor 신경 (nIII), trochlear 신경 (nIV), 및 abducens 신경 (nVI)의 위치를 표시 해 부 비디오에서 캡처한 이미지의 스틸. (A) 이미지는 meninx의 제거 후 뇌의 레이블이 지정 된 영역. 규모를 화이트 바 = 10 m m. (B) 이미지 쇼 위치 nII, nII...

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토론

중요 한 단계:

이 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 다음과 같습니다: 1) 해 부와 transected 신경;의 생존 능력을 유지 하 게 하는 치료 2)과 일치 하는 크기의 두개골 신경 하 일관 된;에 흡입 전극 그리고 3) 눈의 회전의 적절 한 보정을 제공 하는 짐 벌에 머리의 배치.

문제 해결:

해 부도 전하실 수 있습니다, 하지만 그것에 게 몇 번을 완료 단계는 상대적으로 곧장 앞으로 될 것. 신경 응답 하지 않는 경우, 가장 큰 원인은 해 부의 실패 이다. 두뇌의 제거 하는 동안 최소한의 긴장과 압력 적용 되어야 한다 신경에 그들의 절단 하는 동안. 금속 수술 도구와 신경을 건드리지도 피해 야 한다 가능한 만큼, 그리고 그래서 유리 후크 및 플라스틱 집게 대체할 수 있는 금속 도구에 대 한 문제가 계속34. 비록 거북이 조직 산소의 사용의 가...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 기술 지원에 대 한 부인 Paulette 멕 케 나 및 비서 지원에 대 한이 연구에서 리사 Pezzino 씨 필 Auerbach을 감사합니다. 저자는 또한 우리 체 외에서 고립 된 머리 준비를 도입에 대 한 박사 마이클 아리엘과 마이클 S. 존스 (세인트 루이스 대학의 학부) 감사 합니다. 이 협력의 지원에 대 한 자금 학과 생물학 (로버트 S. 체이스 펀드), 학술 연구 위원회 그리고 라파예트 대학 신경 과학 프로그램에 의해 제공 했다. 마지막으로,이 작품은에 전념 씨 필 Auerbach, 28 9 월 2016; 돌아가 그는 스캐닝 전자 현미경을 해제 하 고이 프로토콜에 사용 하기 위해 그것의 5 축 단계의 유용성을 인식. 그의 우정과 지 략 크게 그리울 것 이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
붉은귀슬라이더거북Kons ScientificTrachemys scripta elegansL사이즈(갑각 길이 15-20cm)
염화나트륨Sigma-Aldrich Co., LLC.S5886
염화칼륨Sigma-Aldrich Co. LLC.P5405
마그네슘 합지Sigma-Aldrich Co. LLC.M7304
중탄산나트륨시그마-알드리치 주식회사 LLC.S5761
포도당시그마-알드리치 주식회사C5767
농축 염산Sigma-Aldrich Co. LLC.H7020
염화칼슘Sigma-Aldrich Co. LLC.C7902
pH 측정기OaktonpH 6+
흡입 자극 전극AM 시스템573000양극성 흡입 전극. 573000은 573050으로 대체되었습니다.
모세관 유리A-M 시스템626000마이크로 필라멘트가 없는 단일 배럴 붕규산 모세관 유리, 길이 10cm, 외경 1.0mm, 내경 0.50mm
대체 흡입 자극 전극AM 시스템573050양극 흡입 전극. 더 큰 직경의 모세관 유리 필요: 627000, 외경 1.2 mm, 내경 0.68 mm
스테레오스코프LiecaGZ7배율 범위, 10x – 70x
광섬유 광원AmscopeHL250-A150W 광섬유 현미경 조명기 라이트 박스
RongeursCarolina Biological Supply Company625654스테인리스 스틸, 직선 스프링, 5.25"
무딘 해부 프로브Carolina Biological Supply Company627405Huber mall 프로브, 양단 프로브 및 시커, 6 "
MicroscissorsCarolina Biological Supply Company623555아이리스 미세 해부 가위, 스테인리스 스틸, 0.5 "블레이드, 4.75 인치
길이 미세 집게Sigma-Aldrich Co. LLC.F6521보석상 집게, dumont No. 5, inox 합금, 4.25"
곡선 집게Sigma-Aldrich Co. LLC.Z168696미디엄 팁, 곡선 집게, 스테인리스 스틸, 4인치
메스 핸들Sigma-Aldrich Co. LLC.S2896메스 손잡이, 3번, 스테인리스 메
스 칼날Sigma-Aldrich Co. LLC.S2771메스 날, No. 11, 강철
단두대Harvard Apparatus73-1918Kleine 단두대 유형 7575
주걱시그마Z648299마이크로 스푼 및 주걱 계량 세트. 작은 주걱 사용: 5.9" 길이 x 0.07 인치 정사각형 끝이있는 직경 핸들 : 0.17 " x 1.3인치 긴, 다른 쪽 끝 라운드 : 0.17 " x 1.27인치 롱
훅Autozone98069SureBilt 훅 및 픽 세트. 그라인더를 사용하여 갈고리의 날카로운 끝을 무디게 하여 동물의 입이 다치는 것을 방지하십시오.
95/5% O2/CO2Airgas, Inc.X02OX95C20031025% 이산화탄소 밸런스 산소 인증 표준 가스 혼합물, 크기 200 실린더, CGA-296
레귤레이터Airgas, Inc.Y11244D296-AG1단 황동 0-100psi 분석 실린더 레귤레이터 CGA-296(니들 배출구 포함). 황동 조절 가능한 항공사 파이프 밸브를 사용하여 레귤레이터에 연결된 3/8", 내경, 비닐 항공사 튜브에서 3/16", 내경, 에어스톤 또는 유리 파스퇴르 피펫으로 가는 항공사 연결로 이동합니다.
조절 가능한 항공사 파이프 밸브Doctors Foster and SmithCD-12061황동 밸브
강성 테이블알 수 없음수 없음견고한 테이블 위에 놓인 자동 클레이브 도어. 9개의 5인치 직경 테니스 공은 테이블 상단 표면에서 진동을 차단합니다.
5인치 테니스 공Petco Animal Supplies, Inc.712868Petco Jumbo Pet Tennis Ball: 공은 슬라이스되지 않고 오토클레이브 도어 아래쪽 부분의 통합 프레임 내에 고정됩니다.
대체 방진 테이블Newport CorporationINT1-36-6-N강성 진동 제어 시스템, 무결성 1: 표면 치수, 3' x 6'
짐벌ISI, International Scientific Instruments, Inc.SUPER III-A 스캐닝 EM5축 유센트릭 스테이지의 스테이지: X, Y, Z 선형 이동, ± 20mm, 0.1mm 정밀도; 회전, 수직, ± 10° 및 수평, ± 12.5°, 1.25° 정밀. 참고: 폐기 기기에서.
짐벌용 척Unknown제조되지 않은 오래된 마이크로톰의 Chuck은 스캐닝 EM 스테이지
Alternative gimbalThorLabs, Inc.나비 나사 조절기(MBT602/M)가 있는 3축 마이크로블록 스테이지에 장착된 MBT602/M이 있는 GN2/M: 고니오미터 상단 표면에서 12.7mm 위에 눈으로 거북이 머리를 고정하는 척 설계(회전 지점까지의 거리)비디오
기반 시선 추적 시스템Arrington Research, Inc.ViewPoint EyeTracker, PC-60추적 방법: 어두운 동공에 의한 적외선 비디오; 흑백 카메라 (항목 BC02) : 30Hz, 640 x 480; 시스템 요구 사항: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; 가시 범위: 수평한 +/- 44°C; 수직 +/- 20°C;; 정확도 ~0.5°; 공간 해상도 ~0.15°; 동공 크기 해상도 ~0.03mm; 눈 데이터: X, Y의 시선 위치, 동공 높이 및 너비, 비틀림, 델타 시간, 총 시간 및 관심 영역(ROI); 실시간 통신(항목 0022): 데이터 파일에 코드를 표시하기 위한 8개의 TTL 입력 채널이 있는 4채널 아날로그출력
다중 위치 마그네틱베이스Harbour Freight ToolsPittsburg, 항목 #5645마그네틱 홀더는 최대 12인치에 도달하고 45파운드의 마그네틱 풀을 생성합니다. 카메라를 배치하는 데 사용합니다. 막대 끝에 구멍을 뚫어 카메라를 장착합니다.
MicromanipulatorKopf900흡입 전극 장착을 위한 5축 조작: X, Y, Z 선형 이동, 2축 회전
붐의 해부 범위LiecaGZ6배율 범위, 6.7x – 40x
신경/근육 자극기Astro-Med Grass TelefactorGrass S88듀얼 펄스 전압 자극기: 독립적으로 작동하거나 동기화하여 비절연 정전압 펄스(10mV - 150V)를 생성할 수 있는 2개의 출력 채널입니다. 펄스는 단일(10 μ 초에서 10초), 반복(0.01Hz에서 1KHz) 및 기차(1ms에서 10초) 및 TTL 입력 및 출력과 동기화됩니다. DB25 커넥터의 출력 채널을 통해 TTL 출력을 ViewPoint EyeTracker의 TTL 입력 채널로 보냅니다. 참고: Astro-Med Grass Telefactor는 더 이상 영업하지 않습니다.
전류 절연 장치Astro-Med Grass TelefactorPSIU6전류 자극 절연 장치: S88에 의한 정전류를 제제에 안전하게 전달할 수 있습니다. PSIU6은 BNC 케이블을 통해 S88의 출력 채널 중 하나에 연결합니다. PSIU6의 승수 스위치를 통해 S88은 0.1 & 마이크로에 이르는 다양한 전류 진폭을 생성할 수 있습니다. A에서 15mA까지.
절연 기능이 있는 대체 신경/근육 자극기AM Systems2100절연 펄스 자극기: 장치에는 일정한 전류를 생성하는 절연 장치가 내장되어 있습니다.
알 의 표본 홀더 샤프트에 맞게 가공되었습니다.

참고문헌

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